High-throughput totale interne reflectie fluorescentie en directe stochastische optische reconstructie microscopie met behulp van een Photonic chip

Het belangrijkste doel van dit manuscript is om een beeldvormingsprocedure te presenteren van nieuw ontwikkelde fotonische chipgebaseerde TIRF-microscopie en single-molecule localisation microscopie, zoals dSTORM. De belangrijkste component hier is de fotonische chip die zijn gemaakt van de serie van optische waveguide. Het licht in de optische golfgeleider wordt geleid op basis van totale interne reflectie.

Een deel van het licht is aanwezig op het oppervlak in de vorm van de evanescente golven. Die evanescente golven vergaan exponentieel weg van het oppervlak, met een penetratiediepte van een paar honderd nanometer. Dit maakt ze geschikt voor TIRF verlichting.

TIRF verlichting via de optische waveguide is beschikbaar over een extreem groot gebied, dat wordt gedefinieerd door de waveguide geometrie, en is dus bij uitstek geschikt voor high-throughput imaging. Het belangrijkste verschil tussen een traditionele TIRF en dSTORM setup in vergelijking met onze aanpak is dat we een fotonische chip gebruiken om het monster te verlichten, in plaats van het verzenden van licht door middel van een imaging objectieve lens. Onze aanpak ontkoppelt verlichting en het collectielichtgedeelte, waardoor nieuwe beeldmogelijkheden ontstaan.

Plaats de chip in de glazen Petri schotel met behulp van een wafer pincet, en bedek volledig met een 1%Hellmanex oplossing. Plaats de petrischaal gedurende 10 minuten op een kookplaat op 70 graden. Terwijl nog op de kookplaat, wrijf het oppervlak met een cleanroom weefsel wattenstaafje.

Haal de chip uit de petrischaal. Spoel af met ten minste 100 milliliter gedeioned water. Spoel af met ten minste 100 milliliter isopropanol, waarbij het oplosmiddel niet droogt op het oppervlak om verdampingsvlekken te voorkomen.

Spoel af met ten minste 100 milliliter gedeioned water. Blaas de chip droog met een stikstofpistool. Bereid een latere van 150 micrometer PDMS door het draaien in een petrischaaltje.

Gebruik een scalpel om een frame van ongeveer 1,5 bij 1,5 centimeter uit de PDMS-laag te snijden. Til het frame met een pincet uit de petrischaal. Deponeren plat op een schone en gepolijste chip.

Het monster is nu klaar voor celzaaien. Verwijder na het zaaien van cellen de chip uit de media. Gebruik een pipet om overtollige vloeistof van buiten de PDMS-kamer te verwijderen.

Verwijder de huidige vloeistof uit de PDMS-kamer met een pipet en voeg ongeveer 60 microliters tegelijkertijd schone PBS toe. Vervang de PBS door 60 microliters schone PBS, en laat het incubeer voor een minuut. Herhaal de vorige stap, laat het uitbroeden voor vijf minuten deze keer.

Verwijder de PBS en vervang deze door 60 microliter van de kleurstofoplossing. Laat het monster ongeveer 15 minuten uitbroeden en bescherm het tegen licht. Was het monster met PBS met behulp van de eerder beschreven procedure.

Verwijder de PBS en vervang deze tegelijkertijd door 40 microliter van de beeldbuffer. Plaats er een afdekkenlip op, waardoor luchtbellen zich niet onder vormen. Druk voorzichtig op de coverslip tegen de beeldkamer om overtollige media te verwijderen.

Gebruik een pipet om overtollige media buiten de coverslip te verwijderen. Reinig het gebied buiten de coverslip met een watervochtig uitstrijkje om kristallen gevormd door gedroogde onderdompelingsresten te voorkomen. Deze versie van de setup bestaat uit drie hoofdcomponenten.

De microscoop met de filterhouder, witte lichtbron, camera en objectieve revolver. De koppelingsfase, een drieassige piëzofase, met een met vezels gekoppelde laser en een koppelingslens. De monsterfase, een handgeschakelde fase van één as, met punt en kantelen, met een vacuümhouder.

Zowel de koppeling als de monsterfase zijn gemonteerd op een tweeassig gemotoriseerd stadium voor voorbeeldvertaling. Plaats de chip op de vacuümwagen, met het koppelingsfacet naar de koppelingsdoelstelling. Zorg ervoor dat de chip ongeveer één brandpuntsafstand verwijderd is van de koppelingsdoelstelling.

Zet de vacuümpomp aan. Zet de laser op een milliwatt. Pas de spaanhoogte ruwweg aan zodat de balk de rand ervan raakt.

Zet de laser uit. Zet de witte lichtbron aan. Kies een objectieve lens met een lage vergroting, bijvoorbeeld een 10x.

Richt de microscoop op een waveguide. Vertaal de microscoop langs de waveguide om te zien of het goed is uitgelijnd met het optische pad. Verplaats de microscoop naar de koppelingsrand.

Zet de laser op een milliwatt of minder. Vertaal de microscoop langs de koppelingsrand om het laserlicht te vinden. Richt de balk op de spaanrand.

Pas de koppelingsfase langs het optische pad in de richting die de hoogte van de laserstraalvlek vermindert totdat deze verdwijnt. De balk bevindt zich nu boven of onder het spaanvlak. Pas de hoogte van de koppelingsfase aan totdat de balkvlek weer verschijnt en wordt gemaximaliseerd.

Herhaal de twee vorige stappen totdat de laser vormt een gerichte plek. Verplaats de gerichte plek naar de waveguide van belang. Vertaal de microscoop op korte afstand van de rand, zodat de gerichte balkvlek niet meer zichtbaar is.

Doe het witte licht uit. Pas het contrast aan. Als de waveguide wordt geleid, moet het verspreide licht langs de waveguide duidelijk zichtbaar zijn.

Pas de as van de koppelingsfase aan om de verstrooide lichtintensiteit te maximaliseren. Zet de laser uit. Zet het witte licht aan.

Pas indien nodig het contrast aan. Navigeer naar de beeldvormingsregio. Focus met de gewenste imagine doelstelling.

Doe het witte licht uit. Steek het fluorescentiefilter in en zet de laserkracht op één milliwatt. Stel de belichtingstijd van de camera in op ongeveer 100 milliseconden.

Pas het contrast indien nodig aan. Zorg ervoor dat de koppeling nog steeds geoptimaliseerd is. Zoek een regio van belang voor beeldvorming.

Schakel de piëzo-faselusing in om knooppunten gemiddeld uit te schakelen. Leg ten minste 300 beelden vast. Laad de vastgelegde beeldstack naar Fiji met behulp van een virtuele stack.

Kies Stapels en Z Project in het afbeeldingsmenu in Fiji. Bereken de TIRF-afbeelding door projectietype Gemiddelde intensiteit te kiezen. Zet de laser op een milliwatt en stel de belichtingstijd van de camera in op 30 milliseconden.

Pas het contrast en de focus aan. Verhoog het laservermogen totdat knipperen wordt waargenomen. Zoom in op een klein gebied van het voorbeeld.

Pas het contrast aan. Leg een paar beelden vast om te zien of de knipperlichten goed gescheiden zijn. Pas de belichtingstijd van de camera aan voor optimaal knipperen.

Schakel de piëzo-faselus in. Neem een afbeeldingsstapel van ten minste 30.000 frames op, afhankelijk van de knipperende dichtheid. Open Fiji en laad de dSTORM-stack als virtuele afbeeldingen.

Pas indien nodig het contrast aan. Gebruik het rechthoeksgereedschap om het gebied te selecteren dat u wilt reconstrueren. Open Run-analyse in de ThunderSTORM-plug-in in Fiji.

Stel de basiscamera-instellingen in thunderstorm in, die overeenkomen met uw apparaat. Resterende standaardparameters zijn meestal bevredigend. Begin met de reconstructie.

De lokalisatielijst van de reconstructiesoftware wordt gefilterd om niet-specifieke lokalisaties te verwijderen. Indien nodig wordt een extra driftcorrectie toegepast. Het belangrijkste verschil tussen chip-based imaging en traditionele beeldvorming zit hem in de instrumentatie en data-acquisitie.

De kwaliteit van de gereconstrueerde beelden kan dus op dezelfde manier worden beoordeeld als een afbeelding van een commerciële superresolutiemicroscoop. Aangezien golfgeleiders in meerdere modus's worden gebruikt, kan het resulterende beeld echter inhomogene opwinding vertonen als er te weinig afbeeldingen worden verzameld. Dit wordt weergegeven in paneel a.

Het verhogen van de hoeveelheid excitatiepatronen moet resulteren in inhomogene opwinding, zoals blijkt uit paneel b. Hier hebben we afgebeeld lever sinusoïdale endotheelcel, met fluorescerend gelabeld plasmamembraan. Panelen a en b zijn diffractie-beperkte beelden.

Paneel c toont een diffractie-beperkt beeld van de inzet in paneel b. Paneel d toont een dSTORM-afbeelding van dezelfde regio. Lever sinusoïdale endotheelcellen hebben nano-sized fenestraties in hun plasmamembraan, die duidelijk zichtbaar zijn in de super-resolutie beeld in paneel d.

Een van de belangrijkste voordelen van chip-gebaseerde super-resolutie imaging is het grote gezichtsveld dat haalbaar is. Paneel a toont een 500 micron bij 500 micron-grote dSTORM beeld van lever sinusoïdale endotheelcellen met fluorescerend gelabelde microtubbulin. Paneel b toont de magenta inzet van paneel a, met zowel diffractie-beperkte en super-resolutie beelden voor vergelijking.

Paneel c toont de groene inzet van paneel a. De resolutie van het vastgelegde beeld is 77 nanometer. In deze video hebben we uitgevoerd groot gezichtsveld TIRF en dSTORM beeldvorming van lever sinusoïdale endotheelcellen met behulp van een fotonische chip voor verlichting.

Onze methode is minder complex, compacter en flexibeler dan de conventionele manier van uitvoeren van TIRF met behulp van een microscoopdoelstelling van een vooraf bepaald numeriek diafragma en een laag gezichtsveld. Lokalisatiemicroscopie, zoals dSTORM, is een van de verschillende beeldvormingstechnieken met superresolutie die we hebben onderzocht met behulp van fotonische chip. Bijvoorbeeld, licht kan veel meer strak worden beperkt in een hoog-brekings-index optische waveguide materiaal dan het mogelijk is met behulp van een imaging objectieve lens.

Deze eigenschap van chip verlichting heeft gevonden toepassing in het verhogen van de resolutie van intensiteit-fluctuatie-gebaseerde optische microscopie methode en gestructureerde verlichting microscopie. Daarnaast profiteren fotonische chips ook van miniaturisatie, kosteneffectiviteit en een eenvoudige optische setup. Als geïntegreerde technologie maakt het compatibel met andere on-chip optische functies.

Alles bij elkaar maakt dit het mogelijk om in conventionele diffractie-beperkte microscopen om te bouwen, waardoor superresolutie tegen lage kosten mogelijk is.