Monstervoorbereiding met behulp van een lipide monolaagmethode voor elektronenkristallografische studies
20 november 2021
Lipide monolagen worden al tientallen jaren gebruikt als basis voor het vormen van tweedimensionale (2D) eiwitkristallen voor structurele studies. Ze zijn stabiel op het lucht-water interface en kunnen dienen als een dun ondersteunend materiaal voor elektronenbeeldvorming. Hier presenteren we de bewezen stappen voor het voorbereiden van lipide monolagen voor biologische studies.
In de loop der jaren zijn lipide monolagen gebruikt als een ondersteunende laag om de 2D-kristallisatie van perifere membraaneiwitten en oplosbare eiwitten te bevorderen. Deze methode kan ook worden toegepast op 2D-kristallisatie, zoals sommige integrale membraaneiwitten. Maar vereist uitgebreider empirisch onderzoek om detergent- en dialyseomstandigheden te bepalen om de verdeling van de lipidemonolaag te bevorderen.
Een lipide monolaag vormt zich op het luchtwaterinterface, zodat de polaire kopgroepen van het lipide gehydrateerd blijven in de waterige fase. En de niet-polaire acylstaarten van de lipideverdeling naar de luchtwaterinterface, die de oppervlaktespanning breekt en het wateroppervlak afvlakt. De lading aard de onderscheidende chemische moieties van de lipide kop groepen zorgen voor de affiniteit voor eiwitten in oplossing.
Het bevorderen van binding, en in principe 2D array vorming. Alle 2D-kristallen gevormd op een lipide monolaag kunnen gemakkelijk worden overgebracht naar de elektronenmicroscoop op een met koolstof gecoat EM-raster dat wordt gebruikt om de kristallijne array op de lipidelaag op te tillen en te ondersteunen. We beschreven in dit manuscript een lipide monolaag methodologie voor cryogene elektronenmicroscopie beeldvorming.
Lipide monolaag voorbereiding. Lipidenbouillonpreparaat, bereid een lipidenmengsel van 0,01 mg per ml in 9:1 volume tot volume chloroform, methanol. Met 8,91 ml chloroform en 0,99 ml methanol en 0,1 ml een lipide-oplossing van 10 mg per ml.
Teflon plaat voorbereiding. Soniceer een teflonplaat in een methanolbad gedurende vijf minuten. Was 15 minuten met heet water en spoel vervolgens af met gedestilleerd water.
Droog de teflonplaat 30 minuten in een uitgedroogde laag en houd deze tot gebruik onder vacuüm. Vorming van lipide monolaag op bufferreservoir. De geschatte bedrijfstijd zal anderhalf uur zijn.
Leg een type één filterpapier in een petrischaaltje en schik het teflonblok bovenop het filtreerpapier. Vul de putjes van de teflonplaat met 60 microliter buffer. Voeg voorzichtig druppels voor druppel een vloeibaar mengsel toe aan het bufferoppervlak.
Idealiter één microliter per druppel met behulp van een Hamilton-spuit. Maak het filtreerpapier nat met gedestilleerd water en bewaar de vochtigheid in de petrischaal. Incubateer bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten, de chloroform moet verdampen en een monolaag van lipide op het oppervlak van de buffers moet worden gevormd.
Toepassing van een EM-raster op een lipide monolaag. Geschatte bedrijfstijd anderhalf uur. Plaats voorzichtig een met koolstof gecoat EM-rooster zonder gloed die de koolstofzijde naar beneden op het oppervlak van elk bufferreservoir ontlaaft.
Injecteer voorzichtig eiwitten in de zijinjectieput, gebruik de uiteindelijke eiwitconcentraties in de put rond één micromolair. Incubeer 60 minuten bij kamertemperatuur. Injecteer voorzichtig ongeveer 20 tot 30 microliter buffer in de injectiepoort van de plaats om het rooster boven het oppervlak van het teflonblok te verhogen.
Hiermee kun je met een pincet het rooster oppakken en verticaal van de druppel tillen. Representatieve resultaten. Een lipide monolaag afgezet op een EM-raster kan worden gevisualiseerd onder de transmissie-elektronenmicroscoop zonder contrastkleuring.
De monolaagaanwezigheid is te herkennen aan het contrastverschil met het gebied zonder enig monster in dat straalpad. Gebieden met lipide monolaagdekking hebben een lager contrast dan gebieden zonder dekking. Omdat de elektronenbundel door de lege gaten geen verstrooiing heeft, vertoont deze een helderdere verlichting.
Kortom, de lipide monolayer-methode biedt een mogelijkheid voor het bestuderen van eiwitstructuren vanwege zijn eenvoud. Het kan een alternatieve benadering bieden om het proces van 2D-kristallisatie te vergemakkelijken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Lipidmonolagen dienen als een stabiele basis voor de tweedimensionale kristallisatie van eiwitten, wat structurele studies vergemakkelijkt. Deze methode is bijzonder nuttig voor perifere membraaneiwitten en oplosbare eiwitten, en kan met zorgvuldige optimalisatie ook worden aangepast voor integrale membraaneiwitten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biofysica
- Structurele biologie
- Biochemie
Achtergrond
- Lipidemonolagen worden gevormd op het lucht-watergrensvlak.
- De polaire kopgroepen blijven gehydrateerd in de waterige fase.
- De apolaire acylstaarten partitioneren naar het lucht-watergrensvlak.
- De chemische aard van de lipidkopgroepen beïnvloedt de eiwitaffiniteit.
Doel van de studie
- Een methode presenteren voor het prepareren van lipidemonolagen.
- De kristallisatie van diverse eiwitten ondersteunen.
- Structurele studies verbeteren door middel van geavanceerdere beeldvormingstechnieken.
Gebruikte methoden
- Bereiding van lipidemonolagen op het lucht-watergrensvlak.
- Optimalisatie van detergent- en dialysecondities.
- Empirisch onderzoek naar eiwitpartitionering.
- Elektronenbeeldtechnieken voor structurele analyse.
Belangrijkste resultaten
- Lipidmonolagen ondersteunen effectief de proteïnekristallisatie.
- Specifieke condities verhogen de affiniteit van proteïnen voor de monolayer.
- Integrale membraanproteïnen kunnen met verdere optimalisatie worden gekristalliseerd.
- De methode biedt een stabiel platform voor elektronenbeeldvorming.
Conclusies
- Lipidmonolagen zijn een veelzijdig hulpmiddel voor de structurele biologie.
- Ze vergemakkelijken de studie van zowel perifere als integrale membraaneiwitten.
- Verder onderzoek is nodig om de condities voor optimale resultaten te verfijnen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Methoden met lipidenmonolagen maken gecontroleerde tweedimensionale proteïnekristallisatie mogelijk, wat de structurele bepaling van membraan- en oplosbare targets ondersteunt. Deze aanpak verbetert de targetvalidatie door reproduceerbare platforms te bieden voor biofysische karakterisering, waardoor de onzekerheid in de vroege fasen van geneesmiddelenontwikkeling wordt verminderd. De techniek faciliteert mechanistische risicoreductie door middel van structurele inzichten met een hoge resolutie, wat bijdraagt aan lead-optimalisatie en besluitvorming over de portfolio.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroegtijdige Ontdekking & Target Validatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar eiwit-lipide-interacties en conformationele toestanden relevant voor de targetfunctie mogelijk.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerd systeem voor het beoordelen van targetstabiliteit en bindingscompetentie.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door structurele analyse onder bijna-natieve omstandigheden mogelijk te maken.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert homogene, geordende proteïne-arrays die geschikt zijn voor screeningtoepassingen met een hoge resolutie.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid bij de monstervoorbereiding, wat cruciaal is voor de consistentie van assays tussen verschillende teams.
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantificeerbare structurele resultaten die correlatie met functionele assaygegevens mogelijk maken.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt structurele inzichten in membraaneiwitdoelen, wat helpt bij het begrijpen van ziektemechanismen.
- Operationele waarde: Creëert overdraagbare monsters die compatibel zijn met downstream cryo-EM-workflows.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt voorspellende betrouwbaarheid door structurele kenmerken te koppelen aan farmacologische activiteit.
Pipeline- & workflowintegratie
De lipidemonolaagmethode kan worden geïntegreerd in vroege ontdekkingsworkflows, ter ondersteuning van targetvalidatie en leadidentificatie via structurele karakterisering.
- Ontdekkingsbiologie: Faciliteert hypothesetoetsing via structurele visualisatie van eiwitarrangementen en -interacties.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk door uniforme 2D-kristallen te produceren voor consistente biofysische metingen.
- Analytica: Levert beeldgegevens met een hoge resolutie waarmee teams structurele toestanden onder variërende omstandigheden kunnen vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt structurele bevindingen met preklinische continuïteit door targetmechanismen te verduidelijken.
- Bedrijfbrede hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor structurele screening over meerdere eiwit-targets.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in doelwitvalidatie door directe structurele observatie.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie bij de monstervoorbereiding voor structurele studies.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door structurele onzekerheid bij de selectie van doelwitten te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering mogelijk op basis van gevalideerde structurele en functionele gegevens.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de omgang met lipiden, proteïnepurificatie en grensvlakwetenschap.
- Afhankelijk van toegang tot cleanroom-compatibele apparatuur, zoals Hamilton-spuiten en Teflon-substraten.
- Maakt standaardisatie van buffercondities en incubatietijden tussen laboratoria noodzakelijk.
- Omvat overwegingen voor adaptatie voor verschillende proteïneklassen, in het bijzonder integrale membraaneiwitten.
- Beperkt door de noodzaak van empirische optimalisatie van detergent- en dialysecondities voor bepaalde targets.
