Fluorescentiemicroscopie voor ATP-internalisatie gemedieerd door macropinocytose in menselijke tumorcellen en tumor-xenogetransplanteerde muizen

Kankercellen hebben een opmerkelijk vermogen om voedingsstoffen, zoals ATP, uit de extracellulaire omgeving te internaliseren. Ons protocol stelt ons in staat om ATP-internalisatie aan te tonen en ATP-lokalisatie in cellen te visualiseren. Deze hoge resolutie beeldvorming van geïnternaliseerde ATP, binnen macropynozomen, is ideaal voor het begrijpen van speciale lokalisatie en het voltooien van de hoeveelheid analyse van internalisatie.

Het protocol beschrijft verschillende experimentele toepassingen om ATP-internalisatie te bestuderen. Deze methode kan worden gebruikt om verschillende mechanismen van cellulaire internalisatie te bestuderen, waaronder macropinocytose en exosoom-gemedieerde endocytose. Voor metabole ziekten kan ATP-internalisatie in niet-kankercellen met dit protocol worden bestudeerd.

Om te beginnen zaai je de kankercellen in een kolf van 225 vierkante centimeter, met DMEM aangevuld met FBS en antibiotica. Laat de cellen groeien bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide in de celkweekincubator. Zodra de 80% confluentie is bereikt, maakt u de cellen los en pellett u de losmakende cellen door centrifugatie en resuspendeert u de cellen in ijskoude PBS om de celdichtheid van 5 keer 10 tot de 6 cellen per 100 microliter PBS te bereiken.

Breng de celsuspensie over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Reinig de injectieplaats op de flank van een immunodeficiënte muis met 75% ethanol en veeg overtollige ethanol af met een delicaat taakdoekje. Trek de cellen in een latexvrije spuit van één milliliter, uitgerust met een 27 gauge precisie glijnaald.

Voor subcutane injectie houdt u de naald in een hoek van ongeveer 10 graden ten opzichte van de huid en brengt u de naaldpunt in met de schuine kant naar boven onder de huid, waarbij slechts één tot twee millimeter van de naald buiten de huid wordt gehouden. Doseer de cellen uit de spuit langzaam gedurende ongeveer 10 seconden. Nadat u het volledige volume hebt geïnjecteerd, houdt u de naald drie tot vijf seconden op zijn plaats en trekt u de naald terug.

Oefen gedurende drie tot vijf seconden met de vingers zachte maar stevige druk uit op de injectieplaats om lekken van de geïnjecteerde inhoud te voorkomen. Monitor en meet de tumorgroei met behulp van Vernier-remklauwen, totdat de tumoren een volume van 200 tot 500 kubieke millimeter bereiken. Los 300 microliter van 16 milligram per milliliter fluorescerende dextran en serumvrije DMEM met hoog molecuulgewicht op en incubeer in een waterbad, getemperd bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten, centrifugeer vervolgens de dextran-oplossing en breng het supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.

Bij 40 microliter, een één millimolaire niet-hydrolyseerbare fluorescerende ATP analoge voorraad tot 160 microliter serumvrije DMEM, om een 0,2 millimolaire niet-hydrolyseerbare fluorescerende ATP-oplossing te maken. Bereid de behandelingsoplossingen van DMEM of acht milligram fluorescerend dextran met hoog of laag molecuulgewicht per milliliter, met of zonder 100 micromolaire niet-hydrolyse fluorescerende ATP in DMEM, door de eerder bereide stamoplossingen te mengen. Gebruik een spuit van één milliliter om 50 microliter van één behandelingsoplossing te verzamelen.

Injecteer de oplossing rechtstreeks in de xenografttumor en herhaal gedurende vier biologische replicaties van elke behandeling. Na het euthanaseren van de muis en het isoleren van het tumorweefsel, gebruikt u een geperforeerde lepel om het gereseceerde tumorweefsel op te scheppen en plaatst u het weefsel onmiddellijk in een vriesmedium en rolt u het weefsel, zodat het weefsel ondergedompeld blijft in het medium baden, alle weefseloppervlakken. Plaats het weefsel voorzichtig in de insluitvorm met het vriesmedium.

Plaats de bijbehorende labeltag verticaal in het vriesmedium of de mal en zorg ervoor dat het geschreven label buiten het medium zichtbaar is. Wanneer het vriesmedium ondoorzichtig wit wordt, verwijdert u het weefselblok uit de mal, plaatst u het weefselblok op droogijs en herhaalt u het bevriezen voor elke tumorsectie. Bewaar de weefselblokken bij min 80 graden Celsius gedurende enkele maanden vóór de cryosectieprocedure.

Na het maken van de dia's van de weefselblokken, fixeert u de weefselsectieglaasjes gedurende vijf minuten in 95% ethanol bij min 18 graden Celsius. Was het vaste gedeelte met PBS gedurende vijf minuten. Voeg 10 tot 50 microliter van een waterig montagemedium met DAPI toe aan de weefselsecties, afhankelijk van de grootte van de secties, en plaats een glazen afdekselslip over het weefselgedeelte.

Na 12 tot 24 uur montage identificeert u interessante gebieden van de vaste tumorsecties en verkrijgt u de beelden met behulp van fluorescentiemicroscopie zoals eerder aangetoond. Na twee tot 24 uur van de fixatie van de menselijke tumorcel en het staan met DAPI, leg je de beelden vast met behulp van een epifluorescentiebeeldvormingssysteem en data-acquisitiesoftware. Plaats de dia op het podium van een rechtopstaande epiflorescentiemicroscoop in binoculaire modus.

Open het beeldvormingsprogramma, selecteer het 10-voudige objectief en pas het podium aan om de focus te definiëren. Scan de dia van links naar rechts op een kronkelige manier om de interessegebieden te identificeren. Selecteer het 40-voudige objectief en gebruik de schakelaar op de microscoop om over te schakelen van binoculair naar beeldopnamemodus.

Klik op het pictogram voor livekwaliteit om de afbeeldingen te bekijken en vervolgens te verkrijgen. Gebruik het deelvenster OC op de acquisitiewerkbalk om de belichtingsparameters voor elke filterkubus of fluorescerend kanaal te definiëren en gebruik vervolgens de werkbalk voor acquisitie met meerdere kanalen om een afbeelding met drie kanalen te verkrijgen met de gedefinieerde belichtingsinstellingen. Als alternatief kunnen afbeeldingen met meerdere kanalen handmatig worden verkregen door tussen de filterkubussen te schakelen, de belichtingstijd in te stellen, de sluiter tussen beeldacquisitie voor elk kanaal te sluiten of te openen en elke afbeelding die voor afzonderlijke kanalen is gemaakt, te bedekken.

Sla de afbeelding op als nd2-bestand. Sla de TIF-bestanden op, inclusief de samengevoegde kanaalafbeelding en afzonderlijke kanaalafbeeldingen. Gebruik de functie voor het tellen van objecten op de werkbalk annotaties en metingen om het aantal NHF-ATP, TMR fluorescerende dextran met hoog molecuulgewicht en TMR fluorescerende dextran-positieve cellen met laag molecuulgewicht te tellen op een opgeslagen nd2-afbeeldingsbestand en exporteer de gegevens naar een spreadsheet via het analyseprogramma.

Dit protocol is ontwikkeld voor ruimtelijke, temporele en kwantitatieve analyse van de cellulaire internalisatie van niet-hydrolyseerbare ATP. De intracellulaire internalisatie van niet-hydrolyseerbare fluorescerende ATP werd aangetoond door colokalisatie van niet-hydrolyseerbare fluorescerende ATP met fluorescentie dextran met hoog of laag molecuulgewicht in vitro, ex vivo en in vivo. Om ervoor te zorgen dat tumorcellen geïnternaliseerde ATP behielden, beperkte experimentele tijd voor alle intratumorale injectie tot cryo-inbedding.

Houd ook rekening met intratumorale variatie door weefsel in de tumor af te beelden. Toekomstige iteraties van onze methode kunnen real-time visualisatie van het E-ATP internaliserende proces omvatten, waarbij informatie over macropynocytotische kinetiek en handel in specifieke weefsels wordt onthuld.