Kunstmatige intelligentie benaderingen voor het beoordelen van primaire trilharen

De huidige methoden voor trilharenanalyse zijn arbeidsintensief en gevoelig voor fouten en vertekening. Onze aanpak is erop gericht om tijd en moeite te stroomlijnen en tegelijkertijd potentiële fouten te beperken. Het belangrijkste voordeel dat deze techniek biedt, is verhoogde striktheid en reproduceerbaarheid en kwantitatieve beeldanalyse.

Dit type benadering is niet alleen relevant voor de analyse van trilharen, maar kan ook breed worden toegepast op veel celbiologische vragen, waaronder die welke betrekking hebben op andere organellen en cytoskeletale eiwitten. Open om te beginnen de trainingsset, selecteer bestand in het menu, klik op exporteren importeren en selecteer ND-bestand maken uit bestandsvolgorde. Selecteer de map met de trainingsgegevensset en de lijst met bestanden wordt in het midden van het dialoogvenster geopend.

Definieer handmatig de organisatie van bestanden met ten minste één optie in het vervolgkeuzemenu. Voer de bijbehorende numerieke waarden in onder elke geselecteerde optie en selecteer geen wanneer er geen opties zijn geselecteerd. Klik op Converteren om het ND-document te openen.

Om de afbeelding te kalibreren, klikt u met de rechtermuisknop op de niet-gekalibreerde optie in de linkerbenedenhoek van de afbeelding. Klik op Document kalibreren, klik vervolgens op Pixelgrootte, voer de waarde in en klik op OK. Selecteer weergaveanalysebesturingselementen, open de binaire werkbalk en selecteer automatisch detecteren of tekenobject om trilharen met de hand te identificeren door individuele ciliaire structuren op alle geopende frames nauwkeurig te traceren.

Voor het trainen van de AI selecteert u nis. ai, klik trein segment. ai om het treinsegment te openen.

ai box en selecteer vervolgens het bronkanaal dat moet worden gebruikt voor training. Selecteer de juiste GroundTruth-binaire bestanden om de AI te trainen. Selecteer het vereiste aantal iteraties om de AI te trainen, afhankelijk van de binaire grootte en distributie, selecteer vervolgens de doelmap om het getrainde AI-bestand op te slaan en klik op trainen om de software te trainen. Dit proces duurt enkele uren.

Open de experimentele confocale afbeeldingen van trilharen zoals eerder beschreven door het monster om te zetten. TIF-bestanden naar ND2-bestanden. Selecteer in het pop-upvenster meerdere punten in het eerste vervolgkeuzemenu en voer een waarde in die overeenkomt met het totale aantal afbeeldingen.

Selecteer in de tweede vervolgkeuzelijst golflengte en wijzig de waarde in het totale aantal kanalen in de map. De software ontgrendelt automatisch een golflengteselectievenster, dat zich aan de onderkant, rechterkant van het pop-upvenster bevindt. Gebruik in het golflengteselectievenster het vervolgkeuzemenu kleur om de kleur van elk kanaal te selecteren.

Geef elk kanaal een andere naam onder de naamkolom. Zodra alle informatie is bijgewerkt, klikt u op Converteren. Kalibreer de afbeeldingen zoals eerder beschreven.

Zorg ervoor dat de pixelgrootte van de experimentele gegevensset overeenkomt met die van de trainingsgegevensset. Identificeer trilharen op het eerste kanaal met behulp van de getrainde AI uit de vorige stap. Open nis.

ai selecteer in het menu segment. ai en selecteer vervolgens AC3 in de bronkanalen. Identificeer vervolgens de trilharen op het tweede kanaal door MCHR1 te selecteren in de bronkanalen.

De software tekent binaire bestanden op de gelabelde trilharen. Controleer vervolgens de afbeeldingen op verkeerd geïdentificeerde binaire bestanden. Selecteer object verwijderen op de binaire werkbalk om de verkeerd geïdentificeerde binaire bestanden handmatig te verwijderen.

Zodra de trilharen zijn geïdentificeerd en gesegmenteerd, analyseert u verschillende trilharenparameters, zoals lengtes en intensiteiten, met behulp van de algemene analyse drie tool. Selecteer afbeelding in het menu en klik op nieuw GA3-recept. Er wordt een nieuw venster geopend met een lege ruimte in het midden.

GA3 detecteert automatisch de binaire bestanden die op de juiste manier zijn gelabeld volgens de AI en bevat het bijbehorende knooppunt. GA3 detecteert ook automatisch de kanalen in de afbeeldingen en geeft hun tabbladen weer onder kanalen. De AI segmenteert alle trilharenachtige objecten in het frame en detecteert onvolledige trilharen langs de randen van het frame.

Als u ze wilt verwijderen, selecteert u binaire verwerking, verwijdert u objecten en sleept u het knooppunt met aanraakranden naar de lege ruimte en verbindt u het knooppunt met de juiste binaire bestanden. Als u de lengte van trilharen wilt meten, selecteert u de grootte van het meetobject en vervolgens de lengte. Sleep de parameter naar het midden en maak verbinding met het juiste binaire knooppunt.

Als u trilharenintensiteiten wilt meten, selecteert u een objectintensiteit. Sleep de parameter naar het midden en maak verbinding met het juiste binaire knooppunt en het juiste interessante kanaal. Ga in het meetmenu naar objectratiometrie en selecteer de coëfficiënt van Mander om de colocalisatieroute in GA3 in te stellen door de overlap van twee kanalen binnen individuele trilharen te meten.

Sleep het coëfficiëntknooppunt van de Mander in de lege ruimte en sluit het aan op de juiste binaire en kanalen. Verontschuldig de metingen en de enkele tabel door het menu gegevensbeheer te openen. Selecteer in de basiscategorie de kolom ApEn en klik vervolgens op Nu uitvoeren om trilharen te meten.

Alle metingen worden weergegeven in één uitvoertabel. De representatieve beelden laten zien dat de getrainde AI in vitro trilharen goed identificeerde in de beelden van IMCD-cellen, primaire hypothalamische culturen en hippocampusculturen, maar geen andere niet-ciliaire structuren zoals cytokinetische bruggen. De lengte van de trilharen varieerde van 0,5 tot 4,5 micrometer in IMCD-cellen en twee tot 12 micrometer in de hypothalamische en hippocampuscultuur.

De AI mat de lengtes van AC3 gelabelde trilharen in vivo in de beelden van onze boogvormige kern, paraventriculaire kern en cornu ammonis één regio. Volgens de analyse varieerden hypothalamische trilharen in vivo van één tot 15 micrometer, zoals te zien in witte en bruine balken. Terwijl trilharen en het cornu ammonis-gebied varieerden van één tot 10 micrometer, zoals te zien in grijze balken.

Interessant is dat de intensiteit van de ciliaire MCHR1 sterker was in de paraventriculaire kern dan die in de boogvormige kern. De intensiteiten van MCHR1 tegen AC3 werden uitgezet om hun overlap te meten. De meerderheid van de trilharen was positief voor beide markers, terwijl sommige trilharen positief waren voor AC3 of MCHR1.

Om de colokalisatie van MTHR1 binnen AC3 te kwantificeren, werd de overlapcoëfficiënt van Mander gemeten en was er een significante toename van de overlap in de paraventriculaire kern dan in de boogvormige kern. Om de intensiteit langs de lengte van de trilharen te meten, werd de polariteit van trilharen gedefinieerd met behulp van Centrin2-GFP als de basale lichaamsmarker. Dit maakte het mogelijk om de basis van trilharen te onderscheiden van de uiteinden van ARL13B-M kersenpositieve trilharen.

Veranderingen in ARL13B-intensiteit langs de lengte van trilharen werden waargenomen waarbij de ARL13B-intensiteit hoger was aan de basis dan aan de punt van het cilium in boogvormige kern, gezien aan de linkerkant, evenals PVN, zoals te zien aan de rechterkant. Bij het analyseren van gegevens met deze aanpak is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de kwaliteit en resolutie van de experimentele dataset consistent is met die welke wordt gebruikt om AI te trainen. Het belangrijkste nut van deze aanpak is dat na het detecteren van trilharen door AI, de gebruiker creatief kan zijn over welke eigenschappen worden geanalyseerd door de analyseworkflow aan te passen die in de software is geïntegreerd.