Een in vitro benadering om mitochondriale disfunctie te bestuderen: een cybridemodel

Cybergeneratie is nog steeds het state-of-the-art protocol om de pathogene rol van elke nieuwe mitochondriale DNA-mutatie te begrijpen en het percentage atriplasmie te correleren met de ernst van de ziekte. Deze techniek maakt het mogelijk biochemisch onderzoek uit te voeren in een homogeen nucleair systeem, waarbij de bijdrage van de nucleaire achtergrond van de patiënt afwezig is. Deze techniek maakt het mogelijk om de pathogeniciteit van een mutatie van het mitochondriale DNA te valideren.

en maakt het mogelijk om de impact ervan op biochemisch niveau te bestuderen Was de 35 millimeter schotels met de fibroblasten tweemaal met behulp van twee milliliter 1X PBS zonder calcium en magnesium. Reinig het buitenoppervlak van de vaat met 70% ethanol en wacht tot de alcohol verdampt. Verwijder de deksels van de vaat en de schroefdoppen van de flessen.

Plaats elke schaal zonder deksel ondersteboven op de bodem van elke centrifugefles van 250 milliliter. Voeg langzaam 32 milliliter van een nucleatiemedium toe aan elke fles, zodat het medium de schaal kan binnendringen en in contact kan komen met de cellen. Verwijder eventuele bubbels uit de gerechten met een lange glazen weidepipet en buig de punt in een bunsenvlam.

Sluit elke fles met de schroefdop en breng ze over naar de centrifuge. Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius en 8.000 x G.Zuig het medium uit de flessen en gooi het weg. Verwijder de gerechten door de flessen om te keren op een steriel gaasje dat eerder met 70% ethanol is besproeid.

Reinig het buitenoppervlak van de vaat en hun deksels met 70% ethanol en sluit de vaat nadat de ethanol is verdampt. Controleer voordat u verder gaat op cytoplastvorming met behulp van een omgekeerde microscoop voor levende cellen. Zoek naar extreem langwerpige fibroblasten als gevolg van de extrusie van hun kernen geïnduceerd door cytochalasine.

Voeg aan elke schotel van 35 millimeter 1.000. 143 rij nulcellen toe. Opnieuw gesuspendeerd in twee milliliter kweekmedium aangevuld met 5%FBS. Laat de gerechten drie uur in een bevochtigde kooldioxide-incubator om de 143 rijen nulcellen op de geesten te laten bezinken.

Na drie uur incubatie, aspirateer en gooi het medium weg. Was de hechtingscellen tweemaal met twee milliliter DMEM-medium met hoge glucose zonder serum of MEM, aspiraleer vervolgens en gooi het medium weg. Voeg 500 microliter polyethyleenglycoloplossing toe aan de cellen en incubeer gedurende precies één minuut.

Aspirateer en gooi de polyethyleenglycoloplossing weg. Was de cellen driemaal met twee milliliter DMEM hoge glucose zonder serum of met MEM. Voeg twee milliliter fusiemedium toe en incubeer een nacht in de incubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.

Trypsinize de cellen in de resterende kweekschalen Tel ze en zaai ze in een of meer petrischalen Voeg 50 tot 100 cellen per schaal toe in de aangevulde cultuur totdat er klonen verschijnen. Laat ze dan enkele dagen groeien. Pak met een stereomicroscoop de klonen uit de petrischaal met klooncilinders of een pipetpunt.

Probeer te voorkomen dat verschillende klonen worden samengevoegd en breng ze over naar een plaat van 96 putten, elk met 200 microliter aangevuld kweekmedium. Cybriden werden gegenereerd vanaf fibroblasten afgeleid van een patiënt die de heteroplasmatische M2343A2G droeg Een van de meest voorkomende mitochondriale DNA-mutaties geassocieerd met mitochondriale myopathie, encefalopathie lactaatacidose en beroerte-achtige episodes. Analyse van een variabel aantal tandemherhalingen toonde aan dat cyber-DNA identiek is aan de rij nulcellen die de vervanging van het cyber-DNA van de patiënt door het 143 B-genoom bevestigen.

Restrictiefragmentlengte polymorfisme, of sequencinganalyses, kunnen worden gebruikt om de aanwezigheid van de mitochondriale DNA-mutatie en het heteroplasmiepercentage te beoordelen. Bij het proberen van dit protocol is het belangrijk om de juiste genetische troef van het nucleon en mitochondriaal DNA te verifiëren, evenals de mitochondriale DNA-hoeveelheid in de herbevolkte cybriden.