Geautomatiseerde monstervoorbereiding voor de multiplexanalyse van single-cel histon post-translationele modificaties (sc-hPTM2)

We bevorderen single-cell proteomics met een geautomatiseerde multiplexmethode om de wereldwijde chromatine-heterogeniteit te bestuderen voor post-translationele modificaties. Wat dit protocol uitdagend maakt, is de picogramschaal proteomische voorbereiding, multiplexlabeling, evenals het oplossen van complexe combinatorisch gemodificeerde histonpeptiden. Om te beginnen reconstrueren we Hep G2/C3A hepatocellulair carcinoomcellen met een uiteindelijke concentratie van 200 tot 500 cellen per microliter in ijskoude PBS.

Stel de pulsbreedte en de aandrijfspanning van elke nozzle in op de waarden die de fabrikant heeft gegeven. Voor maximale opname-efficiëntie moet de Z-offset tussen de twee nozzles minder dan 50 micrometer verschillen. Identificeer de optimale contactpositie voor elke nozzle en vergelijk de Z-hoogte weergaven in het uitlaatstuk-insteltabblad.

Voor het tuplexmultiplexing-schema laad je een enkele slide op de slidehouder in de kap en zet je deze vervolgens over op het instrument. Met een pipet doe je 150 microliter LCMS-klasse DMSO in een nieuwe PCR-buis. Plaats hem op positie twee van het wasstation met de buisdop naar de instrumentendeur gericht.

Begin met de DMSO-run. Krijg een stabiele druppel zodra DMSO is geaspireerd. Let op de verandering in de PDC-transparantie.

Het kan nodig zijn om de spanning te verhogen. Controleer de stabiliteit door een controle op het dropvolume uit te voeren. Voer de hoofdcamera-wizard uit om de camera uit te lijnen.

Geef DMSO en laat het instrument automatisch de nozzles doorspoelen en beelden maken over alle slides voor kwaliteitscontrole. Bekijk deze beelden om een uniforme DMSO-druppel op elke dia te verifiëren en om te controleren op ontbrekende of niet-doelwitte druppels. Na het aspireren van de celsuspensie open je de cel in één module, voer je een achtergrondopname uit en voer je vervolgens de mappingroutine uit om de uitwerpzone te definiëren.

Voer de analyse uit en gate-en de deeltjes om cellen te selecteren op basis van grootte en verlenging. Maak nu een verse digestie-master mix in LCMS-water. Ontgass de oplossing met een vacuümpomp gedurende 10 minuten op ijs.

Na het doseren van het digestiemengsel op de dia's, laat het instrument de nozzles automatisch doorspoelen en fotografeer je elke slide. Bekijk de beelden om te controleren of elke druppel de verteringsmix gelijkmatig ontvangt. Incubeer de preparaten een nacht op kamertemperatuur om de spijsvertering te bevorderen.

Na het starten van de verdampingsronde en de nachtelijke vertering, inspecteer je de beelden. Als de druppels voldoende droog zijn, stop dan de stroom. Zo niet, klik dan op doorgaan en droog nog eens vijf minuten.

Voor etikettering bereid je eerst voorraadoplossingen voor multiplexed histonderivitisatie. Laat na het doseren het instrument de nozzles automatisch doorspoelen en fotografeer elke slide. Bekijk de beelden om een gelijkmatige verdeling en correcte druppelplaatsing over alle dia's te bevestigen.

Na voltooiing van de incubatie doseer je hydroxylamineoplossing voor het afkoelen. Om het voorbeeld op te pakken, selecteer je de run in het hoofdtabblad en start je de run in het run-tabblad. Na het ophalen bekijk je de afbeeldingen om te controleren op eventuele fouten.

Als je klaar bent met de pickup, haal je de deksel van de pickupplaat. Droog de monsters vervolgens op lage temperatuur in een vacuümconcentrator. Voor gegevensverzameling programmeer je de high performance vloeistofchromatografiemethode.

Stel het MS twee-experiment in op isolatievensters van 50 mass overcharge, hoogenergetische botsingsdissociatie van 27% en automatische versterkingscontrole van 1000%. Bedek de plaat met een rubberen afdichtingsmat en plaats deze in de autosampler. Na het verkrijgen van de ruwe bestanden controleer je kort het chromatogram en voer je vervolgens de ruwe data uit in EpiProfile versie 2.1. Bekijk de outputtabel van genormaliseerde histon PTM-abundanties en gebruik deze voor downstream analyses.

De eerste 20 histon H3-peptidovormen werden gekwantificeerd, wat hun relatieve hoeveelheden in controle- en natriumbutyraatbehandelde omstandigheden aantoonde. Zowel H3 K9-acetylatie als H3 K14-acetylering vertoonden een hogere relatieve abundantie bij natriumbutyraatbehandeling. Terwijl H3 K9-acetylatie K14 nog meer verrijkt was in behandelde cellen.

Het totale acetylatieniveau nam toe na natriumbutyraatbehandeling, waarbij behandelde cellen een bredere foutverdeling vertoonden dan controles, wat de hogere heterogeniteit op enkelcelniveau weerspiegelde. De kwantificering van enkele en gelijktijdig voorkomende histonmodificaties toonde aan dat combinatorische acetyleringstoestanden het sterkst werden beïnvloed door natriumbutyraat. De bredere verspreiding van met natriumbutyraat behandelde cellen duidde op een verhoogde biologische heterogeniteit tussen individuele cellen binnen de sferoïden.

Dit protocol sluit de kloof in epigenetisch onderzoek door wetenschappers in staat te stellen chromatinetoestanden te bestuderen bij enkelcellige oplossing. Deze workflow maakt het mogelijk om monstervoorbereiding met hoge doorvoersnelheid, multiplexing van monsters en onbevooroordeelde massaspectrometrie mogelijk om zowel gevoelige als kwantitatieve epigenetische gegevens van één cel te produceren. Toekomstig onderzoek zal onderzoeken hoe de regulatie van chromatine ziekteverschijnselen zoals kanker, metabole ziekten en veroudering verandert.