Monstervoorbereiding en relatieve kwantificering met behulp van reductieve methylering van amines voor peptidomics-studies

Hier beschrijven we een instructiemethode op basis van een snelle warmte-inactivatie van protease om natuurlijke intracellulaire peptiden te behouden, afbraak in cellen en weefsels te voorkomen, gevolgd door relatieve kwantificering van peptiden met behulp van isotopische etikettering. Deze etiketteringsmethode heeft zoveel voordelen. De reagentia zijn commercieel verkrijgbaar, goedkoop, chemisch stabiel en maken de analyse van maximaal vijf monsters in één serum mogelijk.

Begin met het cultiveren van menselijke neuroblastoomcellen in een schaal van 15 centimeter in DMEM met 15% FBS en 1% penicilline streptomycine. Houd de cellen op 37 graden Celsius onder 5% koolstofdioxide. Was de cellen twee keer met PBS, voeg dan 10 milliliter PBS toe, schraap de cellen en verzamel ze in een buis van 15 milliliter.

Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten op 800 keer G en verwijder het supernatant. Resuspend de pellet in een milliliter ultragezuiverd gedeïoniseerd water bij 80 graden Celsius en breng vervolgens de inhoud van de buis over naar een microfugebuis van twee milliliter. Na warmte-inactivatie van zebravissen, verzamel de hele hersenen in een microfugebuis van twee milliliter en vries deze in bij min 80 graden Celsius tot analyse.

Resuspend het weefselmonster in een milliliter ultragezuiverd gedeïoniseerd water bij 80 graden Celsius en soniceer met een sonde met behulp van 30 pulsen van één seconde. Incubeer het cellulaire lysaat of homogenaatweefsel bij 80 graden Celsius gedurende 20 minuten en koel het vervolgens 10 tot 30 minuten af op ijs. Voeg 10 microliter van één molaire zoutzuurvoorraadoplossing toe voor elke milliliter monstervolume.

Meng door 20 seconden te vortexen en incubeer gedurende 15 minuten op ijs. Centrifugeer het cellulaire lysaat of het homogenaatweefsel op 12.000 keer G in vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Verzamel het supernatant in laagbindende eiwitmicrocentrifugebuizen en bewaar het bij min 80 graden Celsius.

Reinig de ultrafiltratie-apparaten met water en centrifugeer gedurende drie minuten op 2, 300 maal G en gooi vervolgens het water van het ultrafiltratieapparaat weg. Pipetteer het supernatant in een voorgewassen 10 kilodalton afsnijfilter en draai in een gekoelde centrifuge bij vier graden Celsius. Controleer de pH van het monster.

Breng de kolom in evenwicht met één milliliter 100% acetonitril en was deze vervolgens met één milliliter 5% acetonitril met 0,1% trifluorazijnzuur. Laad het volledige volume van het monster in de kolom en was de kolom met één milliliter 5% acetonitril met 0,1% trifluorazijnzuur. Eluteer de peptiden uit de kolom met 1,8 milliliter 1% acetonitril met 0,15% trifluorazijnzuur in eiwitarmbindende microcentrifugebuizen.

Droog het monster volledig in een vacuümcentrifuge bij 30 graden Celsius en controleer de getoonde concentratietijd. Bewaar het monster bij min 80 graden Celsius. Resuspend de peptidemonsters in 100 tot 200 microliter ultragezuiverd water en pipetteer 2,5 microliter van de standaard peptideconcentraties en monsters op de witte 96-well plaat.

Voeg 25 microliter 0,2 molaire fosfaatbuffer en 12,5 microliter fluorescamine toe. Homogeneer zachtjes gedurende één minuut op de orbitale rotator. Voeg vervolgens 110 microliter water toe om de reactie te stoppen.

Pas de instellingen op de spectrofluorometer aan en lees vervolgens de plaat af. Voeg 1/10e volume van één molair trimethylammoniumbromide toe aan elk peptidemonster met maximaal 25 microgram van het peptide. Zorg ervoor dat de pH tussen de vijf en acht ligt, indien nodig met zoutzuur of natriumhydroxide.

Voeg vier microliter niet-gedeutereerde, gedeutereerde formaldehyde of koolstof-13 gedeutereerde formaldehyde toe. Meng gedurende vijf seconden door te vortexen. Voeg vier microliter natriumcyanoboorhydride of gedeutereerd natriumcyanoboorhydride toe aan het peptidemonster.

Meng het monster vervolgens gedurende vijf seconden door vortexing. Incubeer het peptidemonster gedurende twee uur in een zuurkast bij kamertemperatuur en vortex elke 30 minuten. Herhaal de toevoeging van niet-gedeutereerd, gedeutereerd of koolstof-13 gedeutereerd formaldehyde en natriumcyanoboorhydride of gedeutereerd natriumcyanoboorhydride, vortexing na elke toevoeging.

Incubeer de monsters in de zuurkast 's nachts bij kamertemperatuur. Voeg 16 microliter ammoniumbicarbonaat toe en meng door vortexing. Plaats het monster op ijs.

Voeg nog eens vijf seconden acht microliter mierenzuur en vortex toe. Combineer de peptidemonsters, pas de pH aan tussen twee en vier en ontzout vervolgens de gecombineerde monsters op omgekeerde faseopruimingskolommen met acetonitril en trifluorazijnzuur zoals eerder beschreven. Droog het monster volledig in een vacuümcentrifuge bij 30 graden Celsius en bewaar het vervolgens bij min 20 graden Celsius.

De gelabelde peptiden worden waargenomen met behulp van massaspectra. Rode pijlen geven de aanwezigheid aan van piekparen van verschillende peptiden gelabeld met twee isotopische vormen, L1 en L5, voor vergelijking tussen twee verschillende monsters respectievelijk S1 en S2. Het massaspectrum van een peptide aanwezig in drie verschillende monsters, S1, S2 en S3, gelabeld met respectievelijk L1, L3 en L5 tags wordt hier getoond.

Er werd een quadruplex labeling uitgevoerd. Controlemonsters S1 en S3 werden gelabeld met respectievelijk L1 en L3 en vergeleken met twee experimentele monsters, S2 en S4 gelabeld met L2 en L4.No significant verschil werd waargenomen. De isotopische etikettering werd gebruikt om substraten in producten in vitro weer te geven voor een bepaald protease of peptidase.

Een peptide dat niet verandert in de aanwezigheid van het neurolysine-enzym wordt hier getoond. Peptiden die verdwijnen of verminderen in de aanwezigheid van het enzym zijn substraten, terwijl degenen die toenemen als producten worden beschouwd. De figuur is een voorbeeld van het identificeren van een peptidesequentie uitgevoerd door een databasezoekmachine gelabeld met drie verschillende vormen van tags.

Voordat het wordt gedefinieerd, moet u ervoor zorgen dat het monster volledig koel is om te voorkomen dat de peptidebindingen worden verbroken die worden veroorzaakt door harde verzuring. Daarnaast is het reinigen van ultrafiltratie-apparaten essentieel. massaspectrometrie is een uitstekende methode om peptiden te kwantificeren tussen verschillende experimentele omstandigheden en voor analysestudies door peptidase-substraten te identificeren.