Superresolutie beeldvorming en gedeeld beheer: een protocol voor confocale microscopie met multiplexdetectie

Ons onderzoek richt zich op het ontwikkelen van toegankelijke superresolutie-beeldvormingsmethoden om dynamische subcellulaire structuren te visualiseren, waarmee de diffractielimiet van conventionele microscopie wordt overwonnen. De superresolutiemethode bestrijdt fototoxiciteit, complexe werking en gespecialiseerde voorbereiding. Dit protocol vermindert deze barrières door confocaal-gebaseerde multiplexdetectie.

Om te beginnen zet je de hoofdunit van de microscoop, de laserlanceermodule, de LED-lichtbron en de besturingscomputer in. Start de microscoop-besturingssoftware. Selecteer vanaf de hoofdinterface GFP en kies dan voor het uitschakelen van het gereflecteerde licht.

Ga naar het paneel Acquisitie. Selecteer in het keuzemenu objectieflens de juiste objectieflens. Voor live cell imaging activeer je 45 tot 60 minuten voor de beeldvorming de omgevingskamer en het actieve focusstabilisatiesysteem.

Controleer na het stabiliseren van het systeem de stabiliteit met behulp van de kamersensoren. Breng dompelolie aan op de voorlens van het objectief zonder belletjes te veroorzaken. Plaats het voorbereide monster op het microscooppodium.

Tilt het voorzichtig op totdat de deklaag contact maakt met de dompelolie. Open vervolgens de acquisitiesoftware. Ga naar het tabblad Acquisitie en selecteer een nieuw experiment aanmaken.

Voeg nu beeldvormingssporen toe voor de gebruikte fluoroforen. Voor elke spoor stel je de confocale gaatdiameter in op één luchteenheid. Om de laserkracht te optimaliseren, selecteer je het eerste kanaal en schakel je over naar live scanning-modus.

Stel het initiële laservermogen in op een lage waarde en stel vervolgens de detectorversterking in op een matig niveau binnen het lineaire bereik. Daarna verhoog je het laservermogen geleidelijk totdat de doelstructuren duidelijk zichtbaar zijn boven de achtergrond in de livebeeld. Stel de pixelgrootte in met de Nyquist-sampleknop van de software om deze automatisch te berekenen.

Stel vervolgens de pixeltijd in. Selecteer nu de sequentiële scanmodus tussen de sporen om crosstalk te minimaliseren. Klik op Snap om één afbeelding te maken.

Sla de afbeelding op met relevante metadata. Voor consistente instellingen over optische secties controleer je dat alle beeldparameters op één optimaal brandpuntsvlak zijn geconfigureerd voordat je de Z-stack definieert. Open het tabblad Acquisitie en selecteer de Z-stack modus.

Definieer het volume van interesse door een snelle live scan te gebruiken om eerst te focussen op de onderste structuur van interesse, en klik dan op Set Last of Bottom. Pas de focus zorgvuldig aan naar de bovenste structuur van interesse en klik op Set First of Top. De software toont dan de totale diepte.

De Z-stack grootte is ingesteld om te voldoen aan het Nyquist-bemonsteringscriterium. Gebruik de Optimal-knop om het automatisch te berekenen. Na het configureren van de beeldparameters voor elk kanaal, verhoog je het laservermogen of versterking iets voor zwakke signalen vergeleken met een enkel tweedimensionaal beeld.

Begin met de acquisitie om de volledige beeldstack te verzamelen. Voor visualisatie gebruik je de native verwerkingsmodule van de microscoop. Genereer projecties met maximale intensiteit om alle in-focus signalen in één tweedimensionaal beeld te bekijken.

Vervolgens voer je volume rendering uit met behulp van de ingebouwde algoritmen van de software om een driedimensionale representatie te genereren. Pas de helderheid, dekking en verlichting aan waar nodig. Vervolgens genereer je orthogonale XZ- en YZ-dwarsdoorsneden om de axiale omvang en registratie te inspecteren.

Multicolor fluorescentiebeeldvorming van vaste COS-7-cellen toonde aan dat de kernen, mitochondriën en microtubuli duidelijk gelabeld waren met minimale overlapping, wat effectieve sequentiële scanning en geoptimaliseerde detectie bevestigde. De maximale intensiteitsprojectie integreert signalen over alle optische secties en benadrukt de ruimtelijke verdeling van fluorescentie-gelabelde structuren. Een driedimensionale reconstructie biedt een dieptebewust beeld van de voorbeeldarchitectuur.

Time-lapse beeldvorming van levende Hep 3B-cellen met EGFP-getagde mitochondriën wordt vergeleken tussen modi. Confocale frames over tijdspunten tonen duidelijke structuren, maar geleidelijk signaalverlies. Standaard superresolutie- of SR-frames tonen hogere resolutie, maar nemen na verloop van tijd meer fotobleaching aan.

Snelle superresolutie- of SR-4Y-beelden behouden stabiele fluorescentie, zelfs op latere tijdstippen. De grafiek van de gemiddelde EGFP-fluorescentieintensiteit over 100 tijdstippen toont aan dat de SR-4Y-modus het meest stabiele signaal behield. De beeldvormingsprestaties in vaste COS-7-cellen werden over modi heen vergeleken, en superresolutiemodi boden duidelijkere structurele details dan confocale.

Het meten van de puntspreidingsfunctie met 100 nanometer fluorescerende kralen toonde aan dat Airyscan SR met daaropvolgende gewrichtsdeconvolutie zowel de laterale als axiale resolutie verbeterde ten opzichte van alleen Airyscan SR. Dit protocol stelt onderzoekers in staat organelmorfologie, cytoskeletdynamica en molecuulcolokalisatie te bestuderen in zowel vaste als levende cellen met een resolutie van ongeveer 120 nanometer. De belangrijkste overweging van dit protocol is nauwgezette monstervoorbereiding met hoogwaardig afdekglas en geoptimaliseerde kleuring om signaalintegriteit voor superresolutieverwerking te waarborgen.

Na deze procedure kunnen onderzoekers kwantitatieve beeldanalyse uitvoeren, zoals het meten van de signaal-ruisverhouding of colokalisatie, met behulp van speciale software zoals ImageJ.