Cryo-gestructureerde verlichting Microscopische gegevensverzameling van cryogene geconserveerde cellen

Deze methode maakt cryobeeldvorming met superresolutie mogelijk op hele biologische cellen om cellulaire structuren nauwkeurig te identificeren. Het kan ook worden gebruikt in combinatie met andere modaliteiten als onderdeel van een correlatieve beeldvormingsworkflow. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat superresolutie beeldvorming snel kan worden gedaan in cryogene omstandigheden met behulp van conventionele fluoroforen en relatief lage lichtdoses.

CyroSIM is een krachtig hulpmiddel dat inzicht biedt in het begrijpen van cellulaire ultrastructuurdynamiek in reactie op interne of externe signalen. De toepassing ervan omvat vaccinproductie en -uitrol, kwaliteitscontrole, post-market surveillance, antilichaam engineering en optimalisatie, evenals nanodeeltjeskarakterisering. Het manoeuvreren van monsters binnen de cryo-fase vergt oefening om de veiligheid van het net te waarborgen.

Het is ook het beste om vertrouwd te raken met de bedieningselementen in het Cockpit-venster voordat u gegevens gaat verzamelen. Verwijder om te beginnen het deksel van de externe Dewar van de cryo-trap en giet gefilterde vloeibare stikstof totdat deze ongeveer een kwart vol is. Wacht tot het eerste koken is verdwenen voordat je het meer giet en vul het vat tot ongeveer tweederde vol.

Plaats het deksel voorzichtig terug en wijs het mondstuk weg van de handler terwijl de vloeibare stikstof uitkookt. Zodra de vloeibare stikstof niet meer uit de uitlaat komt, plaatst u de uitlaatpijp over het podium Dewar op de cryo-trap. Sluit de voedingsbron aan, sluit de USB-kabel aan en sluit de externe Dewar aan op het podium.

Druk na toediening van vloeibare stikstof op de ontspanknop op de cryotrap om deze in de monsterkamer te laten komen en wacht 30 tot 45 minuten totdat het systeem is afgekoeld en gestabiliseerd voordat het begint met beeldacquisitie. Gebruik de in-in-in-toets op het cassettegereedschap om de twee platen van de sample transfer cassette te openen. Open de platen wijd genoeg om het rooster tussen de twee platen te laten vallen, maar open niet naar de maximale positie.

Gebruik een lange tang om de monsterroosterdoos uit de vloeibare stikstof te tillen. Draai deze zo dat de inkeping uitlijnt met de opslagpositie in het werkgebied en plaats deze op het werkgebied. Gebruik het juiste apparaat om het deksel van de opbergdoos in de juiste monsterpositie te openen.

Verwijder met behulp van een omgekeerde tang het TEM-rooster uit de monsterhouder, dompel het onder in de vloeibare stikstof en zorg ervoor dat de koolstoffilmzijde zo wordt geplaatst dat deze uiteindelijk naar het doel op de monsterbrug wordt gericht en laat deze in de monsteroverdrachtscassette vallen. Sluit de monstercartridge met de in-in-toets op het cassettegereedschap. Gebruik het magneetpunt op het cassettegereedschap om de cartridge met het rooster op de monsterbrug te tillen en te monteren.

Houd het ondergedompeld of dicht bij de vloeibare stikstof en in de juiste oriëntatie. Plaats de cassette plat in de positioneringspennen van de brug en duw hem voorzichtig om ervoor te zorgen dat deze vastzit. Sluit en verwijder de opbergdoos samen met eventuele resterende monsters.

Verplaats de opening van het cryotrapdeksel naar de beeldvormingspositie en schakel het lampje van de monsterkamer uit. Schuif het podium naar de optiek om het onder de objectieflens uit te lijnen en laat het objectief vervolgens voorzichtig in positie vallen met behulp van de hendel, zorg ervoor dat het in het deksel van de cryo-trap rust, maar het niet raakt. Bedek het podium en de optiek met een ondoorzichtig zwart gordijn en start vervolgens de besturingssoftware Cockpit op de cryoSIM-pc. Klik op de uitleesmodusknop voor elke camera en stel deze in op CONV3 megahertz.

Controleer of de temperatuur van elke camera 80 graden Celsius is en of de ventilator van de camera is uitgeschakeld. Schakel de gereflecteerde camera in, onder licht, kies ambient en onder linkam, controleer de condensor en klik vervolgens op de videomodusknop. Zoom in het venster Mozaïekweergave uit om de rasteromtrek te zien.

Klik op Werkgebied zoeken als het niet kan worden gezien en centreer het raster door met de linkermuins in het midden van de cirkel te dubbelklikken. Gebruik de toetsen omhoog en omlaag om het monster scherp te stellen totdat de rasterondersteuningsfilm of een andere relevante functie scherp is. Gebruik de toetsen negen en drie op het numerieke toetsenblok om de Z-stap te wijzigen.

Zodra het podium is gecentreerd, schakelt u de videomodus uit. Verzamel een zichtbaar lichtmozaïek door in de mozaïekweergave op Mozaïek uitvoeren te klikken om tegels met zichtbare lichtafbeeldingen te produceren die vanuit het midden naar buiten spiralen. Sla de weergave op door op Mozaïek opslaan te klikken.

Inspecteer het Bright-field mozaïek naast eerdere fluorescentiekaartbeelden door het omgevingslicht en de condensor en de videomodus uit te schakelen, schakel vervolgens de vereiste excitatielaser in en kies de bijbehorende camera en filter, in eerste instantie bij 50 milliwatt voor een belichtingstijd van 50 milliseconden. Druk op nul om een afbeelding te maken en op automatisch contrast van ster tot ster. U kunt het contrast ook handmatig aanpassen met de schuifregelaar onder aan de afbeelding.

Zodra biologisch interessante cellen met geschikte fluorescentie zijn gevonden, markeert u hun posities met behulp van de knop Markeerplaats in de mozaïekweergave. Ga door met het markeren van alle potentiële sites voordat u begint met het verwerven van afbeeldingen. Sla het mozaïek opnieuw op met de gemarkeerde sites door op Sites opslaan in bestand te klikken.

Om de mozaïekafbeelding te naaien met behulp van de stitchEm-software, sleept u het tekstmozaïekbestand naar het stitchEm-bestand met de extensie BAT en slaat u de gecombineerde TIF-afbeelding van de mozaïektegels op in dezelfde map. Als u een afbeelding met de gemarkeerde sites wilt opslaan, sleept u het mozaïektekstbestand en het tekstbestand met de markeringen tegelijkertijd naar het pictogram. Stel de laserbelichtingstijd in op basis van het aantal en het dynamisch bereik in het fluorescentiebeeld onder aan het cameraweergavevenster.

Kies welk filter u wilt toepassen en optimaliseer de instellingen voor elke golflengte van het te gebruiken excitatielicht, waarbij elke laser afzonderlijk wordt ingeschakeld. Klik op beide camera's om ze in te schakelen. Keer terug naar een van de gemarkeerde locaties en concentreer je opnieuw op de gewenste diepte.

Eenmaal scherp in een interessegebied, ga je onscherp met de pijl-omhoogtoets in het XY-venster op de macrofase om de hoogte van de Z-stack te kiezen en klik je op Bovenaan opslaan. Ga onscherp met de pijl-omlaag, klik op Opslaan onder en vervolgens op Ga naar het midden en controleer of de afbeelding nog steeds scherp is. Selecteer in het cockpitvenster De optie Experiment met één locatie.

Selecteer gestructureerde verlichting in de vervolgkeuzelijst. Wijzig de stapelhoogte zodat deze gelijk is aan de Z-hoogte plus één micrometer. Voer de belichtingstijden in milliseconden in voor de 405- en 488 nanometerlasers in de bovenste rij voor de gereflecteerde camera en de belichtingstijden voor de 561- en 647 nanometerlasers in de onderste rij voor de verzonden camera.

Voer een bestandsnaam in en klik op bijwerken om een nieuw bestand met de datum en tijd te produceren zonder de vorige bestanden te overschrijven en klik vervolgens op Start. Als de vloeibare stikstof Dewar de cryo-fase tijdens de beeldacquisitie bijvult, moet u het proces afbreken door op de knop ABORT in de Cockpit-software te klikken. Verzamel op elke positie een Z-stack met zichtbaar licht door de lasers uit te schakelen en het omgevingslicht en de condensor in te schakelen.

Selecteer onder Single-site experiment de optie Z-stack en stel het omgevingslicht in op 20 milliseconden belichting, waarbij de Z-hoogte behouden blijft. Herhaal dit proces voor alle gemarkeerde sites. Nadat de beeldvorming is voltooid, koppelt u het podium los en verwijdert u alle monsters.

Schakel het lampje van de monsterkamer uit. Koppel de externe Dewar los en decanteer alle resterende vloeibare stikstof in een andere cryo-compatibele container, zodat de Dewar veilig kan terugkeren naar een normale temperatuur. Wacht tot de optie om het cryo-stage display uit te bakken beschikbaar komt nadat er geen vloeibare stikstof meer in het stadium Dewar is achtergestaan.

Druk op de knop Uitbakken om de verwarmingsmodus te openen. Plaats de dekselplug op de cryo-trap. De resolutie in cryoSIM is aanzienlijk hoger dan die in standaard epifluorescentiemicroscopie.

De fluorescentiekaart van een conventionele epifluorescentiemicroscoop kan worden gebruikt om gebieden te lokaliseren die van belang zijn voor beeldvorming en het bijbehorende cryoSIM-beeld kan worden verkregen vanaf een locatie op het raster. Een monster met U2OS-cellen werd gekleurd met een mengsel van groene microtubulicysteskeletkleurstof en rode mitochondriale kleurstof, wat resulteerde in de kleuring van de microtubulecomponent van het cytoskelet en de mitochondriën. Latere beeldvorming toonde de lokalisatie van mitochondriën in de cel, evenals de rangschikking van de microtubuli, waarbij het structurele kader dat ze aan de cel bieden en de assemblage van het cytoskelet rond organellen werd benadrukt.

Het SIM-reconstructieproces kan artefacten produceren die kunnen worden geïdentificeerd met behulp van SIMCheck, een gratis imageJ-plug-in. Deze modulatiecontrastkaart gegenereerd met SIMCheck toont gebieden met een laag modulatiecontrast binnen het kerngebied, wat aangeeft dat dit gebied gevoeliger zal zijn voor reconstructieartefacten. De witte pijl duidt op een reconstructie-artefact.

Wanneer u dit protocol probeert, moet u ervoor zorgen dat het monster te allen tijde ondergedompeld blijft of dicht bij vloeibare stikstof blijft om ontglazing te voorkomen. Let ook op belichtingstijden en tellingen in het dynamisch bereik, omdat dit de kwaliteit van de gegevens beïnvloedt en laserschade aan het monster voorkomt. Na cryo-beeldvorming kunnen dezelfde monsters worden afgebeeld met andere modaliteiten zoals cryozachte röntgentomografie, die we hier bij de B24 Beamline hebben.

Door cryoSIM-beelden te combineren met beelden met structurele informatie over de cel, kunnen we belangrijke aanvullende vragen over cellulaire ultrastructuur en functie beantwoorden.