Geautomatiseerde monstervoorbereiding voor de multiplexanalyse van single-cel histon post-translationele modificaties (sc-hPTM2)
19 december 2025
Hier presenteren we een protocol om single-cell histon posttranslationele modificatieanalyse te automatiseren met behulp van een isotopische twee-plex labelingstrategie en ArgC-digestie. Deze workflow maakt kwantitatieve, reproduceerbare en hooggevoelige profilering van chromatine-heterogeniteit en epigenetische responsen bij enkelcelresolutie mogelijk.
We bevorderen single-cell proteomics met een geautomatiseerde multiplexmethode om de wereldwijde chromatine-heterogeniteit te bestuderen voor post-translationele modificaties. Wat dit protocol uitdagend maakt, is de picogramschaal proteomische voorbereiding, multiplexlabeling, evenals het oplossen van complexe combinatorisch gemodificeerde histonpeptiden. Om te beginnen reconstrueren we Hep G2/C3A hepatocellulair carcinoomcellen met een uiteindelijke concentratie van 200 tot 500 cellen per microliter in ijskoude PBS.
Stel de pulsbreedte en de aandrijfspanning van elke nozzle in op de waarden die de fabrikant heeft gegeven. Voor maximale opname-efficiëntie moet de Z-offset tussen de twee nozzles minder dan 50 micrometer verschillen. Identificeer de optimale contactpositie voor elke nozzle en vergelijk de Z-hoogte weergaven in het uitlaatstuk-insteltabblad.
Voor het tuplexmultiplexing-schema laad je een enkele slide op de slidehouder in de kap en zet je deze vervolgens over op het instrument. Met een pipet doe je 150 microliter LCMS-klasse DMSO in een nieuwe PCR-buis. Plaats hem op positie twee van het wasstation met de buisdop naar de instrumentendeur gericht.
Begin met de DMSO-run. Krijg een stabiele druppel zodra DMSO is geaspireerd. Let op de verandering in de PDC-transparantie.
Het kan nodig zijn om de spanning te verhogen. Controleer de stabiliteit door een controle op het dropvolume uit te voeren. Voer de hoofdcamera-wizard uit om de camera uit te lijnen.
Geef DMSO en laat het instrument automatisch de nozzles doorspoelen en beelden maken over alle slides voor kwaliteitscontrole. Bekijk deze beelden om een uniforme DMSO-druppel op elke dia te verifiëren en om te controleren op ontbrekende of niet-doelwitte druppels. Na het aspireren van de celsuspensie open je de cel in één module, voer je een achtergrondopname uit en voer je vervolgens de mappingroutine uit om de uitwerpzone te definiëren.
Voer de analyse uit en gate-en de deeltjes om cellen te selecteren op basis van grootte en verlenging. Maak nu een verse digestie-master mix in LCMS-water. Ontgass de oplossing met een vacuümpomp gedurende 10 minuten op ijs.
Na het doseren van het digestiemengsel op de dia's, laat het instrument de nozzles automatisch doorspoelen en fotografeer je elke slide. Bekijk de beelden om te controleren of elke druppel de verteringsmix gelijkmatig ontvangt. Incubeer de preparaten een nacht op kamertemperatuur om de spijsvertering te bevorderen.
Na het starten van de verdampingsronde en de nachtelijke vertering, inspecteer je de beelden. Als de druppels voldoende droog zijn, stop dan de stroom. Zo niet, klik dan op doorgaan en droog nog eens vijf minuten.
Voor etikettering bereid je eerst voorraadoplossingen voor multiplexed histonderivitisatie. Laat na het doseren het instrument de nozzles automatisch doorspoelen en fotografeer elke slide. Bekijk de beelden om een gelijkmatige verdeling en correcte druppelplaatsing over alle dia's te bevestigen.
Na voltooiing van de incubatie doseer je hydroxylamineoplossing voor het afkoelen. Om het voorbeeld op te pakken, selecteer je de run in het hoofdtabblad en start je de run in het run-tabblad. Na het ophalen bekijk je de afbeeldingen om te controleren op eventuele fouten.
Als je klaar bent met de pickup, haal je de deksel van de pickupplaat. Droog de monsters vervolgens op lage temperatuur in een vacuümconcentrator. Voor gegevensverzameling programmeer je de high performance vloeistofchromatografiemethode.
Stel het MS twee-experiment in op isolatievensters van 50 mass overcharge, hoogenergetische botsingsdissociatie van 27% en automatische versterkingscontrole van 1000%. Bedek de plaat met een rubberen afdichtingsmat en plaats deze in de autosampler. Na het verkrijgen van de ruwe bestanden controleer je kort het chromatogram en voer je vervolgens de ruwe data uit in EpiProfile versie 2.1. Bekijk de outputtabel van genormaliseerde histon PTM-abundanties en gebruik deze voor downstream analyses.
De eerste 20 histon H3-peptidovormen werden gekwantificeerd, wat hun relatieve hoeveelheden in controle- en natriumbutyraatbehandelde omstandigheden aantoonde. Zowel H3 K9-acetylatie als H3 K14-acetylering vertoonden een hogere relatieve abundantie bij natriumbutyraatbehandeling. Terwijl H3 K9-acetylatie K14 nog meer verrijkt was in behandelde cellen.
Het totale acetylatieniveau nam toe na natriumbutyraatbehandeling, waarbij behandelde cellen een bredere foutverdeling vertoonden dan controles, wat de hogere heterogeniteit op enkelcelniveau weerspiegelde. De kwantificering van enkele en gelijktijdig voorkomende histonmodificaties toonde aan dat combinatorische acetyleringstoestanden het sterkst werden beïnvloed door natriumbutyraat. De bredere verspreiding van met natriumbutyraat behandelde cellen duidde op een verhoogde biologische heterogeniteit tussen individuele cellen binnen de sferoïden.
Dit protocol sluit de kloof in epigenetisch onderzoek door wetenschappers in staat te stellen chromatinetoestanden te bestuderen bij enkelcellige oplossing. Deze workflow maakt het mogelijk om monstervoorbereiding met hoge doorvoersnelheid, multiplexing van monsters en onbevooroordeelde massaspectrometrie mogelijk om zowel gevoelige als kwantitatieve epigenetische gegevens van één cel te produceren. Toekomstig onderzoek zal onderzoeken hoe de regulatie van chromatine ziekteverschijnselen zoals kanker, metabole ziekten en veroudering verandert.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het automatiseren van analyse van post-translationele modificatie van histonen op single-cellniveau met behulp van een isotopen two-plex labelstrategie. De workflow maakt kwantitatieve en gevoelige profilering van chromatine heterogeniteit op single-cellniveau mogelijk.
Belangrijke Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Single-cell proteomics
- Histone post-translationele modificaties
- Chromatine analyse
Achtergrond
- Single-cell analyse is cruciaal voor het begrijpen van cellulaire heterogeniteit.
- Post-translationele modificaties spelen een sleutelrol in het reguleren van chromatinestructuur en -functie.
- Automatische methoden kunnen de reproduceerbaarheid en gevoeligheid in proteomische studies verbeteren.
- Uitdagingen omvatten het omgaan met kleine monstergroottes en complexe peptidemixturen.
Doel van Studie
- Om een robuust protocol te ontwikkelen voor het analyseren van histonmodificaties op single-cellniveau.
- Om de efficiëntie van multiplex labelen in proteomische workflows te verbeteren.
- Om de uitdagingen van histone peptiden met lage abundantie aan te pakken.
Gebruikte Methoden
- Reconstitutie van Hep G2/C3A cellen in PBS bij een gespecificeerde concentratie.
- Aanpassing van nozzle parameters voor optimale monsteropname.
- Implementatie van isotopen two-plex labelen voor kwantificering.
- Gebruik van ArgC-digestie voor peptide voorbereiding.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle automatisering van single-cell histon modificatie analyse.
- Hoge gevoeligheid en reproduceerbaarheid in profilering aangetoond.
- Effectieve resolutie van complexe combinatorisch gemodificeerde histone peptiden.
- Inzichten in chromatine heterogeniteit en epigenetische responsen.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol verbetert de studie van chromatine dynamica op single-cellniveau.
- Automatisatie verbetert de efficiëntie van histon modificatie analyse aanzienlijk.
- Deze methode kan toegepast worden op verschillende biologische vragen over epigenetica.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Automated single-cell histone PTM analysis addresses the critical challenge of resolving chromatin heterogeneity and epigenetic regulation at cellular resolution. This workflow enhances predictive confidence in early discovery by enabling quantitative, multiplexed profiling of histone modifications across individual cells. The approach supports risk-adjusted portfolio decisions by providing high-content, reproducible data on epigenetic states relevant to disease and therapeutic modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of chromatin regulatory mechanisms at the single-cell level.
- Supports functional target validation by quantifying histone PTM changes in response to perturbations.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct measurement of epigenetic heterogeneity.
- Improves predictive confidence for target selection and triage in epigenetic drug discovery.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell systems for downstream screening of epigenetic modulators.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative histone PTM readouts for assay development.
- Enables multiplexed comparison of treatment conditions using isotopic labeling strategies.
- Supports scalable, high-throughput workflows for compound evaluation in chromatin biology.
Translational & Preclinical Research
- Aligns single-cell epigenetic profiling with disease-relevant models such as tumor spheroids.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by capturing cellular heterogeneity in response to therapeutic agents.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative chromatin state data.
- Supports translational biomarker identification for epigenetic drug development.
Pipeline & Workflow Integration
This automated protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-content, quantitative analysis of histone PTMs at single-cell resolution.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving cell-to-cell chromatin variability.
- Screening: Provides assay-ready, multiplexed outputs for robust compound screening and comparison.
- Analytics: Delivers quantitative, normalized histone PTM abundance tables for statistical analysis and condition comparison.
- Translational Research: Connects single-cell epigenetic data to disease models and therapeutic response evaluation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, automated capability for ongoing epigenetic profiling across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in chromatin-targeted discovery.
- Operational Value: Standardizes and automates sample preparation for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-content, quantitative data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of epigenetic targets and compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell proteomics and mass spectrometry data analysis.
- Needs access to automated nano liquid handling and high-resolution LC-MS instrumentation.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data processing workflows.
- Adaptation may be needed for different cell types or disease models.
- Throughput and sensitivity are limited by instrument capacity and sample handling precision.
