Kristallisatie en structurele bepaling van een enzym: substraatcomplex door seriële kristallografie in een veelzijdige microfluïdische chip

Hallo, en welkom bij de laboratoriumarchitectuur en reactiviteit van RNA aan het Instituut voor Moleculaire en Celbiologie in Straatsburg. Het kweken van goed defracterende kristallen is een cruciale stap in elke kristallografische studie. In deze video demonstreren we het gebruik van een nieuw microfluïdisch hulpmiddel om kristallen van een biomolecule te kweken en de 3D-structuur ervan te bepalen door in situ röntgendiffractie.

Het microfluïdische apparaat genaamd ChipX biedt verschillende voordelen. Het is ontworpen om kristallisatiemiddelen te miniaturiseren en te vergemakkelijken volgens de methode van tegendiffusie. De opstelling is eenvoudig en wordt uitgevoerd met standaard labmateriaal.

Het is ook geoptimaliseerd voor de directe karakterisering van kristallen die in de chip worden gekweekt door seriële röntgenkristallografie. ChipX elimineert stappen voor kristalbehandeling en cryokoeling en behoudt de intrinsieke kwaliteit van de kristallen die ter plaatse en bij kamertemperatuur worden geanalyseerd. ChipX heeft het formaat van een microscoopdia, 7,5 bij 2,5 centimeter.

Het bevat acht microfluïdische kanalen die worden gebruikt als kristallisatiekamers met een sectie van 80 bij 18 micrometer en een lengte van vier centimeter. De inlaat aan de linkerkant maakt de handmatige injectie van de biomolecule-oplossing mogelijk die de acht kanalen tot aan de reservoirs zal vullen. Kristallisatieoplossingen worden aan de rechterkant in deze reservoirs afgezet.

De kristallisatie wordt veroorzaakt door een fenomeen dat tegendiffusie wordt genoemd. Wanneer het kristalliserende middel zich verspreidt in de biomolecule-oplossing en een concentratie en een superverzadigingsgradiënt creëert. Labels en bost langs de kanalen helpen de kristallen gemakkelijker te lokaliseren.

Het opzetten van een chip vereist vijf tot zes microliter biomolecule-oplossing bij een typische concentratie van vijf tot tien milligram per milliliter. Eén microliter paraffineolie, vijf microliter kristallisatieoplossing per reservoir en plakband. Het laden van ChipX gebeurt handmatig met een micropipette en standaard tips.

In dit voorbeeld wordt een blauwe monsteroplossing gebruikt voor een betere visualisatie van het injectieproces. Om lekkage te voorkomen, wordt de punt loodrecht op de chip in de monsterinlaat gestoken. Een microliter paraffineolie wordt na het monster geladen om de kanalen van elkaar te scheiden.

De monsterinlaat wordt vervolgens verzegeld met tape. De acht reservoirs worden individueel geladen met vijf microliters kristalliserende agentoplossing. Om dit te doen, wordt de pipettip dicht bij het uiteinde van het kanaal geplaatst onder een hoek van ongeveer 45 graden.

Dit voorkomt de vorming van een luchtbel tussen het monster en het kristalliserende middel. Reservoirs kunnen worden gevuld met cocktails met verschillende buffers, polymeren of zouten, et cetera, voor screening of optimalisatie. Reservoirs zijn verzegeld met tape.

Zoals hier wordt aangetoond, is het instellen van een chip eenvoudig en duurt het slechts een paar minuten. In ChipX vindt kristallisatie plaats door tegendiffusie. Kristalliserende middelen die in de reservoirs worden afgezet, verspreiden zich in de kanalen die het biomolecule bevatten.

Dit creëert gradiënten van concentratie en van superverzadiging die kristallisatie zullen veroorzaken. Dit zijn voorbeelden van kristallen van een enzym verkregen in de kanalen. Ze kunnen groeien om de kanalen te vullen met een doorsnede van 80 bij 80 micrometer.

Kristallen zijn gemakkelijk detecteerbaar in ChipX door fluorescentiemicroscopie met behulp van de natuurlijke fluorescentie van tryptofaanresten onder UV-licht, of zoals hier getoond met behulp van een fluorescerend gelabeld eiwit. Deze sectie toont een Chris telegrafische analyse uitgevoerd bij Zwitserse lichtbron in filaggrins Zwitserland. De chips kunnen zonder extra apparatuur of speciale zorg naar de synchrotron worden gedragen.

Laten we de hal van de Zwitserse lichtbron betreden. Elektronen circuleren in de centrale ring en genereren een breed spectrum van elektromagnetische golven, inclusief röntgenstralen die op verschillende bundellijnen worden uitgebuit. Deze video is opgenomen op X06, een straallijn gewijd aan macromoleculaire kristallografie.

Het protocol kan van de ene synchrotronfaciliteit naar de andere veranderen, maar het algemene principe blijft hetzelfde. ChipX is gemonteerd op een 3D-geprinte houder. Deze houder wordt vervolgens bevestigd aan de magneet van een standaard goniometer.

De seriële analyse consistent het verzamelen van gegevens van een reeks kristallen gekweekt in de chip. Lijsten van kristalposities worden opgesteld met behulp van de labels en bost langs de chipkanalen. Onderzoekers verplaatsen de chip om de kristallen in de röntgenstraal te centreren, gesymboliseerd door het gele venster.

Een snelle centreringsprocedure met behulp van de röntgenstraal wordt gestart. De bundelstop gaat omhoog en de detector beweegt naar het monster. De rasterscreening wordt uitgevoerd om ervoor te zorgen dat het kristal is uitgelijnd met de balk.

Dezelfde procedure wordt herhaald na het draaien van de chip met 30 graden. De tweede stap is belangrijk omdat het spaanmateriaal een parallaxeffect creëert dat leidt tot een verschuiving van het diffractiemaximum ten opzichte van de waargenomen kristalpositie. Zodra het kristal in de straal is gecentreerd, begint de gegevensverzameling.

Deze reeks toont gegevensverzameling in realtime. De chip draait 30 graden. Ondertussen worden overeenkomstige diffractiebeelden verzameld door de detector.

De karakterisering van dit kristal is compleet. De chip vertaald naar het volgende kristal in het kanaal en de hele procedure wordt herhaald. Merk op dat deze analyse ter plaatse wordt uitgevoerd zonder directe behandeling van het kristal en bij kamertemperatuur.

Gegevens die op een reeks kristallen worden verzameld, worden vervolgens samengevoegd om een volledige diffractiegegevensset te verkrijgen die wordt gebruikt om een elektronendichtheidskaart te berekenen, weergegeven in blauw, en om het atoommodel te bouwen. De procedure die in deze video wordt beschreven, werd toegepast in het frame van de structurele karakterisering van het tRNA-modificatie-enzym. Het CCA-toevoegende enzym van de koude aangepaste bacterie, Planococcus halocryophilus.

ChipX werd gebruikt om het enzym te kristalliseren door tegendiffusie in aanwezigheid van ammoniumsulfide als kristalliserend middel. Bij-piramidale kristallen verschenen langs de kanalen, na een paar dagen incubatie bij 20 graden Celsius. De fluorescerende etikettering van het eiwit vergemakkelijkte de identificatie van eiwitkristallen en hun discriminatie van zoutkristallen.

Een reeks kristallen werd ter plaatse en bij kamertemperatuur geanalyseerd. Hun diffractiegegevens werden samengevoegd en leidden tot de kristalstructuur van het APOE-enzym bij een resolutie van 2,5 angstrom. Bovendien werd de diffuse omgeving in chipkanalen benut om een substraat te leveren aan het enzym dat de kristallen opbouwt.

In dit geval werd twee dagen voor de synchrotronanalyse een CTP-analoog aan de reservoiroplossingen toegevoegd. Hierdoor kon de verbinding diffuus worden en de katalytische plaats van het enzym bereiken. Zoals te zien is in de kristalstructuur van het complex bepaald bij een resolutie van 2,3 angstrom.

Het protocol dat in deze video wordt gedemonstreerd, is algemeen toepasbaar en is getest op verschillende biomoleculen. Tot slot is ChipX een Lab-chiptool die alle stappen van een kristallografisch onderzoek integreert en waarmee u van de biomedische oplossing naar de kristalstructuur gaan in een uniek microfluïdisch apparaat. Bedankt voor het bekijken van deze video.

en we hopen dat we u hebben overtuigd van de voordelen van het gebruik van ChipX om de kristalstructuur van uw favorieten door Biomolecule te kristalliseren en te bepalen.