Het verkennen van vetweefselstructuur door methylsalicylaatcle clearing en 3D-beeldvorming

Dit protocol maakt analyse van driedimensionale structuur van Zeer grote mens op muis vetweefsel ballet microscopie. Het vergemakkelijken van de koppeling van pathologische disfunctie met vetweefsel structurele veranderingen. Dit clearing proces zijn zeer eenvoudig, zeer goed aangepast aan het opruimen van de mens op warme muizen vetweefsel en gebruik minder giftig oplosmiddel zoals ethanol of methyyl salicylaat in vergelijking met andere duidelijke protocollen.

Begin met het onderdompelen van de geoogste muis of menselijk wit vetweefsel in ten minste 10 milliliter van 4%power formaldehyde in PBS in een 15 milliliter plastic buis bij voorkeur onder een chemische kap. Schud het weefsel op een rolplaat op kamertemperatuur gedurende een uur voordat u de buis 's nachts overzet naar een rolplaat bij vier graden Celsius. Spoel de volgende ochtend het vaste witte vetweefsel in 10 milliliter PBS gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om alle sporen van fixatief te verwijderen en breng het weefsel over op een buis van 15 milliliter met 10 milliliter van 0,3%glycine in PBS voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur op een orbitale shaker bij 100 omwentelingen per minuut.

Wanneer de resterende vrije aldehyde groepen zijn geblust, dompel het weefsel in een 15 milliliter buis met 10 milliliter van 0,2%Triton X-100 in PBS voor een twee uur durende incubatie met schudden op 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie behandel het weefsel met 10 milliliter van 0,2%Triton X-100 en 20%DMSO met schudden bij 37 graden Celsius 's nachts. De volgende ochtend dompel het weefsel onder in een 15 milliliter plastic buis met 10 milliliter van 0,1%Tween 20, 0,1%Triton X-100, 0,1%deoxycholaat en 20%DMSO in PBS voor een minstens 24 uur durende incubatie bij 37 graden Celsius met schudden.

Aan het einde van de incubatie, spoel het weefsel met 10 milliliter van 0,2%Triton X-100 in PBS op een orbitale shaker op 100 omwentelingen per minuut gedurende een uur. Gevolgd door onderdompeling in 15 milliliter van 0,2%Triton X-100, 10%DMSO en 3% BSA in PBS gedurende 12 uur bij 37 graden Celsius met schudden. Voor het beitsen van het witte vetweefsel.

Breng het weefsel over in 300 microliter van 0,2%Triton X-100, 10%DMSO en 3%BSA in PBS, aangevuld met de primaire antilichamen van belang in een 1,5 milliliter microbuis beschermen tegen licht met aluminiumfolie en plaats de buis in een 50 milliliter Falcon buis. Plaats de buis in de orbitale shaker voor een twee daagse incubatie op 37 graden Celsius met schudden. Aan het einde van de incubatie spoel het weefsel twee keer in 10 milliliter van 0,2%Triton X-100, 10%DMSO en 3%BSA in PBS gedurende vijf uur bij 37 graden Celsius met schudden en bescherming tegen licht.

Na de tweede spoeling was het weefsel in 10 milliliter verse 0,2%Triton X-100, 10%DMSO en 3%BSA en PBS gedurende 16 tot 48 uur bij 37 graden Celsius bij schudden, breng het weefsel vervolgens over naar een buis van 1,5 milliliter met 300 microliter van 0,2%Triton X-100, 10%DMSO en 3%BSA in PBS, aangevuld met de juiste secundaire antilichamen en beschermt de buis tegen lichtaluminiumfolie. Na een tweedaagse incubatie bij 37 graden Celsius op een shaker, was het weefsel twee keer in 10 milliliter van 0,2%Triton X-100, 10%DMSO en 3%BSA in PBS gedurende vijf uur bij 37 graden Celsius met schudden beschermd tegen licht. Na de tweede wasbeurt spoel je het weefsel in een buis met 10 milliliter verse 0,2%Triton X-100, 10%DMSO en 3%BSA in PBS gedurende 16 tot 48 uur bij 37 graden Celsius met schudden en lichte bescherming.

Gevolgd door een twee uur wassen in 10 milliliter PBS alleen op 37 graden Celsius met schudden en licht bescherming. Voor witte vetweefsel clearing aan het einde van de PBS wassen dompel het weefsel en 10 milliliter van een stijgende verzendende ethanol concentratie serie voor een twee uur incubatie per concentratie bij kamertemperatuur met schudden beschermd tegen licht zoals aangegeven. De volgende ochtend dompel het weefsel onder in een 20 milliliter glazen fles met een plastic dop met vijf milliliter methyylzilcylaat in een rookkap.

Het witte vetweefsel is nog steeds duidelijk zichtbaar in dit stadium. Schud de container gedurende ten minste twee uur tegen licht bij kamertemperatuur. Het witte vetweefsel wordt volledig transplantatie.

Voor 3D confocale beeldvorming van het glas-in-lood- en wit vetweefsel monteer een metalen beeldkamer uitgerust met een glazen bodem en in een rookkap breng het weefsel naar de kamer. Vul de kamer met verse methyylsalcylaat. Rond de montage van de kamer af door een kleine afdekbrief toe te voegen om het weefsel te stabiliseren en een grote afdekkingslip om de kamer te sluiten.

Plaats de kamer op een omgekeerde confocale microscoop stadium voor weefsel beeldvorming bij lage vergroting tot een paar kubieke centimeter 3D-kaarten van het hele vetweefsel monster te genereren. Gebruik na het genereren van 3D-kaarten een 20X lange afstandsluchtdoelstelling die een goede verhouding biedt tussen de resolutie en diepte om verschillende gebieden te selecteren voor weefselbemonstering bij een hogere vergroting. Voor celsegmentatie converteren 3D-stacks naar de software-indeling om geheugenruimte vrij te maken.

Voordat u de celmodule van de software opent. Wijzig de celdetectie-instelling in plasmamembraankenkening en selecteer het fluorescerende kanaal van de marker die wordt gebruikt om de celperiferie af te bakenen. Stel vervolgens de drempelwaarden in, geef een bereik van de verwachte celformaten en voer de segmentatie uit.

De invloed van clearing op menselijke en muis wit vetweefsel kan worden waargenomen met het blote oog. Clearing verbetert ook drastisch de beelddiepte van het weefsel dat kan worden verworven. En vergemakkelijkt hele weefsel 3D-beeldvorming en 3D-kaart generatie uit 4X Vergroting.

3D mapping maakt het verder mogelijk om verschillende interessegebieden te selecteren bij een vergroting van 20x tot een diepte van twee millimeter. Specifieke kleuring van lipidedruppels en adipocyten kan worden bereikt met behulp van perilipin en anti-GLUT4 antilichamen respectievelijk. Bloedvaten kunnen worden gedetecteerd met behulp van cd31-antilichaam of intraveneuze injectie van Lectin DyLight 649 kort voor het offer.

Macrofagen en T-cellen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van anti CD301 phycoerythrin antilichaam en anti TCR beta Pacific blauwe antilichaam. Het perifere zenuwnetwerk kan worden gedetecteerd met behulp van anti Tyrosine Hydroxylase antilichaam. Met behulp van deze etiketteringen kan dan de gemiddelde grootte en grootteverdeling van de adipocyten en de dichtheid van het bloedvatnetwerk in het vetweefsel worden bepaald.

Het is cruciaal om de bezettingstijd te volgen, zoals aangetoond, omdat een slechte monstervoorbereiding niet zal resulteren in een goede beeldkwaliteit. Dit protocol kan worden gecombineerd met geavanceerde imaging systeem of kan worden gekoppeld aan post-processing image analyse freeware.