Name: Geautomatiseerde monstervoorbereiding voor de multiplexanalyse van single-cel histon post-translationele modificaties (sc-hPTM2) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Leer geautomatiseerde multiplexanalyse van histon post-translationele modificaties op single-celniveau. Deze methode gebruikt isotopische labeling voor kwantitatieve profilering van chromatineheterogeniteit in Hep G2/C3A-cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Res. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+workflow+for+analysis+of+histone+post-translational+modifications+using+bottom-up+mass+spectrometry%3A+from+histone+extraction+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Complete workflow for analysis of histone post-translational modifications using bottom-up mass spectrometry: from histone extraction to data analysis.</a> J Vis Exp. (111), e54112(2016).</li>
<li>Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCoPE-MS%3A+mass+spectrometry+of+single+mammalian+cells+quantifies+proteome+heterogeneity+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation.</a> Genome Biol. 19 (1), 161(2018).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+protein+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell protein analysis by mass spectrometry.</a> Curr Opin Chem Biol. 60 (1), 1-9 (2021).</li>
<li>Leduc, A., Khoury, L., Cantlon, J., Khan, S., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+sample+preparation+for+multiplexed+single-cell+proteomics+using+nPOP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Massively parallel sample preparation for multiplexed single-cell proteomics using nPOP.</a> Nat Protoc. 19 (12), 3750-3776 (2024).</li>
<li>Lund, P. J., Kori, Y., Zhao, X., Sidoli, S., Yuan, Z. F., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+labeling+and+quantitative+proteomics+of+acetylation+on+histones+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isotopic labeling and quantitative proteomics of acetylation on histones and beyond.</a> Methods Mol Biol. 1977 (1), 43-70 (2019).</li>
<li>Cutler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+profiling+of+single-cell+histone+post-translational+modifications+to+dissect+chromatin+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based profiling of single-cell histone post-translational modifications to dissect chromatin heterogeneity.</a> Nature Communications. , (2025).</li>
<li>Davie, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+histone+deacetylase+activity+by+butyrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Inhibition of histone deacetylase activity by butyrate.</a> J Nutr. 133 (7 Suppl), 2485S-2493S (2003).</li>
<li>Stransky, S., Cutler, R., Aguilan, J., Nieves, E., Sidoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+reversible+histone+acetylation+and+dynamics+in+gene+expression+regulation+using+3D+liver+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Investigation of reversible histone acetylation and dynamics in gene expression regulation using 3D liver spheroid model.</a> Epigenetics Chromatin. 15 (1), 35-35 (2022).</li>
<li>Stransky, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+phenotypic+analysis+of+functional+3D+spheroid+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Semi-automated phenotypic analysis of functional 3D spheroid cell cultures.</a> J Vis Exp. (1), e65086(2023).</li>
<li>Yuan, Z. F., Sidoli, S., Marchione, D. M., Simithy, J., Janssen, K. A., Szurgot, M. R., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiProfile+2.0%3A+a+computational+platform+for+processing+epi-proteomics+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data.</a> J Proteome Res. 17 (7), 2533-2541 (2018).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td>Bio-Rad</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro;L wide bore pipet tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222703</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;L wide bore pipet tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222730</td><td></td></tr><tr><td>384 well PCR plate Lo Bind&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30129547</td><td></td></tr><tr><td>96-well vacuum manifold</td><td>Millipore</td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, Optima LC-MS/MS grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive PCR plate foils</td><td>Thermo Fisher</td><td>AB0626</td><td></td></tr><tr><td>Anhydrous Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA42311AK</td><td>Labels stock solution for bulk</td></tr><tr><td>Arg-C Ultra, Mass Spec Grade</td><td>Promega</td><td>VA1831</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture grade water</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>CellenVIALs</td><td>SCIENION</td><td>/</td><td>Catalog number comes with a quote</td></tr><tr><td>DMSO, Anhydrous</td><td>Thermo Fisher</td><td>D12345</td><td>Labels stock solution</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT17205CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Thermo</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid 98%&ndash;100% for LC-MS LiChropur</td><td>Sigma</td><td>5330020050</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21022CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Ultra Pure)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>HPLC grade acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC grade water</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxylamine solution 50&nbsp;wt. % in H2O</td><td>Sigma</td><td>438227-50ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25015CI</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-beta-Maltoside (DDM) Detergent</td><td>Fisher Scientific</td><td>BN2005</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acids</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Exploris 480 Mass Spectrometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>BRE725539</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% Aqueous Solution EM Grade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>PDC-CM (type 2 coating)</td><td>SCIENION</td><td>/</td><td>Catalog number comes with a quote</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT3002CI</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS),10x, pH 7.4, RNase-free</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Dimethylsulfoxide (DMSO), LC-MS Grade</td><td>Thermo Fisher</td><td>85190</td><td></td></tr><tr><td>Pipette gun</td><td>Eppendorf</td><td>Z666467 (Milipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>Propionic anhydride &ge;99%</td><td>Sigma</td><td>240311-50G</td><td></td></tr><tr><td>Propionic anhydride-d10 &ge;98 atom % D, &ge;99% (CP)</td><td>Sigma</td><td>615692-1G</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Thermo</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>SciCHIP H1 coated glass slides</td><td>SCIENION</td><td>/</td><td>Catalog number comes with a quote</td></tr><tr><td>SpeedVac vacuum concentrator (96-well plates)</td><td>Thermo</td><td>15308325</td><td>Savant SPD1010</td></tr><tr><td>Sterile hood</td><td>Thermo</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>Sterile serological pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green Dead Cell Stain, for flow cytometry</td><td>Thermo Fisher</td><td>S34860</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Sigma</td><td>Z258415</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD10</td><td></td></tr></tbody></table>

geautomatiseerde monstervoorbereiding voor de multiplexanalyse van single-cel histon post-translationele modificaties (sc-hptm2)

Automated Sample Preparation for the Multiplexed Analysis of Single-Cell Histone Post-Translational Modifications (sc-hPTM2)

Om de toepassing van onze single-cell histon proteomics-workflow met ons systeem te demonstreren, analyseerden we sferoïden van HepG2/C3A-cellen behandeld met 5 mM natriumbutyraat gedurende 24 uur. Na LC-MS/MS-verwerving werden ruwe gegevens verwerkt met EpiProfile voor zowel lichte (propionanhydride) als zware (propionaanhydride-d10) labeling, waarbij genormaliseerde gegevens werden verkregen die de hoeveelheden peptiden en histonmarkeringen weergeven. Het QuantQC R-pakket werd vervolgens gebruikt om de acquisitiemetada...

Geautomatiseerde monstervoorbereiding voor de multiplexanalyse van single-cel histon post-translationele modificaties (sc-hPTM2)

Histone post-translational modifications (hPTMs) are central regulators of chromatin organization and gene expression. Their dysregulation is implicated ...

automated-sample-preparation-for-multiplexed-analysis-single-cell

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dit protocol beschrijft een volledig geïntegreerde workflow voor het karakteriseren histon post-translationele modificaties met massaspectrometrie (MS). De workflow bevat histon zuivering uit celkweken of weefsels, histon derivatisering en de spijsvertering, MS analyse met behulp van nano-flow vloeistofchromatografie en instructies voor gegevensanalyse. Het protocol is ontworpen voor de voltooiing binnen 2-3 dagen.

Compleet Workflow voor Analyse van histon post-translationele modificaties Met behulp van Bottom-up Massaspectrometrie: Van Histon Extraction om Data Analysis

Dit manuscript beschrijft methodes voor het toepassen van peptide microarray technologie op specificiteit profilering van antilichamen die histonen herkennen en hun post-translationele modificaties.

Analyse van Histone Antilichaam Specificiteit Met Peptide Microarrays

Het doel van dit artikel is om een uitgebreide, systematische handleiding voor de efficiënte reiniging van histones H3 en H4 en de kwantificering van residuen geacetyleerd Histon.

Zuivering van H3 en H4 Histone eiwitten en de kwantificering van geacetyleerd Histone merken in cellen en hersenweefsel

Deze workflow beschrijft de prestaties van tijd- en kostenefficiënte verrijking van meerdere eiwitposttranslationele modificaties (PTM's) tegelijkertijd voor kwantitatieve wereldwijde proteomische analyse. Het protocol maakt gebruik van peptide-niveau PTM verrijking met meerdere geconjugeerde antilichamen, gevolgd door data-onafhankelijke acquisitie massaspectrometrie analyse om biologische inzichten te krijgen in PTM crosstalk.

Gelijktijdige affiniteitsverrijking van twee posttranslationele wijzigingen voor kwantificering en sitelokalisatie

Hier tonen de auteurs het nut van MULTI-seq voor fenotypering en daaropvolgende gepaarde scRNA-seq en scATAC-seq bij het karakteriseren van de transcriptomische en chromatinetoegankelijkheidsprofielen in retina.

Multiplexed analyse van retinale genexpressie en chromatinetoegankelijkheid met behulp van scRNA-Seq en scATAC-Seq

Dit protocol schetst hoe een driedimensionaal celkweeksysteem kan worden gebruikt om chromatinemodificaties in een bijna fysiologische toestand te modelleren, behandelen en analyseren.

Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

Dit werk beschrijft een protocol voor de kwantificering van globale histonmodificaties met behulp van intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde hersenmicroglia. Het werk bevat ook het microglia-isolatieprotocol dat werd gebruikt voor het verzamelen van gegevens.

Kwantificering van globale histon posttranslationele modificaties met behulp van intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde microglia in de hersenen van muizen

Een analytische workflow op basis van vloeistofchromatografie, mobiliteitsspectrometrie met ingesloten ionen en time-of-flight-massaspectrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) voor een zeer betrouwbare en zeer reproduceerbare "bottom-up"-analyse van histonmodificaties en identificatie op basis van de belangrijkste parameters (retentietijd [RT], botsingsdoorsnede [CCS] en nauwkeurige massa-tot-lading [m/z]-verhouding).

Screening op histonmodificatie met behulp van vloeistofchromatografie, Trapped Ion Mobility Spectrometry en Time-Of-Flight Mass Spectrometry

Dit protocol maakt efficiënte histonextractie uit verschillende klinische monsters mogelijk voor latere posttranslationele modificatieanalyse door LC-MS/MS. Door robuuste detectie van belangrijke histonmodificaties te faciliteren, dient het als een waardevol hulpmiddel voor uitgebreide epigenetische profilering in grote klinische cohorten.

Extractie van histonen uit klinische monsters voor epigenetisch profileren door middel van massaspectrometrie

Genetische varianten in menselijke Spindlin Family Member 4 (SPIN4) zijn recentelijk vastgesteld bij patiënten met botovergroei, een nieuwe ontwikkelingsstoornis. Een protocol en nieuwe resultaten die de biochemische identificatie van gemodificeerde histonen in de context van nucleosomen als SPIN4-bindende substraten beschrijven, worden gepresenteerd.

Identificatie van gemodificeerde histonen als bindende substraten van het menselijke Spindlin-familielid 4 (SPIN4) door middel van peptidearrays en native nucleosoompulldown

Deze studie presenteert een ruimtelijk Trekker–CUT&amp;Tag multioomprotocol dat directe ruimtelijke streepjescoding van een weefselsectie combineert met enkelcel-multioomanalyse. Deze aanpak maakt ruimtelijk opgeloste enkelcelprofilering van genexpressie en de histon H3K27ac-modificatie mogelijk gelijktijdig, wat mechanistische inzichten biedt in genregulatie in de context van weefselmicroanatomie.

Ruimtelijk opgeloste, geïntegreerde single-cell multiomic profilering van het transcriptoom en epigenomische doelen in bevroren weefselsecties

Leer geautomatiseerde multiplexanalyse van histon post-translationele modificaties op single-celniveau. Deze methode gebruikt isotopische labeling voor kwantitatieve profilering van chromatineheterogeniteit in Hep G2/C3A-cellen.

Geautomatiseerde monstervoorbereiding voor de multiplexanalyse van single-cel histon post-translationele modificaties (sc-hPTM2) (Video) | JoVE Journal

Geautomatiseerde monstervoorbereiding voor de multiplexanalyse van single-cel histon post-translationele modificaties (sc-hPTM2)

Meer video's verkennen