Het meten van eigenschappen van het membraan periodieke skelet van het Axon Initial Segment met behulp van 3D-gestructureerde verlichting microscopie (3D-SIM)
11 februari 2022
Het huidige protocol beschrijft een methode om actineringen en andere componenten van het periodieke membraanskelet van het axoninitiële segment te visualiseren en te meten met behulp van gekweekte hippocampale neuronen van ratten en 3D-gestructureerde verlichtingsmicroscopie (3D-SIM).
Dit protocol maakt het mogelijk om het periodieke membraanskelet in het axon-initiële segment van gekweekte neuronen op te lossen. Door de lokalisatie van eiwitten te onderzoeken kan inzicht worden verkregen in de functie in het membraan periodiek skelet. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de robuustheid en het gebruiksgemak.
Gestructureerde verlichtingsmicroscopie is in staat om het periodieke skelet van het membraan op te lossen en de monstervoorbereiding is eenvoudig en ongecompliceerd. Iedereen met eerdere ervaring in fluorescentiemicroscopie kan deze techniek gemakkelijk implementeren. Dit protocol is ontworpen om de signaal-ruisverhouding tijdens monstervoorbereiding en beeldvorming te maximaliseren.
Om te beginnen, fixeer de neuronen met behulp van 4% paraformaldehyde gedurende 12 minuten bij kamertemperatuur. Was de afdekslip eenmaal in 0,2%BSA in fosfaatbufferoplossing en incubeer gedurende 10 minuten in een 1%-oplossing van Triton X in PBS bij kamertemperatuur. Was de afdekslip met BSA in fosfaatbufferoplossing, verdun de anti-ankyrine G-antilichamen met BSA in een fosfaatbufferoplossing met een verhouding van één tot 200.
Voeg antilichaamoplossing toe aan de afdekslip en incubeer 's nachts bij vier graden Celsius. Was de cellen eenmaal in BSA-fosfaatbufferoplossing eenmaal in 0,1%Triton X in fosfaatbufferoplossing en eenmaal in fosfaatbufferoplossing. Verdun Fluoro 4 gelabeld, voeg meer secundaire antilichamen toe in BSA-fosfaatbufferoplossing en voeg toe aan de afdekslip.
Was de cellen eenmaal in BSA-fosfaatbufferoplossing eenmaal in 0,1%Triton X in fosfaatbufferoplossing en eenmaal in fosfaatbufferoplossing. Bereid een micromolaire oplossing van gelabeld Ferodin in fosfaatbufferoplossing en voeg deze toe aan de cellen. Was de cellen eenmaal in bovine serumalbuminefosfaatbufferoplossing eenmaal in 0,1%Triton X in fosfaatbufferoplossing en eenmaal in fosfaatbufferoplossing.
Voor het monteren van de afdekplaat op een glazen dia, brengt u een druppel montagemedium aan op een dia, dompelt u de afdekplaat in gedeïoniseerd water en tikt u erop met een zachte papieren handdoek om overtollig water te verwijderen. Plaats de afdekslip op de glasplaat en incubeer gedurende 24 uur bij kamertemperatuur. Raadpleeg indien mogelijk het personeel van de microscopiefaciliteit voordat u een afbeelding maakt en gebruik een onderdompelingsoliecalculator om de dompelolie te selecteren die geschikt is voor het monster.
Zodra de monsters klaar zijn, moet u ervoor zorgen dat de afdekslips schoon en vrij van eventuele resten zijn door ze te reinigen met een wattenstaafje gedompeld in water of ethanol. Plaats het monster in een 3D-SIM-microscoop en zoek de cel om het beeld vast te leggen. Pas het vermogen van de relevante laserlijnen aan.
En de belichtingstijden om de signaal-ruisverhouding te maximaliseren zonder het monster aanzienlijk te bleken. Stel de boven- en ondergrenzen van het monster in de Z-dimensie in en ga verder met het verkrijgen van een stapel. Voer het reconstructiealgoritme op de stapel uit om een super opgeloste reconstructie te verkrijgen.
Controleer de reconstructies op bekende artefacten en pas indien nodig de parameters aan om ze te corrigeren. Vergelijk de SIM-reconstructie met een breedveldbeeld om verbeteringen in de resolutie te observeren. Gebruik bij het uitvoeren van meerkleurige gestructureerde verlichtingsmicroscopie het uitlijningsalgoritme om de verschillende kanalen correct uit te lijnen, zodra een bevredigende reconstructie klaar is.
Actineringen in het periodieke skelet van het membraan hebben een onderscheidend periodiek uiterlijk. Maak een projectiebeeld met maximale intensiteit in beeldanalysesoftware met behulp van alle brandpuntsvlakken waar de actineringen zichtbaar zijn. Teken op het projectiebeeld met maximale intensiteit een loodrechte lijn over zichtbare aangrenzende ringen en noteer de fluorescentie-intensiteit samen met de lijnplotprofielfunctie van de software.
Om de gemiddelde interpiekafstand te berekenen, noteert u de lokale maxima in het lijnprofiel en meet u de afstand tussen individuele aangrenzende fluorescentie-intensiteitspieken. Om de colocalisatie van verschillende eiwitten met actineringen in het periodieke membraanskelet te evalueren, voert u een colocalisatieanalyseprocedure uit op SIM-reconstructies van actine en het kandidaat-eiwit. Teken handmatig een selectie om het axon-initiële segment te definiëren als een interessegebied, voor de eenvoudige colocalisatie-plug-in in het softwareplatform, en voer de analyse uit om de correlatiecoëfficiënt van Pearson voor colocalisatie te berekenen.
Tijdens SIM-beeldanalyse toonden de reconstructies van beeldstapels een duidelijke periodiciteit van actineringen. Een anti-ankyrine G-antilichaam werd gebruikt om ankyrine G te visualiseren.De colocalisatie van ankyrine G- en actineringen werd getest in het axon-initiële segment met behulp van een colocalisatie-analyseprocedure om de correlatiecoëfficiënt van Pearson te berekenen. De Pearson-correlatiecoëfficiënt voor colocalisatie van ankyrine G en actineringen fluorescentie was 0,36 plus of min 0,03.
Het is essentieel om de juiste dompelolie te gebruiken en het laservermogen en de belichtingstijd aan te passen om de rasterlijnen zichtbaar te maken. Zodra is vastgesteld dat eiwit deel uitmaakt van het periodieke skelet van het membraan, kan de functie ervan worden onderzocht en vastgesteld bij het onderhouden van het periodieke membraanskelet. De effecten van het neerhalen van het eiwit op actineringen kunnen bijvoorbeeld worden geanalyseerd.
De ontwikkeling van superresolutiemicroscopietechnieken is de reden dat we weten dat het axon-initiële segment een membraan periodiek skelet bevat dat bestaat uit actineringen, spectrum en ankyrine. SIM heeft onderzoekers in staat gesteld om gemakkelijk membraan periodieke skeletcomponenten te visualiseren en naar actineringen in levende cellen te kijken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie schetst een protocol voor het visualiseren en meten van actineringen binnen het membraan-periodiek skelet van het axon-initiaal segment met behulp van gekweekte rattenhippocampale neuronen en 3D-gestructureerde verlichtingsmicroscopie (3D-SIM). De techniek stelt onderzoekers in staat om eiwitlokalisatie te onderzoeken, waardoor het begrip van de functie van het membraan-periodiek skelet wordt verbeterd.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Microscopietechniek
Achtergrond
- Het axon-initiaal segment is cruciaal voor neuronale signalering.
- Actineringen spelen een belangrijke rol bij het onderhouden van het membraan-periodiek skelet.
- Gestructureerde verlichtingsmicroscopie verbetert de resolutie bij het afbeelden van biologische monsters.
- Het begrijpen van de lokalisatie van eiwitten biedt inzichten in hun functionele rollen.
Doel van het onderzoek
- Een betrouwbaar protocol vaststellen voor het afbeelden van de actineringen in gekweekte neuronen.
- De componenten van het membraan-periodiek skelet verduidelijken.
- De colocaliserende analyse van verschillende eiwitten in het axon-initiaal segment faciliteren.
Gebruikte methoden
- 3D-gestructureerde verlichtingsmicroscopie gebruikt voor afbeelden.
- Het belangrijkste biologische model omvatte gekweekte rattenhippocampale neuronen.
- Geen vermelding van multiomics workflows gevonden in de tekst.
- Kritieke stappen omvatten fixatie, antilichaam incubatie en voorbereiding voor afbeelden.
- Beeldanalyse werd uitgevoerd om de periodiciteit van actineringen en eiwitcolocalisatie te evalueren.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol maakte de visualisatie van actineringen met een kenmerkende periodiciteit mogelijk.
- Colocalisatie van ankyrin G en actineringen werd gekwantificeerd, wat resulteerde in een Pearson's coëfficiënt van 0,36 ± 0,03.
- Identificatie van de actineringen ondersteunt hun rol in het membraan-periodiek skelet.
- SIM maakte duidelijke resolutieverbeteringen mogelijk in vergelijking met traditionele wide-field beeldvormingsmethoden.
Conclusies
- De studie demonstreert een robuuste methode voor het analyseren van het membraan-periodiek skelet in neuronen.
- Verbeterde beeldtechnieken dragen bij aan het begrip van cellulaire architectuur in neuronale cellen.
- Inzichten uit dit onderzoek leggen de basis voor toekomstig onderzoek naar neuronale eiwitfuncties en hun implicaties in gezondheid en ziekte.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding the structural organization of the axon initial segment's membrane periodic skeleton supports target validation in neuroscience drug discovery by clarifying the spatial context of ion channels and scaffolding proteins. This mechanistic insight enables predictive de-risking of therapeutic hypotheses related to neuronal excitability disorders. The method enhances confidence in target engagement studies by providing quantitative spatial data on protein localization within a disease-relevant subcellular compartment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving the nanoscale architecture of the axon initial segment membrane periodic skeleton.
- Operational Value: Provides a robust, accessible super-resolution method for validating target localization in neuronal models.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking through quantitative assessment of protein periodicity and colocalization with actin rings.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence intensity profiles and Pearson's correlation coefficients for assessing protein-actin ring spatial relationships.
- Operational Value: Delivers reproducible, standardized imaging workflows compatible with multi-well neuronal culture formats.
- Assay Readiness: Produces super-resolved reconstructions that enable reliable detection of subcellular protein localization patterns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links molecular target localization to functional maintenance of the membrane periodic skeleton in a disease-relevant neuronal system.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether candidate proteins are structural components of the axon initial scaffold, informing target selection for neuropsychiatric indications.
- Predictive Confidence: Supports go/no-go decisions by determining if a protein is part of the periodic skeleton prior to functional validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through subcellular resolution and enabling progression to mechanistic studies in neuronal models.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by determining if a protein exhibits periodic localization consistent with membrane periodic skeleton integration.
- Screening: Enables assay development for high-content analysis of protein localization patterns in fixed neuronal cultures.
- Analytics: Provides quantitative readouts including inter-peak distance measurements and colocalization coefficients for objective comparison across conditions.
- Translational Research: Connects molecular findings to structural integrity of the axon initial segment, a key determinant of neuronal polarity and signaling.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized imaging platform applicable to multiple targets across neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by defining the nanoscale spatial organization of axon initial segment proteins.
- Operational Value: Offers ease of use and robustness, requiring only standard fluorescence microscopy experience and accessible super-resolution instrumentation.
- Strategic Value: Improves target selection confidence by validating subcellular localization before investing in functional assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their integration into the axon initial segment scaffold.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence microscopy and super-resolution imaging principles.
- Dependent on access to 3D-SIM instrumentation and appropriate immersion oil optimization.
- Necessitates standardized antibody validation and blocking conditions to minimize nonspecific signal.
- Involves careful laser power and exposure calibration to balance signal-to-noise ratio with photobleaching.
- Applicable primarily to fixed neuronal cultures; live-cell applications require additional validation.
