Name: Cryo-gestructureerde verlichting Microscopische gegevensverzameling van cryogene geconserveerde cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Leer cryoSIM voor superresolutiebeeldvorming van fluorescerend gelabelde celstructuren in U2OS-cellen. Deze methode combineert 3D-SIM met cryogene temperaturen voor behoud van native ultrastructuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project heeft financiering ontvangen van het Horizon 2020 iNEXT-Discovery-project van de Europese Commissie. I.M. Dobbie erkent de financiering van de Wellcome Trust (107457/Z/15/Z). Dit werk werd uitgevoerd met de steun van de Diamond Light Source, instrument B24 (voorstel BI25512). Onze dank gaat uit naar het personeel van Micron en al onze uitstekende gebruikers en medewerkers voor het helpen opzetten van de cryoSIM en het bijbehorende potentieel.

<ol><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+demystified%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li>
<li>Ball, G., Demmerle, J., Kaufmann, R., Davis, I., Dobbie, I. M., Schermelleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMcheck%3A+A+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">SIMcheck: A toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15915(2015).</li>
<li>Kounatidis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Correlative+cryo-structured+illumination+fluorescence+and+soft+X-ray+microscopy+elucidates+reovirus+intracellular+release+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">3D Correlative cryo-structured illumination fluorescence and soft X-ray microscopy elucidates reovirus intracellular release pathway.</a> Cell. 182 (2), 515-530 (2020).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Rego, E. H., Shao, L., Rego, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Practical structured illumination microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 1251(2015).</li>
<li>Phillips, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSIM%3A+super-resolution+3D+structured+illumination+cryogenic+fluorescence+microscopy+for+correlated+ultrastructural+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging.</a> Optica. 7 (7), 802(2020).</li>
<li>Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+and+fiducial-marker-free+correction+for+three-dimensional+chromatic+shift+in+biological+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy.</a> Scientific Reports. 8, 7583(2018).</li>
<li>Kaufmann, R., Hagen, C., Grünewald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+cryo-microscopy%3A+current+challenges+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence cryo-microscopy: current challenges and prospects.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 20, 86-91 (2014).</li>
<li>Phillips, M. A., Pinto, D. M. S., Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPEKcheck-fluorescence+microscopy+spectral+visualisation+and+optimisation%3A+a+web+application%2C+javascript+library%2C+and+data+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Wellcome+Open+Research%22%5BJournal%5D)">SPEKcheck-fluorescence microscopy spectral visualisation and optimisation: a web application, javascript library, and data resource.</a> Wellcome Open Research. 3, 92(2018).</li>
<li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige financiële belangen te hebben.

3D SIM bij cryogene temperaturen heeft veel voordelen ten opzichte van andere SR-beeldvormingstechnieken voor het afbeelden van verglaasd biologisch materiaal. Het vereist aanzienlijk minder beelden per z-plak in vergelijking met andere SR-methoden, wat resulteert in minder bestraling en een lagere kans op ijskristalvorming voor verglaasde monsters. Het is ook in staat om hele cellen in beeld te brengen en kan worden gecorreleerd met röntgentomografie om structuur en functie te matchen. Interessant is dat de meeste in de handel verkrijgbare fluoroforen en fluorescentietags minder bleken onder cryogene omstandigheden dan bij kamertemperatuur. Gezien de hoge kwantumopbrengst van de meest voorkomende fluoroforen bij kamertemperatuur (meer dan 80% in sommige gevallen), is de absolute winst die in fotonen wordt gedetecteerd echter niet te wijten aan veranderingen in de kwantumopbrengst, maar aan een vermindering van de complexe bleekprocessen. Meer informatie over de opbrengst van fluoroforen bij cryogene temperaturen is te vinden in 8.
Het is van cruciaal belang dat monsters die bij de cryoSIM aankomen, zijn voorbereid met behulp van een conventionele cryofluorescentiemicroscoop met brightfield-mogelijkheid om een raster "kaart" te produceren die alle potentiële AOIs voor verdere beeldvorming omvat(figuur 5). Toegangstijd bij de cryoSIM wordt toegewezen via een competitief proces waarbij een voorstel wordt ingediend, dat vervolgens wordt beoordeeld op haalbaarheid van de techniek en biomedische impact. De tijd bij de apparatuur is daarom altijd "at a premium", en vooraf toegewezen netten maken het meest efficiënte gebruik van een toewijzing mogelijk. Het is ook essentieel dat het monster verglaasd blijft, vooral tijdens de overdracht van het monster van de monsterhouder naar het beeldvormingsplatform, om de vorming van ijskristallen en de daaropvolgende monsterschade te minimaliseren. Het monster moet van goede kwaliteit zijn om de beste SIM-beelden te produceren. Een goed voorbereid monster zal worden gekenmerkt door de volgende kenmerken: (a) het zal geen ijskristalverontreiniging hebben, (b) het gebruikte raster zal een vinderraster zijn, (c) de drager zal plat zijn, (d) het rastergaas en het substraatoppervlak zullen niet auto-fluorescerend zijn, en (e) er zullen geen breuken in het ondersteuningsmembraan zijn. Deze voorwaarden kunnen worden bereikt door zorgvuldige monsterbehandeling en ervoor te zorgen dat monsters altijd verglaasd blijven.
Het is belangrijk om van tevoren te controleren of voorgestelde monsterfluooforen voldoende signaal geven in de cryoSIM-microscoop. Tools zoals SPEKCheck9 kunnen helpen bij het kiezen van de optimale fluorofoor- en filtercombinaties. Als er problemen zijn met de ruwe gegevensverzameling of het reconstructieproces, kunnen artefacten na de reconstructie in de afbeeldingen verschijnen. Voorbeelden van verschillende artefacten zijn gedocumenteerd door Demmerle et al.10 De beeldreconstructieparameters kunnen in het SoftWoRx-logbestand worden bekeken als de reconstructie niet optimaal is door het reconstructiesamenvattingsbestand te openen. Er moet een consistente lijnafstand zijn tussen hoeken in een bepaald kanaal en een relatief consistente amplitude. Variatie van meer dan 30% en waarden aanzienlijk boven 1 (als vergoeding voor de kraalgrootte wordt toegepast) moeten nader worden onderzocht en wijzen waarschijnlijk op mislukte reconstructies. Bovendien kan de SIMcheck2-software in Fiji ook worden gebruikt om verschillende controles uit te voeren op de onbewerkte en gereconstrueerde gegevens om de oorzaak van fouten in de instellingen van de beeldvormings- of reconstructieparameter te diagnosticeren. SIM-check en de modulatiecontrastkaart kunnen ook helpen bij de beoordeling van de kwaliteit van gereconstrueerde gegevens door te interpreteren welke delen van een afbeelding waarschijnlijk echte structuren versus artefacten zijn.
Een laag modulatiecontrast (weergegeven door donkere kleur, in figuur 5E)binnen het nucleaire gebied betekent dat dit gebied gevoeliger zal zijn voor reconstructieartefacten, wat impliceert dat de hash-patronen die in de kern worden getoond, kunnen worden geclassificeerd (Figuur 5D) als een artefact. Sterke fluorescentiesignaalgebieden hebben meer kans om inheemse structuren in de verwerkte gegevens nauwkeurig weer te geven. In gebieden met een zwak signaal waar fluoroforen over grotere gebieden zijn verdeeld, zoals het totale oppervlak van een blaasje, is het waarschijnlijk dat echt signaal naast verwerkingsartefacten bestaat, en er moet voorzichtig worden omgegaan met de interpretatie van die gegevens. Na inspectie van de volledig gereconstrueerde gegevens om ervoor te zorgen dat er geen vreemde artefacten zijn, en dat de achtergrond over het algemeen Gaussisch is en gecentreerd in de buurt van nul, worden de gegevens over het algemeen op nul geknipt, of de modale waarde - de piek van het achtergrondsignaal - zou zeer dicht bij nul moeten zijn. Dit zorgt ervoor dat het dynamisch bereik van de weergegeven afbeelding niet wordt gedomineerd door negatieve achtergrondartefacten. Wanneer een zwakker signaal wordt verwacht, moet extra zorg worden besteed aan het analyseren van de kenmerken en ervoor te zorgen dat het echte structuren zijn in plaats van reconstructie-artefacten.
Er zijn enkele beperkingen van het beeldvormingssysteem. Omdat het monsterstadium vlak is, zijn monsters met variabele dikte of rasters die niet vlak zijn, geen ideale onderwerpen voor beeldvorming. Bovendien, als correlatieve beeldvorming zal worden gedaan met behulp van zachte röntgentomografie, mogen cellen in de buurt van rastergrenzen niet in beeld worden gebracht, omdat deze niet zichtbaar zijn in de röntgenmicroscoop tijdens de acquisitie van tilt-series. Ten slotte heeft de hoeveelheid vloeien van het monster vóór het invriezen een aanzienlijke invloed op de beeldkwaliteit; te weinig blotting resulteert in monsters die te dik zijn, wat suboptimale SIM-beelden met hoge achtergrondruis oplevert, terwijl te veel blotting ervoor kan zorgen dat cellen misvormd raken en daarom vatbaarder zijn voor hitteschade door de invallende laserstraal. Kortom, cryoSIM is een krachtig fluorescentiemicroscopie-hulpmiddel voor het in beeld brengen van biologische monsters in 3D in een bijna-native stadium en heeft brede toepassingen op veel gebieden.

SR-beeldvormingstechnieken zijn het afgelopen decennium breed toegankelijk geworden voor biologen1. Ze maken beeldvorming met hoge resolutie mogelijk van fluorescerend gelabelde monsters voorbij de diffractielimiet. Het was echter een uitdaging om SR-microscopiemethoden aan te passen om met monsters bij cryogene temperaturen te werken2. Dit zou voordelig zijn voor correlatieve beeldvorming in combinatie met elektronen- of röntgentomografie. Onlangs is SIM aangepast voor gebruik met cryogene monsters en is met succes aangetoond dat het correlatieve studies van biologische cellen mogelijk maakt in combinatie met zachte röntgentomografie (SXT)3 op de correlatieve cryo-imaging beamline B24 op de Diamond Light Source Synchrotron (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html). SIM kan de resolutie van conventionele breedveldmicroscopie verdubbelen door het monster te verlichten met gestreepte lichtpatronen (Moiré-franjes) onder drie hoeken en in vijf fasen. De interferentie tussen deze lichtpatronen en de fluorescentie van het monster kan worden gebruikt om computationeel extra informatie over subdiffractiestructuren te ontdekken4,5.
Er zijn verschillende voordelen van SIM ten opzichte van andere SR-technieken voor cryogene toepassingen. Ten eerste kan het werken zonder speciaal ontworpen knipperende fluoroforen; conventionele fluoroforen kunnen worden gebruikt, waardoor toegang wordt gegeven tot een breder scala aan potentiële fluorescerende taggingmiddelen6. Bovendien vereist het slechts 15 afbeeldingen per z-segment (in 3D; 9 afbeeldingen voor 2D), terwijl andere SR-methoden ongeveer 1000 afbeeldingen per plak nemen, waardoor de kans toeneemt dat het monster wordt verwarmd en daarom het risico op ijskristalvorming toeneemt, wat artefacten kan veroorzaken. Ten slotte kan deze techniek dikkere biologische monsters van meer dan 10 μm in beeld brengen, waardoor hele cellen in hun bijna-oorspronkelijke toestand kunnen worden afgebeeld6. De cryoSIM is gebouwd met behulp van standaard optische componenten en met open-access software voor beeldvorming, waardoor het eenvoudig te documenteren en te dupliceren is indien gewenst6. De cryoSIM heeft een 100x/0.9 numeriek diafragma objectief (zie de Tabel van Materialen); meer informatie over de optische componenten, ontwerpparameters en prestaties is beschreven door Phillips et al.6 Hier laat dit protocol zien hoe de cryoSIM-microscoop moet worden gebruikt, inclusief hoe monsters op de cryogene fase moeten worden geladen en gelost, hoe gegevens op de microscoop kunnen worden verzameld en hoe de SIM-beelden kunnen worden gereconstrueerd.

<table><tbody><tr><td>Auto grids</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autogrids</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1036173</td><td></td></tr><tr><td>BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCT142</td><td></td></tr><tr><td>Cockpit Software</td><td>Oxford University</td><td></td><td>https://github.com/MicronOxford/cockpit</td></tr><tr><td>cryo compatible polyurethane container</td><td>Jena bioscience</td><td>CC-FD-800</td><td></td></tr><tr><td>Cryo TEM grid storage box</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Model#AutoGrid</td><td></td></tr><tr><td>cryo-SIM microscope</td><td>Custom made</td><td>N/A</td><td>Custom made, see following reference for the design:&nbsp; Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis, and Ian M. Dobbie, "CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging," Optica 7, 802-812 (2020). Has a Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cryostage system</td><td>Linkam Scientific Instruments</td><td>CMS196</td><td></td></tr><tr><td>Fine tip surgical forceps</td><td>Ted Pella</td><td>38125</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Deep Red FM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M22426</td><td></td></tr><tr><td>Python Microscope Software</td><td>Oxford University</td><td></td><td>https://www.python-microscope.org/</td></tr><tr><td>Scientific dry paper wipes</td><td>Kimberly-Clark 7551</td><td>2</td><td></td></tr><tr><td>SIM Reconstruction Software</td><td>softWoRx, GE Healthcare</td><td>Version&nbsp; 6.5.2</td><td></td></tr><tr><td>StitchM Software</td><td>Diamond Light Source</td><td></td><td>https://github.com/DiamondLightSource/StitchM</td></tr><tr><td>TEM grids for samples</td><td>Quantifoil Micro Tools</td><td>G200F1</td><td></td></tr></tbody></table>

cryo-gestructureerde verlichting microscopische gegevensverzameling van cryogene geconserveerde cellen

Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells

Driedimensionale (3D) gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM) maakt beeldvorming van fluorescerend gelabelde cellulaire structuren met een hogere resolutie mogelijk dan conventionele fluorescentiemicroscopie. Deze superresolutie (SR) techniek maakt visualisatie van moleculaire processen in hele cellen mogelijk en heeft het potentieel om te worden gebruikt in combinatie met elektronenmicroscopie en röntgentomografie om structurele en functionele informatie te correleren. Een SIM-microscoop voor cryogenisch geconserveerde monsters (cryoSIM) is onlangs in gebruik genomen bij de correlatieve cryo-imaging beamline B24 bij het Britse synchrotron. 
Het is speciaal ontworpen voor 3D-beeldvorming van biologische monsters bij cryogene temperaturen op een manier die compatibel is met latere beeldvorming van dezelfde monsters door röntgenmicroscopiemethoden zoals cryo-zachte röntgentomografie. Dit video-artikel biedt gedetailleerde methoden en protocollen voor succesvolle beeldvorming met behulp van de cryoSIM. Naast instructies over de werking van de cryoSIM-microscoop zijn aanbevelingen opgenomen met betrekking tot de keuze van monsters, fluoroforen en parameterinstellingen. Het protocol wordt gedemonstreerd in U2OS-celmonsters waarvan de mitochondriën en tubuline fluorescerend zijn gelabeld.

Een monster met U2OS-cellen werd gekleurd met een mengsel van groene microtubule cytoskeletkleurstof en rode mitochondriale kleurstof, wat resulteerde in de kleuring van de microtubulecomponent van het cytoskelet (groen) en de mitochondriën (rood). Latere beeldvorming toonde de lokalisatie van mitochondriën in de cel en de rangschikking van de microtubuli, waarbij het structurele kader dat ze aan de cel bieden en de assemblage van het cytoskelet rond organellen zoals de kern werd benadrukt. De resolutie in cryoSIM is significant hoger dan die in standaard epifluorescentiemicroscopie (figuur 5). Figuur 6 laat zien hoe de fluorescerende "kaart" van een conventionele epifluorescentiemicroscoop kan worden gebruikt om gebieden te lokaliseren die van belang zijn voor beeldvorming en het bijbehorende cryoSIM-gereconstrueerde beeld vanaf een locatie op het raster.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig01.jpg"> Figuur 1: Stroomdiagram met de stadia van het cryoSIM-beeldvormingsprotocol. Afkorting: cryoSIM = Cryo-structured illumination microscopy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig02.jpg"> Figuur 2: De cryo-fase. (A) De cryo-fase opstelling. B) Een monsterrooster dat wordt aangegeven door een omgekeerde tang. (C) Onderdelen van de cryofase. De aansluitpoorten zijn gelabeld, met de kleuren die overeenkomen met oranje: voeding, geel: verwarmd podiumdeksel, blauw: extern dewar, groen: verbinding met pc. Afkortingen: PC = personal computer; LN2 = vloeibare stikstof. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig03.jpg"> Figuur 3: Weergaven van de Cockpit-softwarepanelen. (A) Hoofdpaneel, (B) macrofase XY, (C) mozaïekweergave, (D) cameraweergaven. Afkorting: SLM = spatial light modulator. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig04.jpg"> Figuur 4: Weergaven van de Cockpit-softwarepanelen. (A) Z stapelen enkel site-experiment. (B) SI single site experiment. (C) Sneltoetsen voor de cockpitsoftware die wordt gebruikt tijdens het verkrijgen van afbeeldingen. DDecryoSIM microscoop bevindt zich ter plaatse bij beamline B24 bij de Diamond Light Source synchrotron. Afkorting: cryoSIM = Cryo-structured illumination microscopy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig05.jpg"> Figuur 5: Resolutie van cryoSIM. (A) Mozaïekweergave van een onderzocht raster. (B) Brightfield afbeelding van een Area of Interest (AOI). (C) Pseudo-widefield-afbeelding in vergelijking met de (D) SIM-afbeelding die de toename van de resolutie laat zien. De witte pijl geeft sim-reconstructieartefacten aan. (E) Modulatiecontrastkaart die de pixelintensiteitsinformatie van het gereconstrueerde beeld combineert met de kleurinformatie van de respectieve modulatie contrast-ruisverhouding (MCNR) waarden van de ruwe gegevens gegenereerd door SIMCheck2. De heldere en donkere gebieden vertonen respectievelijk een hoog en laag contrast. Schaalbalk = 10 μm. CryoSIM-beeldvormingsinstellingen: excitatie/emissiegolflengten: 488/525 nm, 50 mW laservermogen, 50 ms belichtingstijd en 647/655 nm, 20 mW laservermogen, 5 ms belichtingstijd. Afkorting: cryoSIM = Cryo-structured illumination microscopy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig06.jpg"> Figuur 6: Beeldreconstructie in cryoSIM vanaf een locatie op het raster in een fluorescentiekaart van een conventionele epifluorescentiekaart. (A,B) Overlay van brightfield- en fluorescentiebeeldkaarten gegenereerd met een conventionele epifluorescentiemicroscoop. Deze kaart wordt gebruikt om interessante regio's te lokaliseren om vervolgens in cryoSIM in beeld te brengen. (C) Het gereconstrueerde cryoSIM-beeld verkregen op de in (B) aangegeven plaats . Afkorting: cryoSIM = Cryo-structured illumination microscopy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit protocol demonstreert hoe biologische cryo-geconserveerde monsters kunnen worden afgebeeld met behulp van cryo-gestructureerde verlichtingsmicroscopie. We demonstreren de methodologie door het cytoskelet van U2OS-cellen in beeld te brengen.

Cryo-gestructureerde verlichting Microscopische gegevensverzameling van cryogene geconserveerde cellen

Three-dimensional (3D) structured illumination microscopy (SIM) allows imaging of fluorescently labelled cellular structures at higher resolution than ...

Deze methode maakt cryobeeldvorming met superresolutie mogelijk op hele biologische cellen om cellulaire structuren nauwkeurig te identificeren. Het kan ook worden gebruikt in combinatie met andere modaliteiten als onderdeel van een correlatieve beeldvormingsworkflow. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat superresolutie beeldvorming snel kan worden gedaan in cryogene omstandigheden met behulp van conventionele fluoroforen en relatief lage lichtdoses.CyroSIM is een krachtig hulpmiddel dat inzicht biedt in het begrijpen van cellulaire ultrastructuurdynamiek in reactie op interne of externe signalen. De toepassing ervan omvat vaccinproductie en -uitrol, kwaliteitscontrole, post-market surveillance, antilichaam engineering en optimalisatie, evenals nanodeeltjeskarakterisering. Het manoeuvreren van monsters binnen de cryo-fase vergt oefening om de veiligheid van het net te waarborgen.Het is ook het beste om vertrouwd te raken met de bedieningselementen in het Cockpit-venster voordat u gegevens gaat verzamelen. Verwijder om te beginnen het deksel van de externe Dewar van de cryo-trap en giet gefilterde vloeibare stikstof totdat deze ongeveer een kwart vol is. Wacht tot het eerste koken is verdwenen voordat je het meer giet en vul het vat tot ongeveer tweederde vol.Plaats het deksel voorzichtig terug en wijs het mondstuk weg van de handler terwijl de vloeibare stikstof uitkookt. Zodra de vloeibare stikstof niet meer uit de uitlaat komt, plaatst u de uitlaatpijp over het podium Dewar op de cryo-trap. Sluit de voedingsbron aan, sluit de USB-kabel aan en sluit de externe Dewar aan op het podium.Druk na toediening van vloeibare stikstof op de ontspanknop op de cryotrap om deze in de monsterkamer te laten komen en wacht 30 tot 45 minuten totdat het systeem is afgekoeld en gestabiliseerd voordat het begint met beeldacquisitie. Gebruik de in-in-in-toets op het cassettegereedschap om de twee platen van de sample transfer cassette te openen. Open de platen wijd genoeg om het rooster tussen de twee platen te laten vallen, maar open niet naar de maximale positie.Gebruik een lange tang om de monsterroosterdoos uit de vloeibare stikstof te tillen. Draai deze zo dat de inkeping uitlijnt met de opslagpositie in het werkgebied en plaats deze op het werkgebied. Gebruik het juiste apparaat om het deksel van de opbergdoos in de juiste monsterpositie te openen.Verwijder met behulp van een omgekeerde tang het TEM-rooster uit de monsterhouder, dompel het onder in de vloeibare stikstof en zorg ervoor dat de koolstoffilmzijde zo wordt geplaatst dat deze uiteindelijk naar het doel op de monsterbrug wordt gericht en laat deze in de monsteroverdrachtscassette vallen. Sluit de monstercartridge met de in-in-toets op het cassettegereedschap. Gebruik het magneetpunt op het cassettegereedschap om de cartridge met het rooster op de monsterbrug te tillen en te monteren.Houd het ondergedompeld of dicht bij de vloeibare stikstof en in de juiste oriëntatie. Plaats de cassette plat in de positioneringspennen van de brug en duw hem voorzichtig om ervoor te zorgen dat deze vastzit. Sluit en verwijder de opbergdoos samen met eventuele resterende monsters.Verplaats de opening van het cryotrapdeksel naar de beeldvormingspositie en schakel het lampje van de monsterkamer uit. Schuif het podium naar de optiek om het onder de objectieflens uit te lijnen en laat het objectief vervolgens voorzichtig in positie vallen met behulp van de hendel, zorg ervoor dat het in het deksel van de cryo-trap rust, maar het niet raakt. Bedek het podium en de optiek met een ondoorzichtig zwart gordijn en start vervolgens de besturingssoftware Cockpit op de cryoSIM-pc. Klik op de uitleesmodusknop voor elke camera en stel deze in op CONV3 megahertz.Controleer of de temperatuur van elke camera 80 graden Celsius is en of de ventilator van de camera is uitgeschakeld. Schakel de gereflecteerde camera in, onder licht, kies ambient en onder linkam, controleer de condensor en klik vervolgens op de videomodusknop. Zoom in het venster Mozaïekweergave uit om de rasteromtrek te zien.Klik op Werkgebied zoeken als het niet kan worden gezien en centreer het raster door met de linkermuins in het midden van de cirkel te dubbelklikken. Gebruik de toetsen omhoog en omlaag om het monster scherp te stellen totdat de rasterondersteuningsfilm of een andere relevante functie scherp is. Gebruik de toetsen negen en drie op het numerieke toetsenblok om de Z-stap te wijzigen.Zodra het podium is gecentreerd, schakelt u de videomodus uit. Verzamel een zichtbaar lichtmozaïek door in de mozaïekweergave op Mozaïek uitvoeren te klikken om tegels met zichtbare lichtafbeeldingen te produceren die vanuit het midden naar buiten spiralen. Sla de weergave op door op Mozaïek opslaan te klikken.Inspecteer het Bright-field mozaïek naast eerdere fluorescentiekaartbeelden door het omgevingslicht en de condensor en de videomodus uit te schakelen, schakel vervolgens de vereiste excitatielaser in en kies de bijbehorende camera en filter, in eerste instantie bij 50 milliwatt voor een belichtingstijd van 50 milliseconden. Druk op nul om een afbeelding te maken en op automatisch contrast van ster tot ster. U kunt het contrast ook handmatig aanpassen met de schuifregelaar onder aan de afbeelding.Zodra biologisch interessante cellen met geschikte fluorescentie zijn gevonden, markeert u hun posities met behulp van de knop Markeerplaats in de mozaïekweergave. Ga door met het markeren van alle potentiële sites voordat u begint met het verwerven van afbeeldingen. Sla het mozaïek opnieuw op met de gemarkeerde sites door op Sites opslaan in bestand te klikken.Om de mozaïekafbeelding te naaien met behulp van de stitchEm-software, sleept u het tekstmozaïekbestand naar het stitchEm-bestand met de extensie BAT en slaat u de gecombineerde TIF-afbeelding van de mozaïektegels op in dezelfde map. Als u een afbeelding met de gemarkeerde sites wilt opslaan, sleept u het mozaïektekstbestand en het tekstbestand met de markeringen tegelijkertijd naar het pictogram. Stel de laserbelichtingstijd in op basis van het aantal en het dynamisch bereik in het fluorescentiebeeld onder aan het cameraweergavevenster.Kies welk filter u wilt toepassen en optimaliseer de instellingen voor elke golflengte van het te gebruiken excitatielicht, waarbij elke laser afzonderlijk wordt ingeschakeld. Klik op beide camera's om ze in te schakelen. Keer terug naar een van de gemarkeerde locaties en concentreer je opnieuw op de gewenste diepte.Eenmaal scherp in een interessegebied, ga je onscherp met de pijl-omhoogtoets in het XY-venster op de macrofase om de hoogte van de Z-stack te kiezen en klik je op Bovenaan opslaan. Ga onscherp met de pijl-omlaag, klik op Opslaan onder en vervolgens op Ga naar het midden en controleer of de afbeelding nog steeds scherp is. Selecteer in het cockpitvenster De optie Experiment met één locatie.Selecteer gestructureerde verlichting in de vervolgkeuzelijst. Wijzig de stapelhoogte zodat deze gelijk is aan de Z-hoogte plus één micrometer. Voer de belichtingstijden in milliseconden in voor de 405- en 488 nanometerlasers in de bovenste rij voor de gereflecteerde camera en de belichtingstijden voor de 561- en 647 nanometerlasers in de onderste rij voor de verzonden camera.Voer een bestandsnaam in en klik op bijwerken om een nieuw bestand met de datum en tijd te produceren zonder de vorige bestanden te overschrijven en klik vervolgens op Start. Als de vloeibare stikstof Dewar de cryo-fase tijdens de beeldacquisitie bijvult, moet u het proces afbreken door op de knop ABORT in de Cockpit-software te klikken. Verzamel op elke positie een Z-stack met zichtbaar licht door de lasers uit te schakelen en het omgevingslicht en de condensor in te schakelen.Selecteer onder Single-site experiment de optie Z-stack en stel het omgevingslicht in op 20 milliseconden belichting, waarbij de Z-hoogte behouden blijft. Herhaal dit proces voor alle gemarkeerde sites. Nadat de beeldvorming is voltooid, koppelt u het podium los en verwijdert u alle monsters.Schakel het lampje van de monsterkamer uit. Koppel de externe Dewar los en decanteer alle resterende vloeibare stikstof in een andere cryo-compatibele container, zodat de Dewar veilig kan terugkeren naar een normale temperatuur. Wacht tot de optie om het cryo-stage display uit te bakken beschikbaar komt nadat er geen vloeibare stikstof meer in het stadium Dewar is achtergestaan.Druk op de knop Uitbakken om de verwarmingsmodus te openen. Plaats de dekselplug op de cryo-trap. De resolutie in cryoSIM is aanzienlijk hoger dan die in standaard epifluorescentiemicroscopie.De fluorescentiekaart van een conventionele epifluorescentiemicroscoop kan worden gebruikt om gebieden te lokaliseren die van belang zijn voor beeldvorming en het bijbehorende cryoSIM-beeld kan worden verkregen vanaf een locatie op het raster. Een monster met U2OS-cellen werd gekleurd met een mengsel van groene microtubulicysteskeletkleurstof en rode mitochondriale kleurstof, wat resulteerde in de kleuring van de microtubulecomponent van het cytoskelet en de mitochondriën. Latere beeldvorming toonde de lokalisatie van mitochondriën in de cel, evenals de rangschikking van de microtubuli, waarbij het structurele kader dat ze aan de cel bieden en de assemblage van het cytoskelet rond organellen werd benadrukt.Het SIM-reconstructieproces kan artefacten produceren die kunnen worden geïdentificeerd met behulp van SIMCheck, een gratis imageJ-plug-in. Deze modulatiecontrastkaart gegenereerd met SIMCheck toont gebieden met een laag modulatiecontrast binnen het kerngebied, wat aangeeft dat dit gebied gevoeliger zal zijn voor reconstructieartefacten. De witte pijl duidt op een reconstructie-artefact.Wanneer u dit protocol probeert, moet u ervoor zorgen dat het monster te allen tijde ondergedompeld blijft of dicht bij vloeibare stikstof blijft om ontglazing te voorkomen. Let ook op belichtingstijden en tellingen in het dynamisch bereik, omdat dit de kwaliteit van de gegevens beïnvloedt en laserschade aan het monster voorkomt. Na cryo-beeldvorming kunnen dezelfde monsters worden afgebeeld met andere modaliteiten zoals cryozachte röntgentomografie, die we hier bij de B24 Beamline hebben.Door cryoSIM-beelden te combineren met beelden met structurele informatie over de cel, kunnen we belangrijke aanvullende vragen over cellulaire ultrastructuur en functie beantwoorden.

cryo-structured-illumination-microscopic-data-collection-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Illustreren we hier hoe u elektron cryotomography (ECT) te gebruiken om de ultrastructuur van bacteriële cellen in near-native staten studie, om "macromoleculaire" (~ 4 nm) resolutie.

Electron Cryotomography van bacteriële cellen

We beschrijven een correlatieve microscopie methode die high-speed 3D levende cellen fluorescerend licht microscopie en hoge-resolutie cryo-electron tomografie combineert. We demonstreren het vermogen van de correlatieve wijze dynamische beeldvorming, kleine HIV-1 deeltjes interactie met gastheer HeLa cellen.

Correlatieve microscopie voor 3D Structural Analysis van Dynamic Interactions

Dit artikel beschrijft de cryo-elektronenmicroscopie-methodologie, die wordt gebruikt om hoogwaardige microscopische beelden van macromoleculen in hun bijna-native toestand te verkrijgen. De methode levert beelden op die geschikt zijn voor verdere computerverwerking met behulp van de single particle-benadering, bedacht om de 3D-reconstructie van een macromolecuul te genereren.

Do&#39;s en Don&#39;ts van cryo-elektronenmicroscopie: A Primer op Monstervoorbereiding en hoge kwaliteit Data Collection voor Macromolecular 3D Wederopbouw

In dit manuscript presenteren we een hoogdoorvoerige, semi-geautomatiseerde cryohistologieplatform om gealignde composietbeelden te produceren van meerdere responsmaatregelen uit verschillende rondes van fluorescentiebeeldvorming op bevroren secties van gemineraliseerde weefsels.

High-throughput, Multi-Beeld Cryohistology gemineraliseerde weefsels

Hier presenteren we een protocol voor het combineren van twee monster verwerkingstechnieken, hogedruk bevriezing en magnetron-bijgewoonde monster verwerking, gevolgd door minimaal hars inbedding voor het verkrijgen van gegevens met een gerichte ion beam scannende elektronen microscoop (FIB-SEM). Dit is aangetoond door middel van een muis nervus monster en Caenorhabditis elegans.

Bereiding van de biologische monsters door hogedruk bevriezing, magnetron-bijgewoonde contrastverbetering, en minimale hars inbedding voor Volume Imaging

Hier is een protocol voor celkweek op siliciumnitride membranen en Plunge-bevriezing voorafgaand aan röntgenfluorescentie Imaging met een Synchrotron cryogene X-Ray nanoprobe. Wanneer alleen kamertemperatuur nano-analyse wordt verstrekt, kunnen de bevroren monsters verder gevriesdroogd worden. Dit zijn cruciale stappen om informatie te verkrijgen over de intracellulaire Elemental Composition.

Celkweek op siliciumnitride membranen en Cryopreparation voor Synchrotron X-Ray fluorescentie nano-analyse

Hier wordt een protocol gepresenteerd dat de monstervoorbereiding en gegevensverzamelingsstappen beschrijft die nodig zijn in cryo zachte röntgentomografie (SXT) om de ultrastructuur van hele cryo-geconserveerde cellen in beeld te brengen met een resolutie van 25 nm halve toonhoogte.

Een 3D cartografische beschrijving van de cel door Cryo Soft X-ray Tomography

Met behulp van gefocusseerde ionenbundelfrezen om glasvochtlamellen op het rooster te produceren uit bevroren biologische monsters voor cryo-elektronentomografie.

Lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie

Structuurbepaling van macromoleculaire complexen met behulp van cryoEM is routine geworden voor bepaalde klassen van eiwitten en complexen. Hier wordt deze pijplijn samengevat (monstervoorbereiding, screening, gegevensverzameling en -verwerking) en worden lezers gericht op verdere gedetailleerde bronnen en variabelen die kunnen worden gewijzigd in het geval van meer uitdagende exemplaren.

Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur

Dit manuscript schetst de blot-and-plunge-methode om biologische monsters handmatig te bevriezen voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje.

Handmatige Blot-and-Plunge Freezing van biologische monsters voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje

Dit protocol standaardiseert cryo-elektrontomografie (cryo-ET) voor dik weefsel door hogedrukbevriezing (HPF) te integreren met de wafelmethode, cryogene focus ion beam (cryo-FIB) lift-out en dosissymmetrische, parallelle acquisitie, waardoor uniform dunne lamellen en gevitrificeerde monsters worden opgeleverd voor reproduceerbare in situ-analyse in de hippocampus van de muis.

Cryo-elektrontomografie workflow voor dik weefsel aangetoond bij de muishippocampus

Leer cryoSIM voor superresolutiebeeldvorming van fluorescerend gelabelde celstructuren in U2OS-cellen. Deze methode combineert 3D-SIM met cryogene temperaturen voor behoud van native ultrastructuur.

Cryo-gestructureerde verlichting Microscopische gegevensverzameling van cryogene geconserveerde cellen

Meer video's verkennen