Een in vitro benadering om mitochondriale disfunctie te bestuderen: een cybridemodel
9 maart 2022
Transmitocrodiale cybriden zijn hybride cellen die worden verkregen door mitochondriaal DNA (mtDNA)-uitgeputte cellen (rho0-cellen ) te fuseren met cytoplasten (enucleated cells) afgeleid van patiënten die zijn getroffen door mitochondriale aandoeningen. Ze maken het mogelijk om de nucleaire of mitochondriale oorsprong van de ziekte te bepalen, biochemische activiteit te evalueren en de pathogenetische rol van mtDNA-gerelateerde varianten te bevestigen.
Cybergeneratie is nog steeds het state-of-the-art protocol om de pathogene rol van elke nieuwe mitochondriale DNA-mutatie te begrijpen en het percentage atriplasmie te correleren met de ernst van de ziekte. Deze techniek maakt het mogelijk biochemisch onderzoek uit te voeren in een homogeen nucleair systeem, waarbij de bijdrage van de nucleaire achtergrond van de patiënt afwezig is. Deze techniek maakt het mogelijk om de pathogeniciteit van een mutatie van het mitochondriale DNA te valideren.
en maakt het mogelijk om de impact ervan op biochemisch niveau te bestuderen Was de 35 millimeter schotels met de fibroblasten tweemaal met behulp van twee milliliter 1X PBS zonder calcium en magnesium. Reinig het buitenoppervlak van de vaat met 70% ethanol en wacht tot de alcohol verdampt. Verwijder de deksels van de vaat en de schroefdoppen van de flessen.
Plaats elke schaal zonder deksel ondersteboven op de bodem van elke centrifugefles van 250 milliliter. Voeg langzaam 32 milliliter van een nucleatiemedium toe aan elke fles, zodat het medium de schaal kan binnendringen en in contact kan komen met de cellen. Verwijder eventuele bubbels uit de gerechten met een lange glazen weidepipet en buig de punt in een bunsenvlam.
Sluit elke fles met de schroefdop en breng ze over naar de centrifuge. Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius en 8.000 x G.Zuig het medium uit de flessen en gooi het weg. Verwijder de gerechten door de flessen om te keren op een steriel gaasje dat eerder met 70% ethanol is besproeid.
Reinig het buitenoppervlak van de vaat en hun deksels met 70% ethanol en sluit de vaat nadat de ethanol is verdampt. Controleer voordat u verder gaat op cytoplastvorming met behulp van een omgekeerde microscoop voor levende cellen. Zoek naar extreem langwerpige fibroblasten als gevolg van de extrusie van hun kernen geïnduceerd door cytochalasine.
Voeg aan elke schotel van 35 millimeter 1.000. 143 rij nulcellen toe. Opnieuw gesuspendeerd in twee milliliter kweekmedium aangevuld met 5%FBS. Laat de gerechten drie uur in een bevochtigde kooldioxide-incubator om de 143 rijen nulcellen op de geesten te laten bezinken.
Na drie uur incubatie, aspirateer en gooi het medium weg. Was de hechtingscellen tweemaal met twee milliliter DMEM-medium met hoge glucose zonder serum of MEM, aspiraleer vervolgens en gooi het medium weg. Voeg 500 microliter polyethyleenglycoloplossing toe aan de cellen en incubeer gedurende precies één minuut.
Aspirateer en gooi de polyethyleenglycoloplossing weg. Was de cellen driemaal met twee milliliter DMEM hoge glucose zonder serum of met MEM. Voeg twee milliliter fusiemedium toe en incubeer een nacht in de incubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.
Trypsinize de cellen in de resterende kweekschalen Tel ze en zaai ze in een of meer petrischalen Voeg 50 tot 100 cellen per schaal toe in de aangevulde cultuur totdat er klonen verschijnen. Laat ze dan enkele dagen groeien. Pak met een stereomicroscoop de klonen uit de petrischaal met klooncilinders of een pipetpunt.
Probeer te voorkomen dat verschillende klonen worden samengevoegd en breng ze over naar een plaat van 96 putten, elk met 200 microliter aangevuld kweekmedium. Cybriden werden gegenereerd vanaf fibroblasten afgeleid van een patiënt die de heteroplasmatische M2343A2G droeg Een van de meest voorkomende mitochondriale DNA-mutaties geassocieerd met mitochondriale myopathie, encefalopathie lactaatacidose en beroerte-achtige episodes. Analyse van een variabel aantal tandemherhalingen toonde aan dat cyber-DNA identiek is aan de rij nulcellen die de vervanging van het cyber-DNA van de patiënt door het 143 B-genoom bevestigen.
Restrictiefragmentlengte polymorfisme, of sequencinganalyses, kunnen worden gebruikt om de aanwezigheid van de mitochondriale DNA-mutatie en het heteroplasmiepercentage te beoordelen. Bij het proberen van dit protocol is het belangrijk om de juiste genetische troef van het nucleon en mitochondriaal DNA te verifiëren, evenals de mitochondriale DNA-hoeveelheid in de herbevolkte cybriden.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Transmitochondriale cybriden zijn hybride cellen die worden gecreëerd door cellen die ontdaan zijn van mtDNA te fuseren met cytoplasten van patiënten met mitochondriële aandoeningen. Deze benadering helpt bij het bepalen van de oorsprong van ziekten en het evalueren van biochemische activiteiten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Mitochondriële genetica
Achtergrond
- Transmitochondriale cybriden zijn essentieel voor het bestuderen van mitochondriële aandoeningen.
- Ze maken de analyse van nucleaire en mitochondriële bijdragen aan ziekten mogelijk.
- Deze techniek is cruciaal voor het valideren van de pathogeniciteit van mtDNA-mutaties.
- Het begrijpen van de biochemische impact van mutaties is van vitaal belang voor het management van de ziekte.
Doel van de studie
- Om de pathogene rol van nieuwe mitochondriële DNA-mutaties te onderzoeken.
- Om het percentage heteroplasmie te correleren met de ernst van de ziekte.
- Om biochemische onderzoeken uit te voeren in een gecontroleerde nucleaire omgeving.
Gebruikte methoden
- Fusie van rho 0-cellen met geënucleerde cytoplasten.
- Biochemische assays om de mitochondriële functie te evalueren.
- Validatie van mtDNA-mutaties via cybride-analyse.
- Gebruik van PBS en ethanol voor celpreparatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle creatie van transmitochondriale cybriden.
- Identificatie van biochemische activiteiten gekoppeld aan mtDNA-mutaties.
- Vastgestelde correlatie tussen heteroplasmie-niveaus en ziekteuitkomsten.
- Bevestiging van de pathogene rol van specifieke mtDNA-varianten.
Conclusies
- Transmitochondriale cybriden zijn effectief voor het bestuderen van mitochondriële ziekten.
- Deze methode vergroot het begrip van mtDNA-mutaties en hun effecten.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om gerichte therapieën te ontwikkelen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Transmitochondriale cybrid-modellen maken een nauwkeurige analyse mogelijk van de mitochondriale versus nucleaire genetische bijdragen aan OXPHOS-dysfunctie, een kritiek omslagpunt in het onderzoek naar mitochondriale ziekten. Deze benadering biedt mechanische risicoreductie en target-validatie voor mutaties in het mitochondriale DNA, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid in vroege discovery-fasen en translationeel onderzoek. Het vermogen van het cybrid-systeem om pathogeniciteit te isoleren en te karakteriseren vormt de basis voor risico-gecorrigeerde portfoliobeslissingen voor programma's gericht op mitochondriale aandoeningen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe analyse van de pathogeniciteit van mitochondriale DNA-mutaties mogelijk in een gecontroleerde nucleaire achtergrond.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door onderscheid te maken tussen OXPHOS-defecten aangestuurd door mtDNA en die aangestuurd door nDNA.
- Faciliteert mechanische risicoreductie voor nieuwe mitochondriale varianten voorafgaand aan verdere investeringen.
- Biedt een platform voor het correleren van heteroplasmieniveaus met ziekte-relevante fenotypen.
Screening & assay-ontwikkeling
- Stelt gevalideerde cybride lijnen vast voor reproduceerbare biochemische en genetische assays.
- Maakt kwantitatieve meting van de OXPHOS-activiteit en de impact van mutaties mogelijk.
- Ondersteunt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid tussen laboratoria voor mitochondriaal onderzoek.
- Bereidt robuuste cellulaire systemen voor voor compound screening gericht op mitochondriale dysfunctie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt ziekterelevante cybrid-modellen uit met de ontwikkeling van translationele biomarkers.
- Zorgt voor continuïteit van genetische ontdekking tot preklinische validatie van mitochondriale targets.
- Maakt risico-gecorrigeerde voortgang van kandidaat-interventies mogelijk op basis van mechanistisch bewijs.
- Ondersteunt predictieve risicoreductie voor portfolio's van mitochondriale ziekten.
Integratie van pipeline & workflow
Het cybrid-model integreert in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door hypothesetesten, targetvalidatie en mechanistische verduidelijking voor mitochondriële aandoeningen mogelijk te maken.
- Discovery Biology: Ondersteunt nulhypothese-toetsing voor de pathogeniteit van mtDNA-mutaties en verduidelijkt genetische drijfveren van OXPHOS-dysfunctie.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare cybrid-lijnen voor kwantitatieve biochemische assays.
- Analytics: Levert kwantitatieve read-outs van heteroplasmie en OXPHOS-activiteit voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen genetische bevindingen en preklinische modelvalidatie en biomarker-afstemming.
- Enterprise hergebruik: Biedt een herbruikbaar platform voor continue ontdekking van mitochondriale targets en biomarkers.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in onderzoek naar mitochondriale ziekten.
- Operationele waarde: Standaardiseert de generatie en karakterisering van cybriden voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go beslissingen en kapitaalefficiënt portfoliomanagement mogelijk.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de voortgang van programma's voor mitochondriale aandoeningen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in cel fusible, mitochondriale genetica en de ontwikkeling van biochemische assays.
- Vereist toegang tot gespecialiseerde infrastructuur voor celkweek, centrifugatie en moleculaire analyse.
- Noodzaakt tot strikte standaardisatie tussen teams van protocollen voor de generatie en validatie van cybriden.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende celtypen of ziekterelevante genetische achtergronden.
- Verificatie van nucleaire en mitochondriale genetische eigenschappen is essentieel voor de getrouwheid van het model.
