Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Synapsen zijn de functionele elementen van neuronen en hun gebreken of verliezen zijn aan de basis van verschillende neurodegeneratieve en neurologische aandoeningen. Beeldvormingsstudies worden veel gebruikt om hun functie en plasticiteit in fysiologische en pathologische omstandigheden te onderzoeken. Vanwege hun grootte en structuur vereisen lokalisatiestudies van eiwitten beeldvormingstechnieken met hoge resolutie.

In dit protocol beschrijven we een procedure om in primaire neuronen de colokalisatie van doeleiwitten met synaptische markers op een superresolutieniveau te bestuderen met behulp van gestructureerde verlichtingsmicroscopie. SIM is een patroon lichtverlichting techniek die de ruimtelijke resolutie van widefield microscopie verdubbelt, het bereiken van een detail van ongeveer 100 nanometer. Het protocol geeft de vereiste besturingselementen en instellingen aan voor robuuste colokalisatiestudies en een overzicht van de statistische methoden om de beeldgegevens goed te analyseren.

De sleutel tot het toestaan van de analyse op een superresolutieniveau is echter de reagentia die bij de verwerving worden gebruikt, zoals chambered covers en montageoplossingen die compatibel zijn met de diffractie-index van de doelstelling. Om een muis hippocampal primaire neuron te verkrijgen, isoleer hippocampi van P1 naar P4 pups. Plaatcellen op 70.000 cellen per put in een volume van 200 microliter per put.

Wacht tot hippocampal primaire neuronen zijn volledig gerijpt 12 tot 14 dagen na beplating om co-lokalisatie studies uit te voeren. Voeg 4% paraformaldehyde, PFA, in PBS 200 microliter per goed aan neuronen om ze snel vast te stellen. Verwijder de oplossing en ontcubeer de monsters met 1%runderserum albumine, BSA, in PBS bij 200 microliter per put gedurende een uur bij kamertemperatuur om passief alle vrij bindende oppervlakken van de plaat te bedekken met een irrelevant eiwit voor de analyse.

Een op BSA gebaseerde blokkeringsbuffer zonder Triton X-100 vermindert de achtergrond van antilichamen efficiënter dan dezelfde buffer met 0,2%Triton X-100. Voeg het primaire antilichaam toe. Voeg als negatieve controle geen primair antilichaam toe aan een van de putten.

Zet cellen op met een sim-compatibele mountant, bijvoorbeeld ProLong Glass Antifade Mountant. Dek af en bescherm de cellen met een coverglass, bijvoorbeeld een ronde afdekking met een diameter van acht millimeter.

Vierkante kunnen ook worden gebruikt. Bewaar de chambered coverslips op kamertemperatuur en wacht ten minste 48 uur voordat u afbeeldingen verwerft. Diamond glas vereist ten minste twee dagen van het genezen voor super-resolutie acquisities.

Gebruik twee strategieën om de specificiteit van antilichamen te verzekeren. De eerste is het gebruik van ten minste twee verschillende antilichamen gericht op hetzelfde substraat. De tweede strategie is antilichaam neutralisatie door incubatie met het gezuiverde eiwit doel, of de gebruikt om het antilichaam te verhogen.

We gebruiken routinematig een N-SIM super-resolutie microscoop vervaardigd door Nikon voor onze analyse. De instructies die volgen moeten worden bedoeld voor de verwerving van SIM-beelden onafhankelijk van de gebruiksmicroscoop. Het is ook belangrijk om de prestaties van de microscoop te maximaliseren om een nauwkeurige kalibratie van de instrumenten uit te voeren, inclusief correctiering, laseruitlijning en roosterblokfocus.

Voor de aankoop van SIM-beelden vereist het systeem een goede kalibratie met specifieke subresolutiegrootte fluorescerende kralen. Een voorbeeld zijn TetraSpeck microsferen. Deze kralen zijn gekleurd met verschillende fluorescerende kleurstoffen om de kalibratie van verschillende lasers met een monster mogelijk te maken.

In een waterbad, sonicate ongeveer 1,8 keer 10 tot de 8e fluorescerende microsferen gedurende 10 minuten. Verdun de fluorescerende microsferen één op de 500 in dubbel gedestilleerd water. Sonicate een tweede keer voor een extra 10 minuten.

Pipette 15 microliters van de verdunde kralen in een put van een chambered coverslip. Laat de oplossing vijf minuten drogen bij kamertemperatuur. Voeg 10 microliter van de montageoplossing toe, bijv.

ProLong Glass, en plaats een acht millimeter coverslip op de top. Wacht minstens 48 uur om een goede uitharding mogelijk te maken. Zet de microscoop en lasers aan.

Laat het systeem opwarmen om het thermische evenwicht van alle microscoopcomponenten te bereiken en het SIM-microscoopsysteem met superresolutie vereist minstens drie uur. Selecteer de doelstelling 100X. Start de kalibratie door de lasers uit te lijnen naar het midden van het diffractie rooster blok.

In het N-SIM-systeem maken een micrometerknop en een speciale camera het mogelijk om de lichtstralen naar het doel te centreren. Plaats de chambered coverslip van de microscoop voor het bekijken. Stel het systeem in op de chambered coverslip dikte door de objectieve correctiecover aan te passen.

NIS Software, de propriëtaire software die wordt geleverd met N-SIM super-resolutie microscoopsystemen, heeft een automatische functie om correctie van kleuren te reguleren. Pas de roosterblokfocus voor elk kanaal aan om te zorgen voor gerichte gestructureerde patroonverlichting op het monster. De software biedt een automatische functie voor deze taak.

Verkrijg ruwe 3D SIM-beelden van de veelkleurige microsferen. Bereken voor elke afzonderlijke golflengte de Fourier-transformatie van het super-opgeloste beeld. Als de getransformeerde afbeelding geen correct bloemachtig patroon krijgt, start u de kalibratie opnieuw op omdat de superresolutie niet is bereikt.

Selecteer in de superopte afbeelding één microsfeer en bereken het intensiteitsprofiel voor elk kanaal om de bereikte resolutie te meten. Het moet nu dicht bij 100 nanometer lateraal. Voer kanaalregistratie uit door een multi-channel acquisitie van de microsferen te overlayen.

Het doel is om alle kanaalsignalen lateraal en axiaal te verzamelen. Dit elimineert chromatische aberraties als gevolg van de verkeerde uitlijning van de verschillende kanalen en helpen de co-lokalisatie analyse. Bevestig de kwaliteit van de kalibratie met behulp van de functies verlichting fase stap en verlichting patroon focus van SIMcheck, een suite van plugins voor de open source applicatie ImageJ.

Begin met het analyseren van het monster met behulp van een 40X-doelstelling in confocale of breedveldmodus. Dit maakt navigatie van het monster mogelijk, met behoud van goede details en een groot gezichtsveld. Gebruik MAP2-signaal om een gebied te detecteren dat neuronale processen weergeeft.

Verwerf afbeeldingen van het monster in confocale modus om de kwaliteit van de kleuring te bepalen. Schakel over naar de doelstelling 100X. Breng olie aan op de 100X doelstelling.

Verwerf een widefield- of confocale afbeelding die later zal worden gebruikt om de kwaliteit van de super-opgeloste afbeelding te beoordelen. Schakel over naar de 3D SIM-modus. Als u dialoogvensters gebruikt om de parameters voor acquisitie in te stellen, selecteert u de hoogste bitdiepteinstelling die beschikbaar is om kleurinformatie te maximaliseren.

Typisch, 16 bit is de standaard keuze. Bovendien, om de signaal-ruisverhouding te verbeteren, selecteert u een laagfrequente waarde voor acquisitie, zoals een megahertz. Met behulp van histogram vensters, laserkracht instellen om een lineaire reactie van het signaal te verkrijgen om verlies van informatie te voorkomen, beperken verzadigde pixels in de beelden.

Het N-SIM systeem maakt gebruik van een Andor iXon3 camera. Wanneer u op 16-bits werkt, kiest u een doelintensiteit van 16.000 om de lineaire respons van de camera te garanderen. U ook kiezen voor een bereik tussen 30.000 en 45.000 om het dynamisch bereik van de acquisities te maximaliseren.

Stel het laservermogen in tussen 0,1% en 50% bij het beeldvorming van de monsters en de belichtingstijden tussen 50 milliseconden en twee seconden. Laserkrachten boven de 50% kunnen leiden tot snelle fotobleaching van de fluoroforen in gebruik. Begin met het verwerven van de afbeeldingen in de 3D SIM-modus.

Gebruik SIMcheck, een suite van gratis plug-ins voor ImageJ, om de kwaliteit van de acquisities van de ruwe afbeeldingen te beoordelen. Als SIMcheck geen artefacten of kwaliteitsproblemen detecteert, verwerft u minimaal 10 afbeeldingen van volledige technische replica's om statistische analyse mogelijk te maken. Verworven afbeeldingen zijn ruwe gegevens die moeten worden verwerkt om gereconstrueerde SIM-afbeeldingen te verkrijgen die zullen worden gebruikt voor verdere analyse.

In het protocol raden we aan om synaptophysine en PSD-95 te gebruiken als pre- en post synaptische markers. Extra markeringen kunnen echter worden gebruikt. Een enorme hoeveelheid literatuur ondersteunt het gebruik van andere eiwitten, zoals drebrin en fagot als synaptische markers.

3D SIM verworven beelden zijn ruwe beelden die moeten worden verwerkt om gereconstrueerde super-resolved beelden te verkrijgen. Onjuiste reconstructie van ruwe afbeeldingen kan leiden tot artefacten die de analyse van de monsters zouden beïnvloeden. Daarom moet er veel aandacht worden besteed aan het goed kiezen van reconstructieparameters.

Verwerk de ruwe beelden met behulp van de microscoop reconstructie analyse software om een super-opgelost beeld te verkrijgen. U ook gebruik maken van een vrij beschikbare ImageJ plugin fairSIM om de ruwe beelden te reconstrueren. Bereken de Fourier-transformatie van de super-opgeloste beelden met behulp van de microscoop reconstructie software of ImageJ plugin SIMcheck.

Een goed gereconstrueerd beeld moet voor elk kanaal een bloemachtig beeld terugbrengen. Als de gereconstrueerde afbeeldingen een bloemachtige vorm niet opnieuw maken, start u de ruwe afbeeldingen opnieuw op en reconstrueert u deze door reconstructieparameters te wijzigen, zoals lineair filteren, apodisatie en nulvolgordeonderdrukking. In de NIS-software die de preview gebruikt om te controleren hoe het wijzigen van de parameters van invloed is op de uiteindelijke opgeloste afbeelding, wijzigt u het contrast van de verlichtingsmodulatie van de parameter, ruisonderdrukking met hoge resolutie en onscherpe onderdrukking.

Analyseer de gereconstrueerde afbeelding om artefacten onbevooroordeeld te detecteren met Behulp van NanoJ-SQUIRREL, een op ImageJ gebaseerde plug-in, om de kwaliteit van superbe loste afbeeldingen te beoordelen. In onze analyse van co-lokalisatie gebruikten we twee benaderingen. De eerste is een visuele benadering op basis van de profielanalyse die afzonderlijke gebeurtenissen van colokalisatie toont en die de bijdrage van elk kanaal identificeert.

Als eerste stap om co-lokalisatie tussen synaptische markers en een eiwit van belang te bestuderen, neem een super-opgelost beeld en analyseer een enkele locus om signaal overlap te bepalen. Identificeer een enkele locus op de super-opgeloste afbeelding. Verkrijg de intensiteitsprofielen van de fluorescerende signalen naar de locus van belang.

Als profielanalyse heeft gesuggereerd enkele locus co-lokalisatie, een meer algemene analyse van het hele beeld kan worden uitgevoerd door het berekenen van Pearson's en Mander's coëfficiënten. Gebruik JACoP, een ImageJ-plug-in, om twee parameters van colokalisatie, Pearson's en Mander's te bepalen. Nadat we het systeem hadden gekalibreerd en de kwaliteit van de gereconstrueerde beelden hadden beoordeeld, zijn we vervolgens begonnen met het analyseren van de primaire neuronale culturen bevlekt met een antilichaam tegen MAP2, een neuronale marker, PSD-95, een postsynaptische marker en ons doeleiwit SUMO1.

We analyseerden eerst het monster dat vierkanaals confocale microscopie uitvoerde met een 40X-doelstelling. Bij het selecteren van een gebied dat neuronale processen vertegenwoordigt, zijn we overgestapt op een 100X-doelstelling. We verwierven zowel confocale als SIM-beelden van hetzelfde gebied om de kwaliteit van de wederopbouw te beoordelen met NanoJ-SQUIRREL en colokalisatie-analyse uit te voeren.

Het ophelderen van de structuur en samenstelling van de synaps is cruciaal voor het begrip van zowel fysiologische als pathologische processen die geheugen en cognitie reguleren. Terwijl in normale staat synapsen zijn de bouwstenen van het geheugen, ze zijn ook aan de basis van complexe neurologische aandoeningen, zoals een van de meest voorkomende vormen van dementie de ziekte van Alzheimer. Het hier beschreven protocol maakt het mogelijk om de eiwitsamenstelling van synapsen te bestuderen met een microscopietechniek met superresolutie, gestructureerde verlichtingsmicroscopie genoemd.