Een kosteneffectieve en aanpasbare scratchmigratietest

Dit protocol biedt een nieuwe methode voor een oude techniek, en het zal een nieuwe aanpak voor een groot aantal fundamentele wetenschappelijke onderzoekers. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn het kosteneffectieve karakter en het aanpassingsvermogen ervan om te worden gebruikt door een breder wetenschappelijk publiek. Om een migratieplaat voor te bereiden, gebruikt u een lichtgekleurde permanente markering om een lijn in het midden van de achterkant van elke put van een 48-putplaat te tekenen en drie hashmarkeringen te trekken om elk goed in drie afzonderlijke aandachtsgebieden te verdelen.

Dan plaat 1,5 tot twee keer 10 tot de vierde enkele passage cardiale fibroblasten in elke put en cultuur de cellen onder normale cultuuromstandigheden voor 24 tot 48 uur totdat ze bereiken 90 tot 95%samenvloeiing. Wanneer de cellen klaar zijn, verwijder de supernatant van elke put en gebruik een steriele P200 pipet tip om een een pass kras langs de getekende lijnen te maken. Spoel de putten met een laag serummedium om ongebonden cardiale fibroblasten te verwijderen en voeg 500 microliter laag serummedium toe aan elke put.

Als farmacologische middelen worden gebruikt, voeg de middelen toe aan de juiste putten. Gebruik vervolgens een omgekeerde microscoop met een 20x-doelstelling om twee nul uur beelden per put vast te leggen met behulp van de markeringen om elke put te positioneren om beeldvorming van de bovenste helft van de bekraste lijn mogelijk te maken. Beweeg vervolgens de plaat om de onderste helft van de bekraste lijn in het zicht te plaatsen om het tweede beeld te verzamelen en de plaat 24 uur in de celkweek incubator te plaatsen.

Aan het einde van de incubatie, was elk goed met niet-steriele PVS en voeg 500 microliters van 4% paraformaldehyde aan elke put in een rookkap. Na 10 minuten op kamertemperatuur, was elke put drie keer in verse PBS gedurende vijf minuten per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, permeabiliseren van de cellen met 300 microliter permeabiliseren oplossing per goed en zachte schommelen gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.

Vervang aan het einde van de incubatie de permeabiliserende oplossing door 1%Kumasi briljante blauwe vlek voor een incubatie van 10 minuten met zacht schommelen bij kamertemperatuur. Gevolgd door drie, vijf minuten wast in PBS met schommelen. Voeg na de laatste wasbeurt 300 microliter PBS toe aan elke put en plaats de plaat zorgvuldig in dezelfde positie als voor het nuluurbeeld voordat u twee 24-uursbeelden per goed vastlegt, zoals aangetoond.

Open aan het einde van het experiment de afbeeldingen en een geschikt imaging analyse softwareprogramma en maak een nieuwe laag op het nuluurbeeld. Dubbelklik om de naam van de nieuwe laaglijn van de laag te wijzigen en selecteer het penseel. Wijzig de pixelgrootte in 10 en de kleur in rood en teken twee afzonderlijke lijnen om de kras te schetsen.

De lijnen mogen geen cellen raken. Open de 24-uursafbeelding in de beeldsoftware en selecteer het verhuisgereedschap. Houd de bedieningsknop ingedrukt, klik op zowel de lijnen als de achtergrondlagen, klik in het midden van de nuluurafbeelding en sleep beide lagen naar het midden van de 24-uursafbeelding.

Klik in de 24-uursafbeelding op de achtergrondlaag van nul uur en wijzig de dekking in 50%Houd de besturingselementknop in, klik op zowel de nuluurachtergrond- als lijnlagen en klik op bewerken en vrije transformatie om de lagen vrij te transformeren Met behulp van vrije transformatie, lijnt u de achtergrond van nul uur en lijnafbeelding uit op de 24-uursachtergrondafbeelding, zodat de migratielijnen van het gebied correct worden gepositioneerd in de 24-uursafbeelding. Wanneer de lijnlaag is bedekt, klikt u met de rechtermuisknop om de achtergrondlaag van nul uur te verwijderen. De resterende lijnlaag kan worden gebruikt om het aantal cellen te bepalen dat gedurende 24 uur naar het krasgebied is gemigreerd.

Sla vervolgens de nieuwe migratieafbeelding op als zowel een Photoshop- als een TIFF- of JPEG-bestand. Als u het aantal migrerende cellen wilt kwantificeren, opent u de migratieafbeelding en een programma dat TIFF- of JPEG-bestanden accepteert en telt u handmatig het aantal cellen dat zich tussent en de twee rode lijnen voor beide afbeeldingen voor elke put aanraakt. Noteert vervolgens het aantal migrerende cellen per afbeelding.

Als u het migratiegebied wilt bepalen, opent u de 24-uursafbeelding die de migratielijnen in de beeldsoftware bevat en slaat u de afbeelding op als afbeelding van het migratiegebied. Klik na opslaan op de achtergrondlaag en klik met de rechtermuisknop om de laag te verwijderen. Gebruik het penseel om het gebied tussen de kraslijnen op te vullen, met dezelfde kleur die is gebruikt voor de lijnen en klik op afbeelding, modus en grijsschaal om de afbeelding in zwart-wit te wijzigen.

Sla de afbeelding op en open de afbeelding van het migratiegebied en een geschikt softwareprogramma voor beeldanalyse. Klik op bewerken en omkeren. Als u het migratiegebied wilt bepalen, klikt u op afbeelding, past u aan en drempelwaarde.

Het zwarte migratiegebied wordt rood en het procentengebied wordt aangegeven in het drempelvak. Noteert vervolgens het percentagegebied voor de migratieregel en bevestig dat deze waarde is gekoppeld aan het aantal migrerende cellen voor dezelfde afbeelding. In deze analyse, 46 fibroblasten van niet-diabetische harten en 129 fibroblasten van diabetische harten gemigreerd tijdens de 24 uur durende experimentele periode.

Meting van het migratiegebied zoals aangetoond, bleek dat de niet-diabetische kras gebied maakte 24,78% van het totale gebied gemeten, terwijl de diabetische migratie scratch gebied maakte 16,77% van het totale gebied gemeten. Normalisering op het gebied van migratie zorgt voor een betere en strengere beoordeling van celmigratie en ontkent mogelijke menselijke fouten. Als bijvoorbeeld alleen het aantal gemigreerde fibroblasten wordt vergeleken, lijkt het in deze analyse dat het aantal cellen dat in deze put is gemigreerd, twee keer zo hoog was als dat van de gemigreerde cellen in de tweede put.

Toen het gebied van de kras werd gebruikt om de gegevens te normaliseren, echter, werd de verhouding van de fibroblasten aan het migratiegebied waargenomen om in beide putten bijna het zelfde te zijn. Zorg ervoor dat u het migratiegebied in de 24-uursafbeelding herovert terwijl u het nuluurbeeld hebt vastgelegd. Na deze procedure kan immunohistochemie worden uitgevoerd om eiwitexpressie in de cellen te onderzoeken.

Wij zijn van mening dat deze nieuwere benadering van de scratch migratie test zal zorgen voor meer mogelijkheden van wetenschappelijk onderzoek open te stellen die voorheen niet beschikbaar waren.