Functionele karakterisering van endogene uitgedrukte menselijke RYR1-varianten

Dit protocol is belangrijk omdat het gebruik maakt van patiëntenmateriaal. Als de patiënt de ziekte heeft, moet het gebruik van hun cellen de biologische reactie van de patiënt nauwkeuriger weergeven. Deze techniek is eenvoudig uit te voeren, eenvoudig en vereist geen geavanceerde apparatuur.

Deze methoden kunnen worden gebruikt voor de diagnose, bijvoorbeeld om te bewijzen dat een RYR1-mutatie de calciumhomeostase functioneel verandert, en om de potentiële therapeutische functie van een verbinding te testen. Afhankelijk van de kennis en technische vaardigheden van de individuele onderzoeker, moeten testexperimenten worden uitgevoerd voordat daadwerkelijke patiëntmonsters worden gebruikt. Om veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie van EBV-getransformeerde B-lymfocyten te controleren, resuspendeert u de vereeuwigde B-cellen met een concentratie van één keer 10 tot de zevende cellen per milliliter in de oplossing van Krebs Ringer en Fura-2 AM tot een uiteindelijke concentratie van vijf micromolair gedurende een incubatie van 30 minuten bij 37 graden Celsius.

Verzamel aan het einde van de incubatie de cellen door centrifugering en resuspend de pellet in verse Krebs Ringer-oplossing met een concentratie van twee keer 10 tot de zesde cel per milliliter. Centrifugeer de cellen vlak voordat u met het experiment begint opnieuw en suspens de cellen snel opnieuw in 1,5 milliliter Krebs Ringer's oplossing aangevuld met 0,5 millimolaire EGTA maar geen toegevoegd calcium. Breng de cellen over naar een glazen, drie milliliter spectrofluorometer cuvette, en noteer de fluorescentieverhouding op een spectrofluorometer uitgerust met een magnetische roerder ingesteld op maximale snelheid en 37 graden Celsius gedurende ongeveer 30 seconden.

Om de calciumafgifterespons in afzonderlijke cellen te beoordelen, plaatst u één keer 106 Fura-2 AM geladen cellen in één milliliter van Krebs Ringer's oplossing aangevuld met één millimolair calciumchloride op individuele poly-L-lysine gecoate glazen afdekselslips en incubeert u de afdekslips bij 37 graden Celsius in een bevochtigde celkweekincubator gedurende 30 minuten. Wanneer de cellen zijn bevestigd, plaatst u een dekselslip in een perfusiekamer en begint u de cellen te perfuseren met een oplossing van twee milliliter Krebs Ringer aangevuld met een stroomsnelheid van één millimolair calcium per minuut. Gebruik een omgekeerde fluorescerende microscoop uitgerust met een 40 keer olie-onderdompelingsobjectief en de juiste filters, registreer online metingen met een softwaregestuurde, opgeladen gekoppelde apparaatcamerabevestiging met intervallen van één seconde, op een vaste belichtingstijd.

Om celstimulatie te bereiken, gebruikt u een celperfusiestimulator met 12 kleppen om de verschillende concentraties agonist toe te voegen. Om myotubes te isoleren van menselijke spierbiopten, spoelt u eerst de biopsie met steriel PBS om overtollig bloed te verwijderen voordat u het weefsel in kleine fragmenten van 0,5 tot één millimeter hakt. Plaats twee tot drie fragmenten in afzonderlijke inserts in elke put van een weefselkweekplaat met zes putjes met 1,5 milliliter menselijk spiergroeimedium per put en 500 microliter medium per insert, en plaats de plaat in de celkweekincubator.

Om veranderingen in calciumexpressie in menselijke myotubes te meten, wanneer multinucleaire myotubes kunnen worden waargenomen, vervangt u de myotube-cultuursupernatanten door vers differentiatiemedium aangevuld met 10 microliter één millimolaire Fura-2 AM voor een incubatie van 30 minuten in de celkweekincubator. Breng aan het einde van de incubatie één glasdekselslipcultuur over naar de perfusiekamer en spoel de cellen met de oplossing van Krebs Ringer aangevuld met calciumchloride van twee millaris. Voer vervolgens online calciummetingen uit zoals aangetoond met behulp van een 20 keer waterdompelingsdoel.

In deze representatieve analyse werd een snelle toename van calcium waargenomen in EBV-vereeuwigde B-lymfocyten na de toevoeging van agonist die in de loop van de tijd langzaam terugviel tot rustniveaus. In een vergelijkbaar experiment veroorzaakte de toevoeging van 400-nanomolaire thapsigargin een grote calciumtransiënt die een piekfluorescentiewaarde van 2,4 willekeurige eenheden bereikte. Deze fluorescentiewaarde werd als 100% beschouwd wanneer de overeenkomstige dosisresponscurve werd geconstrueerd.

In deze analyse werden vereeuwigde B-cellen gedurende 20 seconden gestimuleerd met vijf millimolaire cafeïne, wat resulteerde in een onmiddellijke toename van de fluorescentieverhouding van 340 en 380 nanometer. Voor elke geteste cafeïneconcentratie werd de cafeïne-geïnduceerde piek in de verhouding van 340 bij 380 nanometer fluorescentie berekend en gebruikt om een dosisresponscurve te construeren. Calciumafgifte uit gedifferentieerde myotubes kan ook worden beoordeeld als reactie op blozen met kaliumchloride, verschillende concentraties agonist en / of cafeïne, en normale dosisresponscurven kunnen worden gegenereerd.

Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de cellen correct worden geladen met Fura-2 en dat zowel de golflengten van 340 als 380 nanometer reageren op de toevoeging van de agonist. Intracellulaire calciummetingen met fluorescerende calciumindicatoren kunnen in de meeste zoogdiercellen worden onderzocht en kunnen worden toegepast op de studie van intracellulaire calciumveranderingen als reactie op verschillende stimuli.