Optische sectie en visualisatie van de tussenwervelschijf van embryonale ontwikkeling tot degeneratie

Degeneratie van de tussenwervelschijf leidt tot een hoge mate van beperking en pijn. Ons protocol stelt ons in staat om morfologisch schijfontwikkeling en de veranderingen in degeneratie te onderzoeken. Het dichte collageen type één netwerk maakt het meestal moeilijk om de tussenwervelschijf te analyseren door middel van microscopie.

Met optische sectioning kunnen we de 3D-opstelling van chondrocyten in de verschillende weefsels onderzoeken. Begin met het plaatsen van intra-operatief verkregen, intervertebrale schijf- of IVD-monsters in DMEM aangevuld met 2 volumevolume penicilline-streptomycine en 1,2 volume volume amfotericine B, onmiddellijk na het verzamelen, bewaar IVD-monsters bij vier graden Celsius tot verdere verwerking. Als ze bevroren zijn, ontdooien de menselijke IVD-monsters bij kamertemperatuur en identificeren ze de oorsprong van het menselijke IVD-weefsel op basis van microscopische eigenschappen zoals collegedichtheid en oriëntatie.

Om het runderschijfweefsel te verzamelen, neemt u het bewegingssegment bestaande uit de IVD met zijn twee aangrenzende wervels en met behulp van een chirurgisch blad nummer 15, ontleedt u de hele runderschijf van het subchondrale bot, draait u de schijf om om de gecentreerde gebieden te bereiken. Na het identificeren van de verschillende delen van het kraakbeen, gebruikt u een chirurgisch mes nummer 20 of 22 om het interessegebied uit de hele schijf te snijden. De IVD's van runderembryo's met een kroon-romplengte kleiner dan 20 centimeter moeten zonder dissectie worden verwerkt.

Uitgevoerde ontkalking van het weefsel zoals beschreven in het manuscript. Bevestig een succesvolle ontkalking als een naald van 20 gauge het schijfweefsel binnendringt, of indien van toepassing de wervels zonder noemenswaardige weerstand. Exact de weefselmonsters in het tienvoudige volume van 4% formaldehyde-oplossing in PBS 's nachts bij vier graden Celsius.

Plaats het weefsel de volgende dag in een in water oplosbaar insluitmedium op de cryotome-knop, zodat een axiale vlak of een vlak dat loodrecht het collageentype snijdt dat normaal gesproken wordt gegenereerd. Gebruik de standaard Cryotome om het ingebedde weefsel te snijden met een dikte van 70 micrometer in menselijke monsters en 40 micrometer in rundermonsters. Verzamel de secties op een glasplaat voordat u de secties drie keer spoelt met PBS, voeg een geschikte fluorescerende kleurstof toe gevolgd door het montagemedium en bedek de secties met een afdekslip.

Plaats een dia met een vlekweefselsectie op de monsterhouder van de florescentiemicroscoop door het structuurverlichtingsapparaat te starten en beeldopnamen met één gezichtsveld uit te voeren met fluorescerende filters en voldoende verlichting. Gebruik een beeldoptimalisatiesoftware die compatibel is met de bloeimicroscoop en verwerk de foto's door de intensiteit en helderheid te optimaliseren. Om de sectie als geheel te visualiseren, gebruikt u de mozaïekbeeldvormingstechniek door de 60 acquisitie-instellingen van het werkbalkpaneel te openen en de mozaïekinstellingen in het mozaïekregister aan te passen.

Om dit te doen, definieert u het aantal kolommen en rijen met gezichtsveldafbeeldingen die later worden samengevoegd tot één overzichtsafbeelding, drukt u op setup en past u de focuscorrectie van afzonderlijke tegels aan. Nabewerk de foto's door de intensiteit en helderheid te optimaliseren. Om de ruimtelijke chondrocytenorganisatie te analyseren, gebruikt u de 3D-functie die in de software is opgenomen door de Z-stack-instellingen aan te passen met de start / stop-knop, definieert u de scanparameters zoals de start- en stopposities in de Z-as en de segmentafstand.

Identificeer individuele cellulaire patronen en gebruik een plug-in voor het aantal cellen voor de kwantitatieve analyse van de cellulaire patronen, bereken de celdichtheid door de getelde cellen te delen door de grootte van het gekozen interessegebied. De architectuur van de IVD met zijn dichte collageenvezelnetwerk in de annulus en de zachtere kern is te herkennen in de mozaïekbeelden genomen in het axiale en sagittale vlak. In uitvergrote gebieden uit de mozaïekafbeeldingen werden verschillende ruimtelijke organisatiepatronen van chondrocyten opgemerkt, zoals enkele cellen, paren en snaren.

De studie van verschillende ontwikkelings- en rijpingsstadia van runderangiofibrose vertoonde een continue afname van de cellulaire dichtheid tijdens de ontwikkeling van de embryonale schijf. Aan de andere kant werden een toenemende cellulaire dichtheid en clustervorming waargenomen in de volwassen menselijke schijf tijdens degeneratie. De celdichtheid in de vroege stadia van de IVD-ontwikkeling in de bovine annulus fibrose en de runderkern pulposus nam snel af tot de geboorte.

Door kanaalbeeldvorming van de IVD met de Epitome konden visualisatie van de 3D-architectuur van de ruimtelijke patronen zoals cytoplasma en de kern, in de intacte IVD enkele en paren van chondrocyten worden gespot. Terwijl in de gedegenereerde anulus celclusters werden gevonden. Het meest uitdagende deel is om het weefsel toe te wijzen aan zijn oorsprong en om het ingebed te corrigeren voor sectie.

Dit is essentieel om betrouwbare resultaten te verkrijgen. Door IVD-weefsel uit verschillende stadia en oorsprongen correct te hebben ontleed en geselecteerd, kunnen we de analyse verdiepen door verdere biochemische en biomechanische analyse, zoals de ELISA of atoomkrachtmicroscopie.