Monstervoorbereiding met behulp van een lipide monolaagmethode voor elektronenkristallografische studies

In de loop der jaren zijn lipide monolagen gebruikt als een ondersteunende laag om de 2D-kristallisatie van perifere membraaneiwitten en oplosbare eiwitten te bevorderen. Deze methode kan ook worden toegepast op 2D-kristallisatie, zoals sommige integrale membraaneiwitten. Maar vereist uitgebreider empirisch onderzoek om detergent- en dialyseomstandigheden te bepalen om de verdeling van de lipidemonolaag te bevorderen.

Een lipide monolaag vormt zich op het luchtwaterinterface, zodat de polaire kopgroepen van het lipide gehydrateerd blijven in de waterige fase. En de niet-polaire acylstaarten van de lipideverdeling naar de luchtwaterinterface, die de oppervlaktespanning breekt en het wateroppervlak afvlakt. De lading aard de onderscheidende chemische moieties van de lipide kop groepen zorgen voor de affiniteit voor eiwitten in oplossing.

Het bevorderen van binding, en in principe 2D array vorming. Alle 2D-kristallen gevormd op een lipide monolaag kunnen gemakkelijk worden overgebracht naar de elektronenmicroscoop op een met koolstof gecoat EM-raster dat wordt gebruikt om de kristallijne array op de lipidelaag op te tillen en te ondersteunen. We beschreven in dit manuscript een lipide monolaag methodologie voor cryogene elektronenmicroscopie beeldvorming.

Lipide monolaag voorbereiding. Lipidenbouillonpreparaat, bereid een lipidenmengsel van 0,01 mg per ml in 9:1 volume tot volume chloroform, methanol. Met 8,91 ml chloroform en 0,99 ml methanol en 0,1 ml een lipide-oplossing van 10 mg per ml.

Teflon plaat voorbereiding. Soniceer een teflonplaat in een methanolbad gedurende vijf minuten. Was 15 minuten met heet water en spoel vervolgens af met gedestilleerd water.

Droog de teflonplaat 30 minuten in een uitgedroogde laag en houd deze tot gebruik onder vacuüm. Vorming van lipide monolaag op bufferreservoir. De geschatte bedrijfstijd zal anderhalf uur zijn.

Leg een type één filterpapier in een petrischaaltje en schik het teflonblok bovenop het filtreerpapier. Vul de putjes van de teflonplaat met 60 microliter buffer. Voeg voorzichtig druppels voor druppel een vloeibaar mengsel toe aan het bufferoppervlak.

Idealiter één microliter per druppel met behulp van een Hamilton-spuit. Maak het filtreerpapier nat met gedestilleerd water en bewaar de vochtigheid in de petrischaal. Incubateer bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten, de chloroform moet verdampen en een monolaag van lipide op het oppervlak van de buffers moet worden gevormd.

Toepassing van een EM-raster op een lipide monolaag. Geschatte bedrijfstijd anderhalf uur. Plaats voorzichtig een met koolstof gecoat EM-rooster zonder gloed die de koolstofzijde naar beneden op het oppervlak van elk bufferreservoir ontlaaft.

Injecteer voorzichtig eiwitten in de zijinjectieput, gebruik de uiteindelijke eiwitconcentraties in de put rond één micromolair. Incubeer 60 minuten bij kamertemperatuur. Injecteer voorzichtig ongeveer 20 tot 30 microliter buffer in de injectiepoort van de plaats om het rooster boven het oppervlak van het teflonblok te verhogen.

Hiermee kun je met een pincet het rooster oppakken en verticaal van de druppel tillen. Representatieve resultaten. Een lipide monolaag afgezet op een EM-raster kan worden gevisualiseerd onder de transmissie-elektronenmicroscoop zonder contrastkleuring.

De monolaagaanwezigheid is te herkennen aan het contrastverschil met het gebied zonder enig monster in dat straalpad. Gebieden met lipide monolaagdekking hebben een lager contrast dan gebieden zonder dekking. Omdat de elektronenbundel door de lege gaten geen verstrooiing heeft, vertoont deze een helderdere verlichting.

Kortom, de lipide monolayer-methode biedt een mogelijkheid voor het bestuderen van eiwitstructuren vanwege zijn eenvoud. Het kan een alternatieve benadering bieden om het proces van 2D-kristallisatie te vergemakkelijken.