Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) op Live Cells

Conpokal combineert confocale microscopie met atoomkrachtmicroscopie met behulp van een sonde om het monsteroppervlak te porren. Hoewel beide technieken individueel effectief zijn, vergemakkelijkt Conpokal fluorescentiecolokalisatie met mechanische karakterisering. Het belangrijkste voordeel van de Conpokal techniek, is de bijna gelijktijdige dual-microscopie.

Confocal onderzoekt cytoskeletale en andere cellulaire processen voor en na AFM indringende, die gebied specifieke mechanische eigenschappen levert. Deze techniek is impactful binnen het mechanobiologie veld als bijvoorbeeld, hersencellen kunnen worden gesondeerd onder fysiologische omstandigheden om elektrische impulsen en kracht transactie te onderzoeken. Selecteer voor aanvang van de analyse een geschikte AFM-cantilever voor de gewenste gegevensverzameling en gebruik handschoenen, de AFM-chipmontage, pincet en een kleine schroevendraaier om de chip in het glazen blok te monteren.

Plaats de AFM-chip voorzichtig op het midden van het glazen blok. De cantilever plus een zeer klein deel van de AFM-chip moet zich in het zichtbare, niet-ondoorzichtige gedeelte van het glazen blok bekent. Gebruik de schroevendraaier om de schroef aan te draaien totdat de chip is strak tegen het glazen blok, en gebruik een lens om te controleren of de chip correct is gericht.

Wanneer de chip goed is georiënteerd, plaatst u het glazen blok in de juiste richting in de AFM-kop en sluit u het glazen blok op zijn plaats. Na het lokaliseren van de onderkant van de kalibratie schotel door helder-veld microscopie, gebruik maken van de AFM systeem Z stepper motor bedieningspaneel om de AFM cantilever 2000 micron boven het monster te verplaatsen. Met behulp van heldere veldverlichting en het Z stepper motor bedieningspaneel, langzaam lager de AFM chip aan de onderkant van de glazen schotel in stappen van 100 tot 200 micron om te voorkomen dat crashen de AFM tip in de Petri schotel.

Zoek de handmatige micrometers die X Y of in duidelijke beweging van het AFM-hoofd op het instrumentenplatform bedienen. Als de schaduw van de AFM cantilever donkerder wordt en de vorm scherper wordt, gebruikt u de handmatige micrometers om de AFM-kop te corrigeren en de positie van de AFM-cantilever binnen het gezichtsveld aan te passen. Op dit moment moeten de opzoektabellen mogelijk worden aangepast.

Kijk voor een schaduw te verschijnen in de microscoop software weergave, die aangeeft dat de AFM tip wordt steeds dichter bij de bodem van de schotel. Doorgaan met kleine stappen om de AFM tip te verlagen totdat de tip is meestal in focus. Wanneer de laser in positie is, gebruikt u de laseruitlijningswijzerplaten om de laser op de achterzijde te plaatsen van waar de AFM-tip zich op de cantilever bevindt.

Het laseruitlijningspaneel moet een somsignaal weergeven dat groter is dan nul volt. Verplaats de laser, een kleine afstand in alle richtingen op de AFM cantilever, totdat het maximale somsignaal wordt bereikt terwijl u bij de AFM-tip blijft. Zodra de laserpositie is ingesteld, gebruikt u de handmatig geregelde afbuigingswijzerplaten tot nul van de verticale en laterale afbuiging.

Gebruik de verticale en laterale afbuigingknoppen om de detector uit te lijnen, zodat het doel gecentreerd is en er geen verticale of laterale afbuiging wordt waargenomen in het laseruitlijningspaneel. Open het kalibratievenster en voer alle specifieke informatie uit. Vervang het laserlichtfilter.

Schakel voordat u de confocale microscooplichtbron kalibreert en sluit de AFM-behuizing om eventuele geluiden uit het licht of de trillingen van de ruimte te dempen. Druk op de kalibratieknop om het systeem automatisch de tip te laten kalibreren. Wanneer de kalibratie is voltooid, wordt de stijfheid van de cantilever en de gevoeligheid ervan weergegeven in het kalibratiepaneel.

Gebruik vervolgens de knop Automatische aanpak om de punt naar de onderkant van de monsterschaal te laten zakken en de grootte van het huidgebied, de resolutie, het instelpunt, de Z-lengte en de pixeltijd in te stellen voordat u op de afspeelknop drukt om te beginnen met scannen. Voor confocale microscoop beeldvorming in de microscoop software, in staat stellen de confocale mogelijkheden en selecteer de laserlijnen geschikt voor de kleurstoffen die werden gebruikt om de monsters vlekken. Selecteer een of meerdere laserlijnen om deze functies in het monster op te wekken en te beelden en stel de winst in op een waarde die de samplefluorescentie optimaliseert, maar de hoeveelheid ruis beperkt.

Pas de laserkracht aan om verzadigde pixels te vermijden terwijl het dynamisch bereik wordt gemaximaliseerd en stel de pinholegrootte in op één gebiedseenheid om de resolutie voor de optische sectie te maximaliseren. Pas indien nodig de waarden aan op basis van de helderheid van het monster. Als u de tijd van de pixelwoning wilt instellen, begint u met ongeveer twee microseconden en past u zich aan om de helderheid van het monster zo nodig weer te geven.

Als u de pixelgrootte voor de geselecteerde doelstelling wilt selecteren, laat u het instrument de pixelgrootte berekenen via de optieknop Nyquist en het geselecteerde aantal pixels in de afbeelding. Selecteer vervolgens de optie Scannen en begin met het verzamelen van gegevens. Gebruik de focusknop om het brandpuntsvlak te vinden dat de voorbeeldfuncties in de duidelijkste vorm weergeeft, de knop Scannen om te beginnen met het verzamelen van gegevens en de knop Vastleggen om een tweedimensionaal beeld vast te leggen.

Met behulp van het paneel dat de pixelgrootte via de nyquist-optie regelt, verkleint u de gebiedsgrootte van de scan om slechts één cel te omhullen. Activeer het verzamelgereedschap en gebruik een optie van onder naar boven, met alleen de laserlijn die een functie in het monster het duidelijkst verlicht, stel de start- en finishvlakken in voor het te meten volume met behulp van de voorgestelde afstand tussen de vlakken. Geef het bestand een naam en sla het op in de bijbehorende map.

Als onze priori kennis van de dikte van de monsters bestaat, selecteert u het helderste, scherpste middenvlak door de focus aan te passen om het volume te definiëren en de bovenkant in te stellen op de monsterdikte boven het middelste vlak en de bodem om de dikte onder het middelste vlak te hebben, selecteer vervolgens de juiste stapgrootte. Voer de acquisitie uit door op de knop Nu uitvoeren te drukken. Wanneer de overname is voltooid, slaat u het bestand op in de juiste map.

Draag aan het einde van het experiment handschoenen terwijl u het glazen blok verwijdert en plaatst het in het montagestation. Gebruik een pincet met rubberen grepen om de AFM-chip zorgvuldig te verwijderen en plaats de gebruikte tip terug in de locatie van de opbergdoos gericht op toegang om aan te geven dat deze is gebruikt. Voor toekomstige referentie, let op welke tip werd gebruikt in het experiment.

Hier wordt een representatieve AFM-scan getoond over een levende HEK-cel. De hoogte voor deze specifieke HEK-cel was ongeveer 10 micron, zoals blijkt uit de lijnscan. Hier kan een voorbeeld van een slechte scan als gevolg van een onjuiste AFM tip keuze worden waargenomen.

In deze afbeelding verschenen zwarte pixels aan de top van de cel, wat aangeeft dat de AFM PA-zone buiten bereik was vanwege een grote celhoogte. Het uiteinde van de AFM cantilever verschijnt ook in de afbeelding vanwege de tip offset in combinatie met een onvoldoende tip hoogte in vergelijking met de celhoogte. Deze artefacten in de AFM-afbeelding geven aan dat er een andere AFM-tip had moeten worden gekozen om de cel in beeld te brengen.

Drie kleuren confocale beeldvorming kan worden uitgevoerd. Bijvoorbeeld om de celkern, micro tubuli en lipofiele membraan te visualiseren. Analyse van de tip inkepingen in combinatie met het nano mechanische model, maakt het mogelijk de generatie van een modulus kaart van het oppervlak.

Hier wordt een overeenkomstige 3D-projectie van de laserconfocale Z-stack getoond. AFM-scans en gemeten moduluskaarten kunnen ook worden aangeschaft voor microben, zoals blijkt uit deze representatieve analyse van de streptokokkenbacterie. Zoals aangetoond, kan een betere resolutie worden bereikt op deze schaal met AFM, dan met traditionele confocale microscopie.

Lijmkracht mapping is een techniek die wordt uitgevoerd door middel van conpokal om moleculaire interacties te visualiseren. Bijvoorbeeld om de modulatie van celoppervlakmoleculen te bestuderen om bindende kinetiek te observeren. Conpokal luidt een nieuwe weg in voor het verkennen van structuurfunctierelaties in de medische microbiologie.

Bijvoorbeeld, fysieke en chemische gebeurtenissen en de peptidoglycan laag, kan worden gekoppeld aan antibioticaresistentie.