Directe stochastische optische reconstructiemicroscopie van extracellulaire blaasjes in drie dimensies

Dit protocol maakt gebruik van superresolutiemicroscopie, met name directe stochastische optische reconstructiemicroscopie, ook bekend als dSTORM, om de diffractielimiet te omzeilen en EV's met nanometerprecisie in drie dimensies te visualiseren. Een opmerkelijk voordeel van dSTORM is het vermogen om deeltjes onder het diffractieniveau van licht direct te visualiseren zonder stappen te beschadigen die de biochemische aard van de EV veranderen. Veel evolutionair verschillende virussen maken gebruik van EV-signalering, daarom kan dSTORM worden gebruikt om EV's te karakteriseren voor ziektebiomarkers en progressie, en om individuele virusdeeltjes, zoals SARS-CoV2, te visualiseren. Begin met het plaatsen van affiniteitsgezuiverde, extracellulaire blaasjes of EV's op platen met glazen bodem, microslide, acht putten in een totaal volume van 200 microliter en laat ze zich 's nachts bij vier graden Celsius aan het oppervlak hechten.

Zonder de bestaande oplossing van de achtputige plaat te verwijderen, bevestigt u EV's op de platen door 200 microliter 4% paraformaldehyde in 1X PBS toe te voegen aan de EV-bevattende oplossing in elke put en laat u de platen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Verwijder zorgvuldig paraformaldehyde en overtollige oplossing met een micropipette om de EV's niet te storen. Was de EV met 1X PBS om overtollig paraformaldehyde te verwijderen.

Voer de wasprocedure drie keer uit. Verwijder overtollige 1x PBS. Bereid 250 microliter dSTORM Bcubed-bufferoplossing per monster door een oplossing van vijf millimolair protocatechuic dioxygenase verdund in beeldvormingsbuffer te maken volgens het protocol van de fabrikant.

Voeg 250 microliter van de voorbereide buffer toe aan elke put volgens het protocol van de fabrikant en incubeer de platen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur voordat u zich afbeeldt om oxiderende moleculen op te ruimen. De EV's kunnen direct worden gevisualiseerd of een week lang bij vier graden Celsius worden opgeslagen. Om de kralen voor te bereiden die nodig zijn voor de kalibratie van de superresolutiemicroscoop, verdunt u microsferen van 100 nanometer tot een concentratie van 0,5% in water van moleculair biologische kwaliteit en pipetteert u 200 microliter in elke put van een glasbodem, microslide, acht-well plaat.

Laat de kralen een uur bij kamertemperatuur in de putten bezinken. Voeg zonder de bestaande oplossing te verwijderen 200 microliter 4% paraformaldehyde in PBS toe aan elke put aan de kalibratiepareloplossing en laat 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Verwijder de paraformaldehyde voorzichtig met een micropipette om de kralen niet te storen en was de kralen drie keer met 1X PBS.

Bereid de buffer voor zoals beschreven in het manuscript. Verwijder 1X PBS en voeg 250 microliter van de voorbereide buffer toe aan elke put. Laat de buffer 20 minuten zitten voordat u de visualisatie maakt.

Gebruik de knop De microscoop verbinden om verbinding te maken met de 3D-microscoop voordat u iets op het podium plaatst. Voeg 100X olie toe aan het objectief en plaats het midden van de put bovenop het objectief. Schakel in de instelling Acquire de excitatielasers van 473 en 640 nanometer in en klik op Weergeven.

Zonder de 3D-lens te activeren, bekijkt u de kralen onder de instelling voor fotonenverzadiging door te klikken op Het aantal fotonen in de opties voor beeldweergave. Stel de initiële laservermogens in op 8,4 milliwatt voor de 473-nanometerlaser en 11,6 milliwatt voor de 640-nanometerlaser. Verlaag de focus van de laser tot ongeveer min 300 nanometer of het brandpuntsvlak van de kalibratieparels om een duidelijke resolutie van de afzonderlijke kralen te produceren.

Zodra het Z-vlak is scherpgesteld, past u de laservermogensniveaus verder aan om rekening te houden met variatie in elk gezichtsveld. Onder de instrumentfuncties, volledige 3D-mappingkalibratie en kanaaltoewijzingskalibratie om de fouten op de X-, Y- en Z-as te verkrijgen. stel het maximale aantal gezichtsvelden in op 20, het doelaantal punten op 4.000, de maximale afstand tussen kanalen op 5,0 pixels en de uitsluitingsradius tussen kanalen op 10,0 pixels tijdens de kalibratie van kanaaltoewijzing.

Zorg ervoor dat de kalibratie een puntdekking van meer dan 90% oplevert en een kaartkwaliteit die goed is. Sla de gegeven kalibratiegegevens op voor toekomstige beeldacquisities. Voeg 100X olie toe aan het objectief en plaats de voorbereide EV's op de microscoop.

Zonder de 3D-lens te activeren, schakelt u de excitatielaser van 640 nanometer in en verhoogt u deze in eerste instantie tot tussen 1,2 en 12,5 milliwatt, afhankelijk van de intensiteit van het signaal in het gezichtsveld om het rode membraan te prikkelen, intercalerende, met kleurstof bevlekte EV's. Schakel onder de opties voor beeldweergave de weergavemethode over van fotonenverzadiging naar percentielen om de EV's beter te visualiseren. Pas het laservermogen aan om ruis te minimaliseren terwijl het signaal wordt gemaximaliseerd en alle andere parameters worden gehandhaafd.

Pas de focus van het Z-vlak aan door op het pictogram omhoog of omlaag op de Z-as te klikken. Stel de belichtingstijd in op 20 milliseconden, de frameopname op 10.000 frames en het initiële laservermogen op tussen 1,2 en 12,5 milliwatt, afhankelijk van de intensiteit van het signaal en het gezichtsveld. Activeer de 3D-lens met behulp van het pictogram en start de acquisitie door op de knop Verwerven te klikken.

Verhoog tijdens het beeldacquisitieproces het laservermogen met drie stappen van 10 om de 1000 frames, of genoeg om een hoge signaal-ruisverhouding te behouden. Pas het Z-vlak niet aan tijdens de aanschaf. Schakel na de afbeeldingsacquisitie over naar het weergavevenster Analyseren.

Voer afwijkingscorrectie uit op de ongefilterde afbeelding en activeer vervolgens filters. Pas het aantal fotonen, lokalisatieprecisie, sigma's en frame-index aan, zoals vermeld in het manuscript. Leg een X-, Y-, Z-plane view-tool over de X-as van individuele EV's vanuit het gezichtsveld en exporteer de afzonderlijke csv-bestanden van fotoswitching-gebeurtenissen.

Bisect individuele EV's op de X, Y-as in een X bij Y gezichtsveld met behulp van een lijn histogram tool, die fotoswitching gebeurtenissen in ingestelde afstandsgroepen pint. Maak afbeeldingen van afzonderlijke EV's en sla ze op als tif-bestanden. Maak 3D-video's van individuele EV's met behulp van een 3D-visualisatietool en kleur op basis van plaatsing langs de Z-as.

Na de kalibratie van de microscoop die een gemiddelde fout van 16 nanometer op de X-, Y-as en 38 nanometer op de Z-as produceerde, werden de gezuiverde U20s EV's met succes gevisualiseerd met een resolutie van maximaal 20 nanometer op de X-, Y-as en 50 nanometer langs de Z-as. Individuele EV's gevisualiseerd via dSTORM in 3D-fotogeschakeld gedurende de belichting van 10.000 frames naarmate het laservermogen werd verhoogd, en waren gemakkelijk zichtbaar in het verkregen beeld. Post-acquisitie beeldcorrectie in het Z-vlak, fotonentellingen, sigma's en lokalisatieprecisie van het gereconstrueerde beeld resulteerden in een duidelijke resolutie van de EV in 3D.

De EV-foto wisselde alleen tijdens de eerste 7.000 frames, zoals te zien is door de legende in de rechterbovenhoek. Het histogram bevestigt dat de meerderheid van de fotoswitching-gebeurtenissen plaatsvond binnen een straal van 100 nanometer, wat bevestigt dat de gevisualiseerde EV een exosoom is en dat de isolatie van EV's met een kleine diameter succesvol was. Grootteverdelingsanalyse uitgevoerd op andere individueel getraceerde EV's met behulp van de Tool Line Histogram en de X, Y, Z-plane View-tool bevestigde dat de meeste fotoswitchinggebeurtenissen plaatsvonden binnen een straal van 100 nanometer van het centrum.

De fout langs de Z-as werd vergroot, waardoor een langwerpig eindbeeld van de EV langs de axiale as ontstond. Fotoswitchinggebeurtenissen waren niet gecorreleerd met de EV-grootte, wat aantoont dat dSTORM-gebaseerde karakterisering kan worden gebruikt voor kleine EV's zoals exosomen en kleine, omhulde virussen met een diameter van minder dan 100 nanometer. Tijdens het uitvoeren van dSTORM is het belangrijk om te onthouden om het initiële laservermogen zeer laag in te stellen en langzaam te verhogen tijdens de beeldacquisitie om fotobleeken te voorkomen.

Sinds de ontwikkeling heeft dSTORM onderzoekers in staat gesteld om de morfologie van subcellulaire structuren beter te begrijpen die voorheen onmogelijk te visualiseren waren vanwege de diffractielimiet van typische lichtmicroscopie.