Gewijzigde methoden voor het laden van DNA-extractieplaten met hoge doorvoer verminderen het potentieel voor verontreiniging
June 3rd, 2020
Huidige methoden voor het laden van 96-well platen voor DNA-extracties kunnen gevoelig zijn voor verontreiniging. We beschrijven een nieuwe methode voor het laden van 96-well platen die het risico op kruisbesmetting tussen putten vermindert. Onze methode zal andere onderzoekers helpen om te profiteren van de efficiëntie van dna-extractietechnieken met hoge doorvoer en het risico op besmetting te minimaliseren.
Dit protocol biedt een techniek voor het verhogen van de efficiëntie van 96-well DNA-extractieplaat laden, terwijl tegelijkertijd het verminderen van het risico van kruisbesmetting van monsters. Deze techniek vermindert de kans op besmetting tijdens de kritische eerste stap van DNA-extractie door de individuele toevoeging van monsters aan elke put in de 96-put plaat. Deze methodologie kan worden toegepast op een van de verschillende gebieden van microbioom onderzoek.
Voor het begin van een experiment, mist de bank top met 70%ethanol. Laat na het afvegen de bank drogen voordat u de bank besproeit met 10% bleekmiddel. Na het afvegen en het drogen van de lucht, dip de microscopaire, spuugt, en gebogen chirurgische schaar in 95%ethanol en stel de instrumenten bloot aan een vlam.
Dip vervolgens elk gereedschap in 10% bleekmiddel en laat de gereedschappen drogen. Voorafgaand aan de onderbemonstering steriliseert ethanol handschoenen en homogeniseert de bodemmonsters grondig. Vervolgens een voorbeeld-ID met putlocatie toewijzen aan elke buis.
Vul 95 gelabelde twee milliliter centrifugebuizen met één monster per buis, totdat elke buis ongeveer halfvol is. De 96e buis moet worden gebruikt als een extractie leeg. Plaats de sub-sample buizen op ijs, en label 96 steriele 200 microliter flat-caped PCR buizen volgens de put labels voor een 96-well plaat, plaats dan het etiket 200 microliter buizen in volgorde in een 96-well rack.
Om een 96-put plaat voor te bereiden voor het experiment, verwijder de cover van de plaat en plaats het deksel in een steriele plastic zak. Verzegel de zak om besmetting te voorkomen en bedek de plaat met een voorgesneden stuk doorborenbare afdichtingsfolie. Gebruik vervolgens een rubberen roller om de afdichting stevig aan de plaat te hechten en de plaat op vier graden Celsius op te slaan.
Om de submonsters op de plaat over te brengen, plaatst u 24 van de twee milliliter submonsterbuizen in een ijsblok voor koudeopslag en gebruikt u de monsternaam en het putlocatieblad om de overeenkomstige 200 met microliter plat afgetopte buizen te selecteren. Vortex de submonsters een voor een, gedurende vijf seconden per monster om homogenisatie te garanderen en ongeveer 200 microliter van elk monster te laden in de juiste overeenkomstige PCR buis. Wanneer alle 24 monsters zijn geladen, gebruik maken van een gebleekte geweekte papier doek om de buitenkant van een PCR-buis schoon te maken, en omkeren en tik op de buis op de bank om het monster te verplaatsen naar de bovenkant van de buis.
Met behulp van de vlam gesteriliseerd en gebleekt schaar clip de onderkant van de PCR buis om een opening voor het monster te creëren, en geef de buis over de plaat met de cut-end naar boven totdat de juiste put is bereikt. Kantel de plaat iets, om het doorboren van de voorgesneden pierceable afdichtingsfilm te vergemakkelijken, en met de buis direct boven de juiste put, snel maar voorzichtig de plaat omkeren, zodat de snijpunt in de put past. Gebruik een gesteriliseerd gereedschap om de bovenkant van de buis te tikken totdat alle grond uit de buis in de put is gevallen.
En laat de buis in de put met het lood dicht. Wanneer alle monsters op dezelfde manier zijn geladen, verwijdert u een 200 microliter plat afgetopte PCR-buis en voegt u 750 microliter kraaloplossing toe aan het monster. Plaats de 200 microliter flat-capped PCR buis terug in de put duwen het helemaal naar beneden in de put.
En gebruik een Sharpie om de bovenkant van de buis te markeren om aan te geven dat de put is geladen. Wanneer alle putten zijn geladen met kralen terug de 24 monster buizen tot 20 graden Celsius opslag en voeg 24 nieuwe sub-monster buizen aan het ijsblok, zodat de volgende set monsters worden geladen in de 96-put plaat zoals net aangetoond. Wanneer alle 95 putten zijn geladen met monster en kraal oplossing, voeg kraal oplossing alleen aan de 96e put.
Verwijder alle buizen, passeren ze over overdekte putten alleen en zorgvuldig verwijderen van de doorborenbare film van de plaat. Breng vervolgens voorzichtig het plaatdeksel van de plastic zak op de plaat en plaats de plaat op 20 graden Celsius tot de geplande extractie. Een vergelijking van plaatbeladingsmethoden toont aan dat de aangetoonde methode resulteert in de laagste DNA-concentratie binnen de lege putten.
Met behulp van deze methode, de DNA-concentratie was aanzienlijk lager dan bij het gebruik van de methode voorgesteld door McPherson et al. Hoewel de DNA-concentratie met deze methode statistisch niet anders was dan de standaardmethode qiagen. Alle drie de methoden, produceren gemiddelde DNA-concentraties onder twee nanogram per microliter.
Hoewel alleen deze nieuwe methode produceert putten zonder meetbare DNA-concentratie. Om de kans op morsen te minimaliseren, houdt u de 200 microliterbuis rechtop wanneer u deze over de plaat beweegt, kantelt u de plaat en plaatst u de buis in de juiste put.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie introduceert een nieuwe methode voor het laden van 96-wells platen om de efficiëntie te verbeteren en het risico op kruisbesmetting tijdens DNA-extracties te verminderen. De techniek is toepasbaar in verschillende gebieden van microbioomonderzoek en heeft tot doel de hoogdoorvoerige DNA-extractieprocessen te verfijnen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Onderzoeksgebied
- Microbioomonderzoek
- Hoogdoorvoerige DNA-extractie
- Methoden voor preventie van besmetting
Achtergrond
- Uitdagingen bij kruisbesmetting van monsters in DNA-extractieprocessen
- Belang van het behoud van monstersintegriteit
- Behoefte aan efficiënte laboratoriumprotocollen
Gebruikte methoden
- Protocol voor het laden van monsters in een 96-wells plaat
- Gebruikte gereedschappen en sterilisatietechnieken om besmetting te minimaliseren
- Vergelijkende analyse met bestaande methoden
Belangrijkste resultaten
- De nieuwe methode vermindert de DNA-concentratie in lege wells aanzienlijk in vergelijking met traditionele protocollen
- Het resulteert in geen meetbare DNA-concentratie in lege wells
- Observaties wijzen op betere besmettingscontrole zonder het opbrengst van DNA te compromitteren
Conclusies
- Deze studie toont een effectieve aanpak om het risico op besmetting in DNA-extractieworkflows te verminderen
- Het biedt waardevolle inzichten voor onderzoekers die de betrouwbaarheid van hun experimentele resultaten willen verbeteren
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
In high-throughput DNA extraction workflows, cross-contamination between samples in 96-well plates compromises data integrity and increases false-positive rates in downstream applications such as microbiome profiling and biomarker discovery. This method addresses a critical pre-analytical vulnerability by reducing well-to-well drift and double-loading, thereby enhancing the reliability of high-throughput nucleic acid preparation. For biopharma R&D, minimizing contamination at the extraction stage improves predictive confidence in target validation assays and supports reproducible screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Reduces false signals from contaminant DNA, improving target specificity in hypothesis-driven screening.
- Operational Value: Enables consistent sample preparation across replicates, reducing variability in early-stage target engagement data.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces extraction blanks with no measurable DNA concentration, establishing a true negative control for assay background.
- Operational Value: Standardizes sample loading into 96-well formats, improving reproducibility across automated and manual pipetting platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant sample processing by maintaining microbiome sample integrity from collection to extraction.
- Operational Value: Facilitates scalable processing of environmental or biological cohorts without increasing false discovery rates.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, specifically enhancing sample preparation for high-throughput extraction prior to library construction and sequencing in microbiome-based target identification workflows.
- Discovery Biology: Ensures that observed microbial signals originate from true biological variation rather than technical artifacts.
- Screening: Generates contamination-controlled DNA inputs suitable for quantitative PCR, sequencing, or functional screening assays.
- Analytics: Delivers low-background DNA extracts that improve signal-to-noise ratios in metagenomic and metatranscriptomic analyses.
- Translational Research: Maintains continuity from environmental or clinical sample collection through unbiased microbial profiling.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, contamination-minimized loading procedure applicable across multiple projects and laboratory sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through reduced mechanistic ambiguity from contaminant-derived signals.
- Operational Value: Reproducibility and standardization of high-throughput plate loading across users and batches.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions in target validation by lowering false-positive risk in screening data.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of leads based on cleaner, more reliable molecular phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires training in aseptic technique and tool sterilization protocols including ethanol and bleach treatment.
- Depends on access to pierceable PCR sealing films, sterile flat-capped PCR tubes, and flame-sterilizable dissection tools.
- Necessitates standardized sample tracking via well-location sheets to prevent misloading during serial processing.
- Involves cold storage steps (ice blocks and 4°C plate storage) to maintain sample integrity during loading.
- Limited to manual or semi-automated workflows; not compatible with fully robotic liquid handlers without adaptation.
