Een geoptimaliseerde single-molecule pull-down test voor kwantificering van eiwitfosforylering
6 juni 2022
Het huidige protocol beschrijft monstervoorbereiding en gegevensanalyse om eiwitfosforylering te kwantificeren met behulp van een verbeterde single-molecule pull-down (SiMPull) assay.
Dit SiMPull-protocol maakt een kwantificering van eiwitfosforylering mogelijk door de etiketterings- en fixatieomstandigheden van antilichamen te verbeteren, autofluorescentie in het groene kanaal te verminderen en robuuste analysealgoritmen voor één molecuul te bieden. Het belangrijkste voordeel van SiMPull is dat het ons in staat stelt om de fosforyleringsstatus van individuele intacte eiwitten te ondervragen. Met deze methode kunnen we nieuwe informatie verkrijgen die niet toegankelijk is via traditionele technieken, zoals western blotting en massaspecificatieanalyse.
We hebben een team van onderzoekers om het protocol te demonstreren. Eerst zal Julian Rojo laten zien hoe je piranha het coverglas kunt etsen. Rachel Grattan zal dan de stappen voor het coaten van het afdekglas laten zien.
En Elizabeth Bailey zal laten zien hoe je de array- en afbeeldingsmonsters kunt tekenen. Om te beginnen ets piranha de hoes door het reactiebekerstuk elke vijf minuten gedurende 30 minuten voorzichtig te roeren. Neutraliseerde de piranha-oplossing door geleidelijk een zwakke basis toe te voegen.
Breng met een glazen staaf de geëtste deksels over in een Buchner-trechter en spoel gedurende vijf minuten in dubbel gedestilleerd water. Plaats vervolgens de dekselslips in een glazen Coplin-pot en dek af met methanol. Sluit het deksel af met een afdichtingsfilm en bad soniceer gedurende 10 minuten.
Na ultrasoonapparaat leegt u de methanol in een glazen opslagfles. Herhaal deze stap met aceton. Spoel de deksels driemaal af met dubbel gedestilleerd water in de Coplin pot.
Giet het water van de afdekglijders af en droog ze door door de vlam van een Bunsenbrander te zwaaien. Plaats de dekselslips in een droge Coplin-pot. Voeg vervolgens amino-silaanoplossing toe aan de Coplin-pot om afdekslip-aminosilanisatie uit te voeren.
Dek af en breng een afdichtingsfolie aan ter bescherming tegen licht. Spoel de afdeksel met methanol en gooi de gebruikte oplossing weg. Spoel de hoes nogmaals driemaal af met dubbel gedestilleerd water gedurende elk twee minuten.
Dep overtollig vocht weg en droog volledig aan de lucht gedurende 10 minuten. Teken vervolgens een rasterarray met een hydrofobe barrièrepen. Markeer een id op de afdekplaat om de juiste oriëntatie te identificeren.
Nadat de inkt is opgedroogd, plaatst u de afdekselglijders in een bevochtigde kamer. Resuspend 153 milligram mPEG en 3,9 milligram biotine-PEG in 609 microliter 10 millimolair natriumbicarbonaat en vortex. Centrifugeer bij 10.000 x g vanaf één minuut bij kamertemperatuur om bellen te verwijderen.
Breng 10 tot 15 microliter van deze oplossing per vierkant aan om de array volledig te bedekken zonder over te lopen. Bewaar de hoes in de vochtige kamer in het donker gedurende drie tot vier uur bij kamertemperatuur. Was vervolgens de dekselslips door ze 10 seconden achter elkaar in drie bekers gevuld met dubbel gedestilleerd water te dopen.
Verwijder al het vocht uit de afdekslips met behulp van stikstofgas. Bewaar de afdekselglijders rug aan rug in een conische buis van 50 milliliter gevuld met stikstof en sluit af met een afdichtingsfilm. Wikkel de buis in met afdichtingsfolie en plaats deze op min 20 graden Celsius.
Verwijder de biotine-PEG gefunctionaliseerde arrays uit de vriezer en breng ze in evenwicht tot kamertemperatuur. Plaats de afdeksel met de array naar boven gericht over een weefselkweekschaal van 100 millimeter bekleed met afdichtingsfolie. Incubeer elk vierkant van de array met 10 milligram per milliliter natriumboorhydride in PBS gedurende vier minuten bij kamertemperatuur.
Driemaal wassen met PBS. Vervolgens incuberen met 0,2 milligram per milliliter NeutrAvidin in T50 gedurende vijf minuten, gevolgd door driemaal wassen met T50 BSA. Herhaal de incubatie met twee microgram per milliliter gebiotinyleerd POI-specifiek antilichaam in T50 BSA gedurende 10 minuten gevolgd door wassen.
Ontdooi eerst het lysaat door te pipetteren. Verdun één microliter van het lysaat tot 100 microliter ijskoude T50 BSA PPI. Incubeer het lysaat op de array gedurende 10 minuten, gevolgd door wassen.
Bereid AF647 geconjugeerd antifosfotyrosine-antilichaam in ijskoude T50 BSA PPI en incubeer gedurende één uur op de array. Deponeer een druppel olie op het doel. Plaats het nanogrid op het podium voor beeldvorming.
Gebruik doorgelaten wit licht om scherp te stellen op het rasterpatroon. Verkrijg een reeks van 20 afbeeldingen van het raster, zorg ervoor dat pixels niet verzadigd zijn en sla de afbeeldingsreeks op als fiduciaal. Defocus van het nanogrid om een luchtig patroon te creëren, verkrijg een reeks van 20 afbeeldingen voor versterkingskalibraties en sla het beeld op als versterking.
Verkrijg vervolgens een reeks van 20 afbeeldingen voor camera-offset door al het licht naar de camera te blokkeren en de achtergrond van de afbeelding op te slaan. Om eenvoudige afbeeldingen te verkrijgen, reinigt u eerst het olieobjectief en deponeert u extra olie op het doel. Bevestig de cover slip array op de microscooptrap.
Verkrijg beelden voor elk monster, eerst in het verrode kanaal, gevolgd door fluoroforen met een lagere golflengte. Controleer het bufferniveau elke 30 tot 45 minuten en vul het indien nodig aan. Met behulp van deze techniek werd EGFR-GFP gevangen uit totale eiwitlysaten.
De autofluorescentie van de hydrofobe inkt werd gebruikt als leidraad voor het vinden van het brandpuntsvlak van het monster. Raw-gegevensafbeeldingen werden verkregen met spectrale kanalen gescheiden op de camerachip. Een overlay van de groene en verrode kanalen werd verder onderzocht voor data-acquisitie.
Kanaalregistratie werd uitgevoerd op beelden die zijn verkregen van het nanogrid. Een overlay van fiduciale afbeeldingen toonde onvolledige registratie. Uitlijning werd gedaan door een lokaal gewogen gemiddelde transformatie toe te passen op de verrode en groene kanaalcoördinaten, die werd gebruikt om de daaropvolgende SiMPull-gegevens te registreren.
Enkele emitters boven het aantal achtergrondfotonen van de GFP- en AF647-kanalen werden ingepakt en Gaussische lokalisatie werd uitgevoerd om de locaties te identificeren. Colocalisatie van EGFR-GFP in een F647 werd gedaan om gefosforyleerde receptoren te identificeren. En het percentage colocalisatie werd gebruikt om de fractie van gefosforyleerde receptoren te bepalen.
Achtergronddetecties werden verminderd wanneer piranha geëtst glas werd behandeld met natriumboorhydride. Robuuste binding van EGFR-GFP in het lysaat werd waargenomen met minimale niet-specifieke PY99-AF647-binding, wat retentie van oppervlaktefunctionalisatie met behulp van deze techniek aantoont. SiMPull geeft informatie over eiwitfosforylering en kan een breed scala aan zelfsignaleringsvragen beantwoorden.
Dit kan ons begrip van signalering in zowel normale als ziektetoestanden verbeteren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit SiMPull-protocol maakt kwantificering van eiwitfosforylering mogelijk door de antilichaamlabeling en fixatiecondities te verbeteren. Het vermindert autofluorescentie in het groene kanaal en biedt robuuste algoritmen voor enkel-molecuulanalyse.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Eiwitanalyse
Achtergrond
- Eiwitfosforylering is een kritische post-translationele modificatie.
- Traditionele technieken zoals western blotting en massaspectrometrie hebben beperkingen.
- Enkel-molecuulanalyse biedt nieuwe inzichten in eiwitgedrag.
- Dit protocol heeft tot doel de nauwkeurigheid van fosforylatiekwantificering te verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om eiwitfosforylering op het niveau van een enkel molecuul te kwantificeren.
- Om de betrouwbaarheid van antilichaamlabeling en fixatie te verbeteren.
- Om een methode te bieden die traditionele analytische technieken overtreft.
Gebruikte methoden
- Enkel-molecuul pull-down (SiMPull) assay.
- Verbeterde antilichaamlabelingtechnieken.
- Geoptimaliseerde fixatiecondities om autofluorescentie te verminderen.
- Robuuste algoritmen voor enkel-molecuulanalyse.
Belangrijkste resultaten
- Verbeterde kwantificering van eiwitfosforylering.
- Succesvolle vermindering van autofluorescentie in het groene kanaal.
- Demonstratie van het protocol door een team van onderzoekers.
- Mogelijkheid om de fosforylatiestatus van individuele eiwitten te onderzoeken.
Conclusies
- Het SiMPull-protocol biedt een significante vooruitgang in eiwitanalyse.
- Het maakt gedetailleerde inzichten in fosforylatie mogelijk die voorheen ontoegankelijk waren.
- Deze methode zou traditionele technieken in specifieke toepassingen kunnen vervangen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantifying protein phosphorylation at the single-molecule level addresses a critical gap in understanding signaling heterogeneity and mechanistic pathway activation in drug discovery. The optimized SiMPull assay enables robust, quantitative assessment of receptor phosphorylation, supporting predictive confidence in target validation and early discovery decisions. This capability enhances portfolio triage by providing high-resolution data on posttranslational modifications relevant to disease biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of phosphorylation status for individual membrane receptors, clarifying pathway activation.
- Supports biological de-risking by revealing heterogeneity in posttranslational modification across protein populations.
- Improves predictive confidence for target engagement and functional validation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, quantitative single-molecule readouts for downstream screening workflows.
- Standardizes assay conditions through optimized antibody labeling and fixation protocols.
- Facilitates reproducible, scalable quantification of phosphorylation for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phosphorylation measurements with disease-relevant signaling pathways for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic de-risking.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative modification data.
Pipeline & Workflow Integration
The SiMPull assay integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical research, providing a reusable platform for quantitative posttranslational analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying phosphorylation at the single-molecule level.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay readiness and compound screening.
- Analytics: Provides robust statistical measurements of phosphorylation fractions across thousands of receptors.
- Translational Research: Enables alignment of signaling data with disease models for biomarker continuity.
- Enterprise Reuse: Offers a generalizable protocol adaptable to diverse membrane receptors and signaling proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of phosphorylation assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-resolution modification data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule imaging and quantitative data analysis.
- Demands specialized instrumentation for fluorescence imaging and robust computational infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of antibody labeling and fixation protocols.
- Adaptable to various model systems with protocol optimization for different protein targets.
- Practical limitations include the need for high-quality reagents and careful control of autofluorescence.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:53
Coverslip Preparation
3:18
Functionalization of Array with Biotinylated Antibody
4:09
SiMPull of Proteins of Interest from Whole-Cell Lysates
4:40
Image Acquisition
5:45
Results: Capture of EGFR-GFP from Protein Lysates Using SiMPull
7:19
Conclusion
