Efficiënte SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Speeksel diagnostische strategie met behulp van Open-Source Pipetteerrobots

We hebben een goedkope, op speeksel gebaseerde COVID 19-diagnostische test en workflow ontwikkeld die eenvoudig te implementeren en op te schalen is voor grootschalige community screening-toepassingen. Hier gebruiken we open source vloeistofbehandelingsrobots, standaard thermocyclers en software om direct speeksel te testen zonder extractie of stabilisatiebuffers, terwijl we nog steeds nauwkeurige diagnostische resultaten leveren. Vanwege de eenvoudige geautomatiseerde parallelle workflows kan het systeem worden opgeschaald om dagelijks duizenden tests uit te voeren met minimale apparatuur, ruimte en personeelsvereisten.

Naast Kylie King zullen Rachel Ham, onze klinische laboratoriumbegeleider en Austin Smothers, onze onderwijscoördinator, helpen om de procedure te demonstreren Begin met het ontsmetten van de buitenkant van de speekselopvangbuizen met 70% ethanol en breng ze over naar het laboratorium voor testen. Registreer de aankomst van het monster door elke voorbeeldwebcode in de spreadsheet voor dagelijkse inname te scannen. Behandel de scanmonsters gedurende 30 minuten in een oven van 95 graden Celsius en verwijder de monsters vervolgens met hittebestendige handschoenen.

Open de spreadsheets voor het dagelijks laden van monsters voor elke monsterbeladingsrobot op het monstertoewijzingsstation. Wijs vervolgens 188 monsters toe aan elke 384 putplaat. Etiketteer trays met plaatnaam, datum en kwartnummer.

Scan de monsters in volgorde in de spreadsheet voor het laden van monsters. Zet bij het monsterlaadstation twee volledige sets van acht 3D-geprinte rekken op een rij, die overeenkomen met de plaatsing van het dek in de robot. Maak kwart één buizen los en plaats ze in 3D-geprinte rekken, te beginnen met positie A1 in rek één.

Vul elk rek van links naar rechts en van boven naar beneden. Ga verder met dit laadpatroon in rek twee en ga dan verder met rekken vier en vijf. Plaats geladen kwart één monsterrekken op dekken één, twee, vier, vijf, zeven, acht, 10, 11.

Plaats P20 tips op decks drie en negen. Om het installatieproces te vereenvoudigen, laadt u materialen van achter naar voren in de robot. De master mixplaten worden geproduceerd op een speciale robot en opgeslagen bij vier graden Celsius.

Eén plaat wordt tegelijk gebruikt en is gelabeld met de naam van de plaat, en een scherp mes wordt gebruikt om een lijn in de folie rond de controleputten te snijden. Plaats de master mixplaat op dek zes en verwijder de folieafdekking, laat de kleine rechthoek achter die de controleputten bedekt. Maak de tipdozen bloot en sluit de robot.

Initialiseer het aangepaste Python-besturingsprotocol door te klikken op Start run through the robot desktop application. Elk kwartaal duurt 24,5 minuten om op het bord te laden. Stel een timer in als herinnering.

Terwijl de robot draait, ontdoe je en laad je kwart twee monsterbuizen in de tweede set 3D-geprinte rekken. Wanneer de robot pauzeert, verwijdert u de kwart één racks en vervangt u ze door de kwart twee racks en klikt u vervolgens op hervatten van uitvoeren in de desktoptoepassing. Vat monsterbuizen van kwart één samen en bewaar ze in een koelkast van vier graden Celsius in afwachting van de resultaten.

Herhaal dit laadproces voor kwart drie en vier. Breng de geladen plaat over naar een bioveiligheidskast. Om verontreiniging tot een minimum te beperken, houdt u de plaat bedekt tijdens de overdracht.

Verzamel eventuele herhalingsmonsters en wijs ze toe als de laatste monsters in kwartaal vier. Nummer de monsters, scan de streepjescodes en voer de oorspronkelijke monsterlocatie en het resultaat in de spreadsheet voor het laden van monsters in. Breng de herhalingsmonsters over naar de bioveiligheidskast.

Laad de herhaalde monsterbuizen niet in de robotlaadrekken. Pipetteer twee microliter van elk herhalingsmonster naar de juiste putjes. Gebruik de daarvoor bestemde pipet voor het toevoegen van patiëntmonsters.

Houd de controleputten bedekt met folie terwijl u monsters toevoegt om verontreiniging te minimaliseren. Verwijder de folieafdekking over controleputten met een tang. Pipetteer twee microliter bevestigde positieve patiëntmonsters in putjes M23 en M24.

Pipetteer twee microliter nucleasevrij water naar putten N23 tot N24 en twee microliter van 200 kopieën per microliter gemengde positieve controle naar Wells O23 tot O24. Laat putten P23 tot P24 leeg om de batchkwaliteit van de mastermix te bewaken. Bedek de plaat met een optisch heldere afdichting en gebruik de applicatorrol om alle putten afdichting te bevestigen.

Vortex de plaat bij 2, 500 RPM gedurende 30 seconden om grondig te mengen en centrifugeer de plaat vervolgens gedurende één minuut op 500 keer G. Selecteer het protocolprogramma in de thermocyclersoftware en sla het protocol op voor toekomstige platen. Plaats de verzegelde plaat in de thermocycler en voer het protocol uit.

Exporteer CT-waarden en kopieer de waarden naar de spreadsheet voor het laden van voorbeelden. Controleer voor positieve controle of ten minste één positieve controleput CT-waarden tussen 22 en 28 oplevert voor zowel P1- als N1-sondes. Als alternatief produceren de bekende positieve monsterputten P1- en N1 CT-waarden van minder dan 33 op de P1- en N1-sondes.

Controleer voor negatieve controle of er geen N1- of P1 CT-waarden zijn in een van de twee negatieve controleputten. Controleer of CT-waarden geldige versterkingscurven hebben voordat u de plaat ongeldig maakt. Als P1 een resultaat van CT van minder dan 33 oplevert, beschouw de put dan als geldig en ga verder met het resultaat van N1. Als P1 een resultaat van CT produceert dat groter is dan of gelijk is aan 33 of geen CT-waarde, beschouw de put dan als ongeldig.

Als N1 een resultaat van CT van minder dan 33 oplevert, beoordeel dan de put als ja. Als N1 geen CT-waarde oplevert, beoordeel dan de put als nee. Als N1 een CT-waarde produceert die groter is dan of gelijk is aan 33, beoordeel dan de put als geen ster.

Controleer of alle N1 CT-waarden zijn gekoppeld aan een echte versterkingscurve. Als een CT-waarde voor N1 geen versterkingscurve heeft, is de put nee. Identificeer de herhalingsmonsters, label ze met een intern monsternummer en monstertype en breng ze terug naar de laadworkflow.

De representatieve beelden tonen de RTQ PCR detectie van N1 of SARS CoV-2 synthetisch RNA en P1 of HSRPP30 synthetisch DNA. Standaardcurven werden uitgezet met standaardafwijkingen om het bereik van nauwkeurige detectie te bepalen met behulp van deze sondeprimercombinatie. De gemiddelde CT-waarden verkregen in de respectieve verdunningen werden uitgezet tegen de geschatte hoeveelheid synthetisch RNA en synthetisch DNA.

In beide gevallen vertoonden de lineaire curven goede correlatiecoëfficiënten over een breed scala aan genkopieconcentraties. N1 CT-waarden verkregen uit unieke monsters met behulp van zowel de robot als handmatige monsterbelasting werden getransponeerd om de inter assayvariabiliteit tussen de handmatige en robotbelading te bepalen. De lineaire relatie tussen de handmatige en geautomatiseerde methoden leverde een hoge correlatiecoëfficiënt op die aangeeft dat beide methoden functioneel gelijkwaardig zijn.

Intra-assayvariabiliteit werd ook bepaald met behulp van getransponeerde replicerende N1 CT-waarden verkregen uit zowel de robot als handmatige monsterbelasting. Evaluatie van warmtebehandelingsmethoden voor viscositeitsreductie in het speeksel wordt hier getoond. SARS CoV-2 negatief speeksel werd verzameld uit een enkele bron en aliquots werden warmtebehandeld gedurende nul minuten, 30 minuten of 60 minuten bij 95 graden Celsius.

P1 CT-waarden van technische replicaties van elke aandoening werden uitgezet om de variabiliteit tussen de behandelingsmethoden te bepalen. Zowel 30 minuten als 60 minuten warmtebehandelingsmethoden produceerden een significant verminderde monstervariabiliteit in vergelijking met geen behandelingscontrole. Er was geen significant verschil tussen behandelingen van 30 minuten en 60 minuten.

Daarom werd de 30 minuten warmtebehandelingsmethode geïmplementeerd om de verwerkingstijd te verkorten. Gebruik de juiste aseptische techniek om verontreiniging van de testplaten te minimaliseren, met name bij het laden van handmatige monsters en controles. Vermijd het kruisen van de plaat met je handen of mouwen.

Nadat klinische resultaten zijn geproduceerd, kunnen monsters worden verwijderd in biohazard afval of kunnen ze worden opgeslagen voor verdere analyse, zoals whole genome sequencing om specifieke stammen te bepalen. Deze techniek maakt grootschalige gemeenschapstests mogelijk, waardoor we de effecten van testdekking en de niet-symptomatische verspreiding van Covid 19 kunnen onderzoeken.