Het meten van eigenschappen van het membraan periodieke skelet van het Axon Initial Segment met behulp van 3D-gestructureerde verlichting microscopie (3D-SIM)

Dit protocol maakt het mogelijk om het periodieke membraanskelet in het axon-initiële segment van gekweekte neuronen op te lossen. Door de lokalisatie van eiwitten te onderzoeken kan inzicht worden verkregen in de functie in het membraan periodiek skelet. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de robuustheid en het gebruiksgemak.

Gestructureerde verlichtingsmicroscopie is in staat om het periodieke skelet van het membraan op te lossen en de monstervoorbereiding is eenvoudig en ongecompliceerd. Iedereen met eerdere ervaring in fluorescentiemicroscopie kan deze techniek gemakkelijk implementeren. Dit protocol is ontworpen om de signaal-ruisverhouding tijdens monstervoorbereiding en beeldvorming te maximaliseren.

Om te beginnen, fixeer de neuronen met behulp van 4% paraformaldehyde gedurende 12 minuten bij kamertemperatuur. Was de afdekslip eenmaal in 0,2%BSA in fosfaatbufferoplossing en incubeer gedurende 10 minuten in een 1%-oplossing van Triton X in PBS bij kamertemperatuur. Was de afdekslip met BSA in fosfaatbufferoplossing, verdun de anti-ankyrine G-antilichamen met BSA in een fosfaatbufferoplossing met een verhouding van één tot 200.

Voeg antilichaamoplossing toe aan de afdekslip en incubeer 's nachts bij vier graden Celsius. Was de cellen eenmaal in BSA-fosfaatbufferoplossing eenmaal in 0,1%Triton X in fosfaatbufferoplossing en eenmaal in fosfaatbufferoplossing. Verdun Fluoro 4 gelabeld, voeg meer secundaire antilichamen toe in BSA-fosfaatbufferoplossing en voeg toe aan de afdekslip.

Was de cellen eenmaal in BSA-fosfaatbufferoplossing eenmaal in 0,1%Triton X in fosfaatbufferoplossing en eenmaal in fosfaatbufferoplossing. Bereid een micromolaire oplossing van gelabeld Ferodin in fosfaatbufferoplossing en voeg deze toe aan de cellen. Was de cellen eenmaal in bovine serumalbuminefosfaatbufferoplossing eenmaal in 0,1%Triton X in fosfaatbufferoplossing en eenmaal in fosfaatbufferoplossing.

Voor het monteren van de afdekplaat op een glazen dia, brengt u een druppel montagemedium aan op een dia, dompelt u de afdekplaat in gedeïoniseerd water en tikt u erop met een zachte papieren handdoek om overtollig water te verwijderen. Plaats de afdekslip op de glasplaat en incubeer gedurende 24 uur bij kamertemperatuur. Raadpleeg indien mogelijk het personeel van de microscopiefaciliteit voordat u een afbeelding maakt en gebruik een onderdompelingsoliecalculator om de dompelolie te selecteren die geschikt is voor het monster.

Zodra de monsters klaar zijn, moet u ervoor zorgen dat de afdekslips schoon en vrij van eventuele resten zijn door ze te reinigen met een wattenstaafje gedompeld in water of ethanol. Plaats het monster in een 3D-SIM-microscoop en zoek de cel om het beeld vast te leggen. Pas het vermogen van de relevante laserlijnen aan.

En de belichtingstijden om de signaal-ruisverhouding te maximaliseren zonder het monster aanzienlijk te bleken. Stel de boven- en ondergrenzen van het monster in de Z-dimensie in en ga verder met het verkrijgen van een stapel. Voer het reconstructiealgoritme op de stapel uit om een super opgeloste reconstructie te verkrijgen.

Controleer de reconstructies op bekende artefacten en pas indien nodig de parameters aan om ze te corrigeren. Vergelijk de SIM-reconstructie met een breedveldbeeld om verbeteringen in de resolutie te observeren. Gebruik bij het uitvoeren van meerkleurige gestructureerde verlichtingsmicroscopie het uitlijningsalgoritme om de verschillende kanalen correct uit te lijnen, zodra een bevredigende reconstructie klaar is.

Actineringen in het periodieke skelet van het membraan hebben een onderscheidend periodiek uiterlijk. Maak een projectiebeeld met maximale intensiteit in beeldanalysesoftware met behulp van alle brandpuntsvlakken waar de actineringen zichtbaar zijn. Teken op het projectiebeeld met maximale intensiteit een loodrechte lijn over zichtbare aangrenzende ringen en noteer de fluorescentie-intensiteit samen met de lijnplotprofielfunctie van de software.

Om de gemiddelde interpiekafstand te berekenen, noteert u de lokale maxima in het lijnprofiel en meet u de afstand tussen individuele aangrenzende fluorescentie-intensiteitspieken. Om de colocalisatie van verschillende eiwitten met actineringen in het periodieke membraanskelet te evalueren, voert u een colocalisatieanalyseprocedure uit op SIM-reconstructies van actine en het kandidaat-eiwit. Teken handmatig een selectie om het axon-initiële segment te definiëren als een interessegebied, voor de eenvoudige colocalisatie-plug-in in het softwareplatform, en voer de analyse uit om de correlatiecoëfficiënt van Pearson voor colocalisatie te berekenen.

Tijdens SIM-beeldanalyse toonden de reconstructies van beeldstapels een duidelijke periodiciteit van actineringen. Een anti-ankyrine G-antilichaam werd gebruikt om ankyrine G te visualiseren.De colocalisatie van ankyrine G- en actineringen werd getest in het axon-initiële segment met behulp van een colocalisatie-analyseprocedure om de correlatiecoëfficiënt van Pearson te berekenen. De Pearson-correlatiecoëfficiënt voor colocalisatie van ankyrine G en actineringen fluorescentie was 0,36 plus of min 0,03.

Het is essentieel om de juiste dompelolie te gebruiken en het laservermogen en de belichtingstijd aan te passen om de rasterlijnen zichtbaar te maken. Zodra is vastgesteld dat eiwit deel uitmaakt van het periodieke skelet van het membraan, kan de functie ervan worden onderzocht en vastgesteld bij het onderhouden van het periodieke membraanskelet. De effecten van het neerhalen van het eiwit op actineringen kunnen bijvoorbeeld worden geanalyseerd.

De ontwikkeling van superresolutiemicroscopietechnieken is de reden dat we weten dat het axon-initiële segment een membraan periodiek skelet bevat dat bestaat uit actineringen, spectrum en ankyrine. SIM heeft onderzoekers in staat gesteld om gemakkelijk membraan periodieke skeletcomponenten te visualiseren en naar actineringen in levende cellen te kijken.