Ontwikkeling van een mobiel laboratorium voor mitochondriale fysiologie voor het meten van mitochondriale energetica in het veld

De ontwikkeling van een mobiel mitochondriaal laboratorium stelt fysiologen in staat om hun werk in het veld te brengen, en als gevolg daarvan kunnen ze een fascinerende diversiteit aan energetische uitdagingen evalueren die dieren vertonen. Gevangenschap is stressvol voor veel dieren, dus met een mobiel lab kunnen we nu het lab naar de dieren brengen in plaats van de dieren terug te brengen naar het laboratorium. Met de mogelijkheid om mitochondriale ademhaling in het veld te isoleren en te meten, kunnen technieken die voornamelijk door de biogeneeskunde werden gebruikt, nu worden gebruikt in ecologische en evolutionaire context.

Begin met het parkeren van het mobiele laboratorium op een vlakke ondergrond, zet vervolgens de generator aan en zet het voertuig waterpas. Schuif de schuif uit voordat u de apparatuur opzet. Ga verder met het instellen en kalibreren van de mitochondriale ademhalingskamers op de gewenste temperatuur van experimenten en de huidige barometrische druk volgens de instructies van de fabrikant.

Gebruik een gesneden pipetpunt van vijf milliliter om het gehakte weefsel over te brengen naar een centrifugebuis van 50 milliliter en homogeniseer het weefsel gedurende vijf seconden met een mes op 50% vermogen. Om het weefsel te verteren, voegt u gedurende zeven minuten vijf milligram protease per gram natte spier toe en mengt u de oplossing elke 30 seconden. Beëindig de reactie door een gelijk volume van de isolatiebuffer met BSA toe te voegen.

Centrifugeer vervolgens het homogenaat bij 500 G gedurende 10 minuten, breng vervolgens het supernatans over met behulp van een gesneden pipetpunt van vijf milliliter door de dubbellaagse kaasdoek in een schone centrifugebuis van 50 milliliter en centrifugeer vervolgens het gefilterde supernatans bij 3.500 G gedurende 10 minuten om een bruine mitochondriale pellet neer te slaan. Voeg na het weggooien van het supernatant hetzelfde volume van de isolatiebuffer met BSA toe aan de centrifugebuis en resuspendeer de mitochondriale pellet met een flexibele schraper door de mitochondriale pellet voorzichtig van de wanden van de centrifugebuis te werken en centrifugeer de buis vervolgens gedurende 10 minuten bij 3.500 G. Resuspendeer de pellet in de isolatiebuffer zonder BSA om de centrifugatiestap te herhalen zoals eerder beschreven.

Na de tweede centrifugatie resuspendeert u de mitochondriale pellet in de resuspensiebuffer met een schone, flexibele schraper en brengt u de geresuspendeerde mitochondriën over in een Dounce-homogenisator met een gesneden pipetpunt van één milliliter. Homogeniseer met de homogenisator voorzichtig de mitochondriale suspensie met vier tot vijf passages. Gebruik een vers gesneden pipetpunt van één milliliter om de gehomogeniseerde mitochondriale suspensie over te brengen in een gelabelde microcentrifugebuis van twee milliliter.

Voeg voor de mitochondriale ademhalingsmetingen van de complexe substraten 945 microliter van de ademhalingsbuffer toe aan de mitochondriale ademhalingskamer. Zorg ervoor dat de roerder draait wanneer de buffertemperatuur op 37 graden Celsius wordt gehouden. Sluit de kamer af met de bovenkant en begin met het opnemen van de gegevensverzameling.

Nadat de zuurstofconcentratie is gestabiliseerd, voegt u 20 microliter van de mitochondriale suspensie toe aan de kamer en plaatst u het deksel. Geef in de software aan dat de mitochondriën aan de kamer zijn toegevoegd. Voeg 10 microliter van elk één molair glutamaat, 200 millimolair malaat en 200 millimolair pyruvaat toe aan de kamer met de afzonderlijke spuiten en wacht tot het signaal stabiliseert voordat u de toegevoegde substraten in de software aangeeft.

Gebruik een aparte spuit om vijf microliter adenosinedifosfaat of ADP aan de kamer toe te voegen. Geef de toegevoegde ADP in de software aan en observeer het snelle zuurstofverbruik van toestand drie. Nadat de ademhaling en het mitochondriale zuurstofverbruik in toestand drie gedurende vier minuten zijn vertraagd om de ademhaling in toestand vier aan te geven, beëindigt u de opname en slaat u het gegevensbestand op.

Herhaal de procedure voor de complexe twee substraten door 963 microliter van de ademhalingsbuffer aan de kamer toe te voegen. Na het toevoegen van 20 microliter van de mitochondriale suspensie, voegt u achtereenvolgens twee microliter van vier microgram per microliter rotenon en 10 microliter 500 millimolair succinaat toe aan de kamer met behulp van de afzonderlijke spuiten. Wanneer het signaal stabiliseert, geeft u de substraattoevoeging in de software aan.

Met de toevoeging van vijf microliter ADP, observeer het snelle zuurstofverbruik van toestand drie en geef de toevoeging van ADP in de software aan. Nadat de ademhaling en het mitochondriale zuurstofverbruik in toestand drie gedurende vier minuten zijn vertraagd om de ademhaling in toestand vier aan te geven, beëindigt u de opname en slaat u het gegevensbestand op. De representatieve resultaten geven de ruwe mitochondriale ademhalingsgegevens aan.

De steile helling van stap drie in de complexe substraten vertegenwoordigt de hoge maximale ademhalingsfrequentie. De succesvolle isolatie van de mitochondriën van de skeletspieren van de achterpoten werd waargenomen door de scherpe bocht en de stabilisatie van een nieuwe helling van toestand vier. Een soortgelijk patroon kon worden waargenomen voor complexe twee aangedreven mitochondriale ademhaling.

De slechte werking van de mitochondriën resulteerde in de koppeling van de mitochondriën voor de complexe mitochondriale ademhaling. Een ander typisch voorbeeld van slecht functioneren van mitochondriën toonde echter de ontkoppelde complexe twee mitochondriale ademhaling met een vlakke lijn na de toevoeging van ADP, en geen beurt om de toestand vier gegevens te produceren. De numerieke waarden van toestand drie, toestand vier en de respiratoire controleratio, of RCR, voor zowel complex één als complex twee werden bepaald op basis van de ademhalingsmeetgegevens Tijdens het verzamelen kunnen extra weefsels snel worden ingevroren om ze in de toekomst te gebruiken voor het meten van mitochondriale dichtheid of oxidatieve schade.

Bovendien kunnen na de procedure ook geïsoleerde mitochondriën worden ingevroren om de activiteiten van elektronentransport en ketencomplexen te meten. Het vermogen om mitochondriale ademhaling in het veld te isoleren en te meten, zal de weg vrijmaken om ons begrip van de rol van mitochondriën in de evolutie van complex leven te verbeteren.