Name: Het meten van eigenschappen van het membraan periodieke skelet van het Axon Initial Segment met behulp van 3D-gestructureerde verlichting microscopie (3D-SIM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Leer actineringen visualiseren in het membraan periodieke skelet van axon initiële segmenten met 3D-SIM in gekweekte rat hippocampusneuronen. Deze methode verbetert de resolutie voor eiwitlokalisatie-analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Pirta Hotulainen wordt erkend voor haar kritische opmerkingen, van onschatbare waarde voor het voorbereiden van dit manuscript. Dr. Rimante Minkeviciene wordt erkend voor haar hulp bij het voorbereiden van de neuronale culturen die werden gebruikt voor de oorspronkelijke experimenten. Alle beeldvorming werd uitgevoerd in de Biomedicum Imaging Unit. Dit werk werd ondersteund door de Academy of Finland (D.M., SA 266351) en doctoraatsprogramma Brain & Mind (A.A.)

Primaire hippocampusneuronen die in deze experimenten werden gebruikt, werden geoogst16 van embryonale dag 17 Wistar-rattenembryo's van beide geslachten onder de ethische richtlijnen van de Universiteit van Helsinki en de Finse wet.
1. Monstervoorbereiding
<ol><li>Laat op high-fidelity glazen coverslips de hippocampusneuronen van ratten groeien in schaarse kweekomstandigheden (~ 5.000-10.000 cellen / cm2) gedurende 14 dagen (14 dagen-in-vitro). OPMERKING: Het gebruik van schaarse culturen vermindert de kans op overlappende neurieten, wat helpt bij het kwantificeren van de MPS.</li>
	<li>Fix neuronen met behulp van 4% paraformaldehyde gedurende 12 minuten bij kamertemperatuur. Was de coverslip eenmaal in 0,2% BSA in PBS (BSA-PBS) en incubeer vervolgens gedurende 10 minuten in een 1% oplossing van Triton-X in PBS bij kamertemperatuur. Eenmaal wassen in BSA-PBS.</li>
	<li>Verdun anti-ankyrine G-antilichamen (1:200) in BSA-PBS. Voeg antilichaamoplossing toe aan de coverslip en incubeer een nacht bij 4 °C. Voeg eventueel anti-MAP2-antilichamen (zie Tabel met materialen) toe aan de antilichaamoplossing om het somato-dendritische domein af te bakenen.</li>
	<li>Was cellen eenmaal in BSA-PBS, gevolgd door 0,1% Triton-X in PBS en doe vervolgens een laatste wasbeurt in BSA-PBS.</li>
	<li>Verdun fluorofoor-gelabelde antimuis secundaire antilichamen (1:200) (zie Tabel met materialen) in BSA-PBS, voeg toe aan de coverslip en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was de cellen eenmaal in BSA-PBS, eenmaal in 0,1% Triton-X in PBS en eenmaal in PBS.</li>
	<li>Bereid een 1 μM-oplossing van gelabeld falloïdine in PBS (zie Materiaaltabel) en voeg deze toe aan de cellen. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Was cellen eenmaal in PBS, eenmaal in 0,1% Triton-X in PBS en eenmaal in PBS. OPMERKING: AlexaFluor488-gelabelde falloïdeïne werd hier gebruikt, maar andere tags zullen ook werken.</li>
	<li>Voor het monteren van de coverslip op een glazen dia, breng een druppel montagemedium aan op een glasplaat, dompel de coverslip in gedeïoniseerd water en dep met een zachte papieren handdoek (om overtollig water te verwijderen).<ol>
<li>Plaats de dekplaat op de glasplaat. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 24 uur. OPMERKING: Er werden geen nadelige effecten op het monster waargenomen met behulp van hard-setting montagemedia (brekingsindex 1,47 na uitharding).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Beeldvorming
<ol><li>Raadpleeg indien mogelijk het personeel van de microscopiefaciliteit voordat u een beeld afbeeldt. Gebruik een dompeloliecalculator (zie Tabel met materialen) om de dompelolie te selecteren die geschikt is voor het monster.</li>
	<li>Zodra de monsters klaar zijn, moet u ervoor zorgen dat de coverslips schoon zijn en vrij van eventuele resten of overtollige montagemedia. Gebruik indien nodig een wattenstaafje gedoopt in water of ethanol om schoon te maken. Plaats het monster in een microscoop die geschikt is voor 3D SIM (zie Materiaaltabel) en zoek een cel om in beeld te brengen.</li>
	<li>Pas het vermogen van de relevante laserlijnen en de belichtingstijden aan om de signaal-ruisverhouding te maximaliseren zonder het monster aanzienlijk te bleken. OPMERKING: Een goede signaal-ruisverhouding toont een duidelijk rasterachtig uiterlijk gericht op het monster en leidt tot nauwkeurige reconstructies met hoge resolutie. 488 nm en 640 nm laserlijnen werden gebruikt om respectievelijk F-actine en ankyrine G te visualiseren.</li>
	<li>Stel de boven- en ondergrenzen van het monster in de z-dimensie in en ga verder met het verkrijgen van een stapel. OPMERKING: hier werd een z-stapgrootte van 125 nm gebruikt.</li>
	<li>Voor een succesvolle SIM-reconstructie moet u ervoor zorgen dat de microscopiesoftware (zie Materiaaltabel) een optisch overdrachtsbestand (OTF) heeft dat geschikt is voor de gebruikte kleurstoffen. OPMERKING: Deze worden meestal gemaakt en onderhouden door gespecialiseerd personeel. Bij gebrek aan een functionele OTF zijn er ook open-source tools beschikbaar om reconstructies uit te voeren op basis van schattingen17. In dit werk werden up-to-date OTF-bestanden gebruikt die werden beheerd door gespecialiseerd personeel.</li>
	<li>Voer het reconstructiealgoritme op de stapel uit om een superopgeloste reconstructie te verkrijgen. Controleer de reconstructies op bekende artefacten en pas indien nodig de parameters aan om ze te corrigeren. OPMERKING: De standaard algoritmeparameters geven meestal nauwkeurige resultaten. Veel van deze artefacten omvatten enkele herhalende patronen: gestreepte lijnen samen met meerdere richtingen op één z-vlak, 'ghosting' (herhaalde kenmerken die in verschillende z-vlakken verschijnen), of een zeshoekig 'honingraat'-patroon dat in sommige gebieden opduikt. Deze artefacten kunnen vaak worden opgelost met een betere monstervoorbereiding, een betere signaal-ruisverhouding, het aanpassen van de parameters van het reconstructiealgoritme of ervoor zorgen dat de brekingsindex van de gekozen dompelolie geschikt is voor het montagemedium en monster. Voor een meer gedetailleerde bespreking van SIM-artefacten en een vrij beschikbare tool om te controleren op de aanwezigheid van artefacten, zie Ball et al. 18
</li>
	<li>Vergelijk de SIM-reconstructie met een grootveldbeeld om verbeteringen in de resolutie te zien.</li>
	<li>Gebruik bij het uitvoeren van meerkleurige SIM het uitlijningsalgoritme om de verschillende kanalen correct uit te lijnen zodra een bevredigende reconstructie klaar is. OPMERKING: Het uitlijningsalgoritme maakt gebruik van een uitlijningsreferentiebestand dat is gegenereerd met behulp van een microsfeerparelpreparaat volgens de instructies van de microscoopfabrikant.</li>
</ol>3. Beeldanalyse
<ol><li>Actineringen in de MPS hebben een onderscheidend periodiek uiterlijk. Maak met behulp van beeldanalysesoftware (zie Tabel met materialen) een projectiebeeld met maximale intensiteit met behulp van alle brandpuntsvlakken waar actineringen zichtbaar zijn.</li>
	<li>Teken op het projectiebeeld met maximale intensiteit een loodrechte lijn over zichtbare aangrenzende ringen en noteer de fluorescentie-intensiteit samen met de lijn 'Plot Profile'-functie van de software.</li>
	<li>Om de gemiddelde interpiekafstand te berekenen, noteert u de lokale maxima in het lijnprofiel en meet u de afstand tussen individuele aangrenzende fluorescentie-intensiteitspieken. OPMERKING: Dit kan eenvoudig worden berekend, bijvoorbeeld met behulp van de 'findpeaks'-functie in MATLAB of het (open-source) GNU Octave-platform.</li>
	<li>Om de colocalisatie van verschillende eiwitten met actineringen in de MPS te evalueren, voert u een colocalisatieanalyseprocedure19,20,21 uit op SIM-reconstructies van actine en het kandidaat-eiwit. Teken handmatig een selectie om de AIS te definiëren als een regio van belang voor de EzColocalization-plug-in in het softwareplatform19 en voer de analyse uit om de Pearson-correlatiecoëfficiënt (PCC) van co-lokalisatie19,20,21 te berekenen. Een PCC-waarde in de buurt van 1 duidt op een sterke colocalisatie. OPMERKING: Dit protocol is samengevat in figuur 1.</li>
</ol>

<ol><li>Leterrier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Axon+initial+segment%2C+50+years+later%3A+A+nexus+for+neuronal+organization+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Membranes%22%5BJournal%5D)">The Axon initial segment, 50 years later: A nexus for neuronal organization and function.</a> Current Topics in Membranes. 77, 185-233 (2016).</li>
<li>Leterrier, C., Dargent, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+pasaran%21+Role+of+the+axon+initial+segment+in+the+regulation+of+protein+transport+and+the+maintenance+of+axonal+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">No pasaran! Role of the axon initial segment in the regulation of protein transport and the maintenance of axonal identity.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 27, 44-51 (2014).</li>
<li>Brachet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ankyrin+G+restricts+ion+channel+diffusion+at+the+axonal+initial+segment+before+the+establishment+of+the+diffusion+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ankyrin G restricts ion channel diffusion at the axonal initial segment before the establishment of the diffusion barrier.</a> Journal of Cell Biology. 191 (2), 383-395 (2010).</li>
<li>Nakada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+anchored+proteins+forms+membrane+diffusion+barriers+during+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization.</a> Nature Cell Biology. 5 (7), 626-632 (2003).</li>
<li>Song, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+filter+for+cytoplasmic+transport+at+the+axon+initial+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A selective filter for cytoplasmic transport at the axon initial segment.</a> Cell. 136 (6), 1148-1160 (2009).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+filtering+defect+at+the+axon+initial+segment+in+Alzheimer%27s+disease+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Selective filtering defect at the axon initial segment in Alzheimer's disease mouse models.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (39), 14271-14276 (2014).</li>
<li>Winckler, B., Forscher, P., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+diffusion+barrier+maintains+distribution+of+membrane+proteins+in+polarized+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A diffusion barrier maintains distribution of membrane proteins in polarized neurons.</a> Nature. 397 (6721), 698-701 (1999).</li>
<li>Kole, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potential+generation+requires+a+high+sodium+channel+density+in+the+axon+initial+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Action potential generation requires a high sodium channel density in the axon initial segment.</a> Nature Neuroscience. 11 (2), 178-186 (2008).</li>
<li>Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin%2C+spectrin%2C+and+associated+proteins+form+a+periodic+cytoskeletal+structure+in+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons.</a> Science. 339 (6118), 452-456 (2013).</li>
<li>Leterrier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+architecture+of+the+axon+initial+segment+reveals+an+organized+and+robust+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nanoscale architecture of the axon initial segment reveals an organized and robust scaffold.</a> Cell Reports. 13 (12), 2781-2793 (2015).</li>
<li>Leterrier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axon+initial+segment%3A+An+updated+viewpoint%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The axon initial segment: An updated viewpoint.</a> The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2135-2145 (2018).</li>
<li>Hamdan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+axon+initial+segment+structure+and+function+by+multiplexed+proximity+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mapping axon initial segment structure and function by multiplexed proximity biotinylation.</a> Nature Communications. 11 (1), 100(2020).</li>
<li>Zhou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+functional+analyses+of+the+periodic+membrane+skeleton+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Proteomic and functional analyses of the periodic membrane skeleton in neurons.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Valli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+beyond+the+limit%3A+A+guide+to+choosing+the+right+super-resolution+microscopy+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Seeing beyond the limit: A guide to choosing the right super-resolution microscopy technique.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100791(2021).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+contractility+of+actomyosin+rings+facilitates+axonal+trafficking+and+structural+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Radial contractility of actomyosin rings facilitates axonal trafficking and structural stability.</a> Journal of Cell Biology. 219 (5), 201902001(2020).</li>
<li>Abouelezz, A., Stefen, H., Segerstråle, M., Micinski, D., Minkeviciene, R., Lahti, L., Hardeman, E., Gunning, P., Hoogenraad, C., Taira, T., Fath, T., Hotulainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropomyosin+Tpm3.1+is+required+to+maintain+the+structure+and+function+of+the+axon+initial+segment%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Tropomyosin Tpm3.1 is required to maintain the structure and function of the axon initial segment.</a> iScience. 23 (5), 101053(2020).</li>
<li>Muller, M., Monkemoller, V., Hennig, S., Hubner, W., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+image+reconstruction+of+super-resolution+structured+illumination+microscopy+data+in+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ.</a> Nature Communications. 7, 10980(2016).</li>
<li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMcheck%3A+a+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15915(2015).</li>
<li>Stauffer, W., Sheng, H., Lim, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EzColocalization%3A+An+ImageJ+plugin+for+visualizing+and+measuring+colocalization+in+cells+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">EzColocalization: An ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms.</a> Scientific Reports. 8 (1), 15764(2018).</li>
<li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).</li>
<li>Lahti, L. Data analysis supplement to the research article Abouelezz, Stefen, Segerstråle, Micinski, Minkeviciene, Lahti, Hardeman, Gunning, Hoogenraad, Taira, Fath, & Hotulainen. <a target="_blank" href="https://aaltodoc.aalto.fi/handle/123456789/109882">Tropomyosin Tpm3.1 Is Required to Maintain the Structure and Function of the Axon Initial Segment</a>. , (2021).</li>
<li>Abouelezz, A., Micinski, D., Lipponen, A., Hotulainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-membranous+actin+rings+in+the+axon+initial+segment+are+resistant+to+the+action+of+latrunculin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sub-membranous actin rings in the axon initial segment are resistant to the action of latrunculin.</a> Journal of Biological Chemistry. 400 (9), 1141-1146 (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het hier beschreven protocol biedt een methode voor het visualiseren en meten van MPS-eiwitten met behulp van de superresolutietechniek. Aangezien actineringen en andere MPS-componenten een periodiciteit van ~190 nm9,10 vertonen, kunnen conventionele diffractiebeperkte beeldvormingsbenaderingen de details van de MPS niet onthullen. Verschillende microscopie-opstellingen kunnen diffractie-beperkte structuren in superresolutie oplossen, en SIM vertegenwoordigt een ...

Het axon initial segment (AIS) is een kort, uniek gespecialiseerd gebied van het proximale axon van gewervelde neuronen1. De AIS omvat een transportfilter en diffusiebarrière die essentieel zijn voor het behoud van neuronale polariteit door somato-dendritische lading te sorteren2,3,4,5,6,7. Bovendien maakt de unieke structuur van het AIS het mogelijk om clusters van spanningsafhankelijke ionkanalen te huisvesten die zijn functie als de plaats van actiepotentiaalinitiatie vergemakkelijken8. Een zeer stabiel structureel complex ligt ten grondslag aan de unieke functies van het AIS. Onderzoek in het afgelopen decennium heeft de aanwezigheid aangetoond van een membraan periodiek skelet (MPS) met actineringen verbonden door spectrine en een steiger voor het verankeren van verschillende AIS-eiwitten9,10.
De afstand tussen actineringen in de MPS (~190 nm)9,10 ligt onder de resolutiegrens van conventionele lichtmicroscopie. Vroege pogingen om elektronenmicroscopie te gebruiken om de MPS te visualiseren waren niet succesvol, omdat de zware voorbereidingsprocedures die ermee gepaard gingen, de structuur van de MPS niet konden behouden. Superresolutiemicroscopietechnieken zijn dus van onschatbare waarde gebleken bij het ophelderen van enkele van de structurele details van de MPS11. Het begrip van het structurele AIS-complex, de identiteit en functies van de componenten en de spatiotemporele regulatie zijn echter nog steeds onvolledig. Recente proteomische studies zijn erin geslaagd om een aanzienlijke lijst van eiwitten te creëren die zich lokaliseren naar de AIS dicht bij structurele componenten van de AIS12,13. Toch ontbreken details over hun functie en precieze plaats in het AIS-complex. Superresolutiemicroscopietechnieken dienen dus als een essentieel hulpmiddel om de nauwkeurige posities van deze eiwitten ten opzichte van andere MPS-componenten te onderzoeken en hun functies te onderzoeken. Verschillende lichtmicroscopietechnieken kunnen resoluties bereiken die hoger zijn dan de diffractielimiet van licht, sommige zelfs in staat om afzonderlijke moleculen te lokaliseren. Veel van deze technieken vereisen echter meestal gespecialiseerde fluoroforen of beeldbuffers en beeldacquisitie is vaak tijdsintensief14.
3D-gestructureerde verlichtingsmicroscopie (3D-SIM), vanwege het gebruiksgemak en de eenvoudige vereisten voor monstervoorbereiding, vereist geen speciale reagentia voor beeldvorming of monstervoorbereiding, werkt goed met een breed scala aan fluoroforen en monsters, kan gemakkelijk in meerdere kleuren worden geïmplementeerd en is in staat tot live-cell imaging15. Hoewel de best mogelijke resolutie die SIM biedt (~ 120 nm) laag is in vergelijking met veel andere superresolutietechnieken, is het voldoende voor veel toepassingen (bijvoorbeeld voor het oplossen van de componenten van de MPS in neuronen). Het is dus van cruciaal belang om rekening te houden met de vereiste voor specifieke toepassingen om te bepalen of SIM een geschikte keuze is of dat een nog hogere resolutie nodig is. Hier wordt een protocol beschreven voor het gebruik van gekweekte hippocampusneuronen en 3D-gestructureerde verlichtingsmicroscopie (3D-SIM) om de positie en organisatie van vermeende AIS-eiwitten ten opzichte van actineringen in de MPS te onderzoeken, zoals geïmplementeerd in Abouelezz et al.16

<table><tbody><tr><td>24-well plates</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa-488 Phalloidin</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-647 anti-mouse</td><td>ThermoFisher</td><td>A31571</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ankyrin G antibody</td><td>UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/36</td><td>75-146</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAP2 antibody</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5543</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>BioWest</td><td>P6154</td><td></td></tr><tr><td>Deltavision OMX SR</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fiji softwarepakket</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GNU Octave</td><td>GNU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoge prestaties deksels</td><td>Marienfeld</td><td>117530</td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil Calculator</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td></td><td>https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>VWR</td><td>ICNA1680149</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2020a</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal media</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>OMX SR</td><td>Delta Vision OMX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold montagemedia</td><td>Invitrogen</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>softWoRx Deconvolution</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Slides</td><td>Epredia</td><td>ISO 8037/1</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck microspheres 0.1 &micro;m</td><td>ThermoFisher</td><td>T7279</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

het meten van eigenschappen van het membraan periodieke skelet van het axon initial segment met behulp van 3d-gestructureerde verlichting microscopie (3d-sim)

Measuring Properties of the Membrane Periodic Skeleton of the Axon Initial Segment using 3D-Structured Illumination Microscopy (3D-SIM)

Het axoninitiesegment (AIS) is de plaats waar actiepotentialen initiëren en vormt een transportfilter en diffusiebarrière die bijdragen aan het behoud van neuronale polariteit door somato-dendritische lading te sorteren. Een membraan periodiek skelet (MPS) bestaande uit periodieke actineringen biedt een steiger voor het verankeren van verschillende AIS-eiwitten, waaronder structurele eiwitten en verschillende ionkanalen. Hoewel recente proteomische benaderingen een aanzienlijk aantal nieuwe AIS-componenten hebben geïdentificeerd, ontbreken details over de structuur van de MPS en de rollen van de afzonderlijke componenten ervan. De afstand tussen individuele actineringen in de MPS (~ 190 nm) vereist het gebruik van superresolutiemicroscopietechnieken om de structurele details van de MPS op te lossen. Dit protocol beschrijft een methode voor het gebruik van gekweekte hippocampusneuronen van ratten om de precieze lokalisatie van een AIS-eiwit in de MPS ten opzichte van sub-vliezige actineringen te onderzoeken met behulp van 3D-gestructureerde verlichtingsmicroscopie (3D-SIM). Daarnaast wordt ook een analytische benadering beschreven om de periodiciteit van individuele componenten en hun positie ten opzichte van actineringen kwantitatief te beoordelen.

Met behulp van gekweekte hippocampusneuronen van ratten en 3D-SIM wordt een protocol beschreven om actineringen en andere componenten van de MPS in de AIS te visualiseren en te meten. Reconstructies van beeldstapels toonden een duidelijke periodiciteit van actineringen (figuur 2A). In onze handen was de gemiddelde inter-piekafstand van actineringen in de MPS, gevisualiseerd met Alexa 488-gelabelde falloïdine, 190,36 ± 1,7 nm (gemiddelde ± SEM). Dit is in lijn met de eerder gerapporteerde gem...

Het huidige protocol beschrijft een methode om actineringen en andere componenten van het periodieke membraanskelet van het axoninitiële segment te visualiseren en te meten met behulp van gekweekte hippocampale neuronen van ratten en 3D-gestructureerde verlichtingsmicroscopie (3D-SIM).

Het meten van eigenschappen van het membraan periodieke skelet van het Axon Initial Segment met behulp van 3D-gestructureerde verlichting microscopie (3D-SIM)

The axon initial segment (AIS) is the site at which action potentials initiate and constitutes a transport filter and diffusion barrier that contribute to ...

Dit protocol maakt het mogelijk om het periodieke membraanskelet in het axon-initiële segment van gekweekte neuronen op te lossen. Door de lokalisatie van eiwitten te onderzoeken kan inzicht worden verkregen in de functie in het membraan periodiek skelet. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de robuustheid en het gebruiksgemak.Gestructureerde verlichtingsmicroscopie is in staat om het periodieke skelet van het membraan op te lossen en de monstervoorbereiding is eenvoudig en ongecompliceerd. Iedereen met eerdere ervaring in fluorescentiemicroscopie kan deze techniek gemakkelijk implementeren. Dit protocol is ontworpen om de signaal-ruisverhouding tijdens monstervoorbereiding en beeldvorming te maximaliseren.Om te beginnen, fixeer de neuronen met behulp van 4% paraformaldehyde gedurende 12 minuten bij kamertemperatuur. Was de afdekslip eenmaal in 0,2%BSA in fosfaatbufferoplossing en incubeer gedurende 10 minuten in een 1%-oplossing van Triton X in PBS bij kamertemperatuur. Was de afdekslip met BSA in fosfaatbufferoplossing, verdun de anti-ankyrine G-antilichamen met BSA in een fosfaatbufferoplossing met een verhouding van één tot 200.Voeg antilichaamoplossing toe aan de afdekslip en incubeer 's nachts bij vier graden Celsius. Was de cellen eenmaal in BSA-fosfaatbufferoplossing eenmaal in 0,1%Triton X in fosfaatbufferoplossing en eenmaal in fosfaatbufferoplossing. Verdun Fluoro 4 gelabeld, voeg meer secundaire antilichamen toe in BSA-fosfaatbufferoplossing en voeg toe aan de afdekslip.Was de cellen eenmaal in BSA-fosfaatbufferoplossing eenmaal in 0,1%Triton X in fosfaatbufferoplossing en eenmaal in fosfaatbufferoplossing. Bereid een micromolaire oplossing van gelabeld Ferodin in fosfaatbufferoplossing en voeg deze toe aan de cellen. Was de cellen eenmaal in bovine serumalbuminefosfaatbufferoplossing eenmaal in 0,1%Triton X in fosfaatbufferoplossing en eenmaal in fosfaatbufferoplossing.Voor het monteren van de afdekplaat op een glazen dia, brengt u een druppel montagemedium aan op een dia, dompelt u de afdekplaat in gedeïoniseerd water en tikt u erop met een zachte papieren handdoek om overtollig water te verwijderen. Plaats de afdekslip op de glasplaat en incubeer gedurende 24 uur bij kamertemperatuur. Raadpleeg indien mogelijk het personeel van de microscopiefaciliteit voordat u een afbeelding maakt en gebruik een onderdompelingsoliecalculator om de dompelolie te selecteren die geschikt is voor het monster.Zodra de monsters klaar zijn, moet u ervoor zorgen dat de afdekslips schoon en vrij van eventuele resten zijn door ze te reinigen met een wattenstaafje gedompeld in water of ethanol. Plaats het monster in een 3D-SIM-microscoop en zoek de cel om het beeld vast te leggen. Pas het vermogen van de relevante laserlijnen aan.En de belichtingstijden om de signaal-ruisverhouding te maximaliseren zonder het monster aanzienlijk te bleken. Stel de boven- en ondergrenzen van het monster in de Z-dimensie in en ga verder met het verkrijgen van een stapel. Voer het reconstructiealgoritme op de stapel uit om een super opgeloste reconstructie te verkrijgen.Controleer de reconstructies op bekende artefacten en pas indien nodig de parameters aan om ze te corrigeren. Vergelijk de SIM-reconstructie met een breedveldbeeld om verbeteringen in de resolutie te observeren. Gebruik bij het uitvoeren van meerkleurige gestructureerde verlichtingsmicroscopie het uitlijningsalgoritme om de verschillende kanalen correct uit te lijnen, zodra een bevredigende reconstructie klaar is.Actineringen in het periodieke skelet van het membraan hebben een onderscheidend periodiek uiterlijk. Maak een projectiebeeld met maximale intensiteit in beeldanalysesoftware met behulp van alle brandpuntsvlakken waar de actineringen zichtbaar zijn. Teken op het projectiebeeld met maximale intensiteit een loodrechte lijn over zichtbare aangrenzende ringen en noteer de fluorescentie-intensiteit samen met de lijnplotprofielfunctie van de software.Om de gemiddelde interpiekafstand te berekenen, noteert u de lokale maxima in het lijnprofiel en meet u de afstand tussen individuele aangrenzende fluorescentie-intensiteitspieken. Om de colocalisatie van verschillende eiwitten met actineringen in het periodieke membraanskelet te evalueren, voert u een colocalisatieanalyseprocedure uit op SIM-reconstructies van actine en het kandidaat-eiwit. Teken handmatig een selectie om het axon-initiële segment te definiëren als een interessegebied, voor de eenvoudige colocalisatie-plug-in in het softwareplatform, en voer de analyse uit om de correlatiecoëfficiënt van Pearson voor colocalisatie te berekenen.Tijdens SIM-beeldanalyse toonden de reconstructies van beeldstapels een duidelijke periodiciteit van actineringen. Een anti-ankyrine G-antilichaam werd gebruikt om ankyrine G te visualiseren.De colocalisatie van ankyrine G- en actineringen werd getest in het axon-initiële segment met behulp van een colocalisatie-analyseprocedure om de correlatiecoëfficiënt van Pearson te berekenen. De Pearson-correlatiecoëfficiënt voor colocalisatie van ankyrine G en actineringen fluorescentie was 0,36 plus of min 0,03.Het is essentieel om de juiste dompelolie te gebruiken en het laservermogen en de belichtingstijd aan te passen om de rasterlijnen zichtbaar te maken. Zodra is vastgesteld dat eiwit deel uitmaakt van het periodieke skelet van het membraan, kan de functie ervan worden onderzocht en vastgesteld bij het onderhouden van het periodieke membraanskelet. De effecten van het neerhalen van het eiwit op actineringen kunnen bijvoorbeeld worden geanalyseerd.De ontwikkeling van superresolutiemicroscopietechnieken is de reden dat we weten dat het axon-initiële segment een membraan periodiek skelet bevat dat bestaat uit actineringen, spectrum en ankyrine. SIM heeft onderzoekers in staat gesteld om gemakkelijk membraan periodieke skeletcomponenten te visualiseren en naar actineringen in levende cellen te kijken.

measuring-properties-membrane-periodic-skeleton-axon-initial-segment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Take a fixed section of mouse cortical brain tissue exhibiting neuronal axons and dendrites. The dendrites possess protrusions, known as dendritic spines, which form synapses with axons.Incubate the tissue with osmium-ferrocyanide, which binds to lipids, followed by another osmium application, which enhances structural contrast for imaging.Stain with a heavy metal compound that binds to macromolecules and enhances contrast.Dehydrate using increasing alcohol concentrations for resin...

Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy for 3D Reconstruction of Synaptically Linked Neurons

Dit artikel beschrijft een werkprotocol op de foto dendritische stekels van hippocampale neuronen in vitro met behulp van Structured Illumination Microscopy (SIM). Superresolutietechnieken gebruik van SIM biedt beeldresolutie aanzienlijk verder gaan dan het licht limiet diffractie in alle drie ruimtelijke dimensies, waardoor de beeldvorming van individuele vertakte stekels met verbeterde details.

Beeldvorming Dendritische stekels van Rat Primaire hippocampus neuronen met behulp van Structured Illumination Microscopie

Spatiotemporele informatie over dynamische eiwitten in levende cellen is cruciaal voor het begrijpen van de biologie. Een type superresolutiemicroscopie genaamd fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) onthult unieke informatie over de cytokinetische Z-ring in bacteriën: zowel het kralenachtige uiterlijk als de snelle dynamica van FtsZ binnen de ring.

Super-resolution Imaging van de Cytokinetic Z Ring in levende bacteriën met behulp van Fast-3D Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Dit artikel geeft een diepgaand overzicht van de assemblage en werking van een gestructureerde verlichtingsmicroscoop die werkt met totale interne reflectie fluorescentie verlichting (TIRF-SIM) om dynamische biologische processen met optische superresolutie in meerdere kleuren te beeldvormen.

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopie op hoge snelheid met meerdere kleuren

Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren van motor neuron projectie en axon arborization in transgene Hb9::GFP muis embryo's. Na immunokleuring voor motorische neuronen, we gebruikten licht blad fluorescentie microscopie op afbeelding embryo's voor verdere kwantitatieve analyse. Dit protocol is van toepassing op andere neuron navigatie processen in het centrale zenuwstelsel.

Visualisatie van Motor Axon navigatie en kwantificering van Axon Arborization In muis embryo's met behulp van licht blad fluorescentie microscopie

Dit protocol legt uit hoe u bacteriële samples voorbereidt en monit voor Live driedimensionale beeldvorming en hoe u de driedimensionale vorm van E. coli van die beelden reconstrueren.

Driedimensionale beeldvorming van bacteriële cellen voor nauwkeurige cellulaire representaties en precieze eiwit lokalisatie

Dit protocol laat zien hoe je microscopie met superresolutie gebruiken om eiwitcolokalisatie te bestuderen in primaire neuronale culturen.

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Dit protocol demonstreert hoe biologische cryo-geconserveerde monsters kunnen worden afgebeeld met behulp van cryo-gestructureerde verlichtingsmicroscopie. We demonstreren de methodologie door het cytoskelet van U2OS-cellen in beeld te brengen.

Cryo-gestructureerde verlichting Microscopische gegevensverzameling van cryogene geconserveerde cellen

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) wordt toegepast op beeld en analyseren van dendritische stekels in de muriene hippocampus.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) voor de studie van dendritische stekels

Dit protocol beschrijft in detail hoe een fluorescentiemicroscoop met één objectief en lichtvel kan worden gebouwd en hoe deze kan worden gebruikt voor het visualiseren van cytoskeletnetwerken.

Ontwerp en bouw van een aanpasbare, single-objectief, light-sheet fluorescentiemicroscoop voor de visualisatie van cytoskeletnetwerken

Leer actineringen visualiseren in het membraan periodieke skelet van axon initiële segmenten met 3D-SIM in gekweekte rat hippocampusneuronen. Deze methode verbetert de resolutie voor eiwitlokalisatie-analyse.

Het meten van eigenschappen van het membraan periodieke skelet van het Axon Initial Segment met behulp van 3D-gestructureerde verlichting microscopie (3D-SIM) (Video) | JoVE Journal

Het meten van eigenschappen van het membraan periodieke skelet van het Axon Initial Segment met behulp van 3D-gestructureerde verlichting microscopie (3D-SIM)

Meer video's verkennen