Een geoptimaliseerde single-molecule pull-down test voor kwantificering van eiwitfosforylering

Dit SiMPull-protocol maakt een kwantificering van eiwitfosforylering mogelijk door de etiketterings- en fixatieomstandigheden van antilichamen te verbeteren, autofluorescentie in het groene kanaal te verminderen en robuuste analysealgoritmen voor één molecuul te bieden. Het belangrijkste voordeel van SiMPull is dat het ons in staat stelt om de fosforyleringsstatus van individuele intacte eiwitten te ondervragen. Met deze methode kunnen we nieuwe informatie verkrijgen die niet toegankelijk is via traditionele technieken, zoals western blotting en massaspecificatieanalyse.

We hebben een team van onderzoekers om het protocol te demonstreren. Eerst zal Julian Rojo laten zien hoe je piranha het coverglas kunt etsen. Rachel Grattan zal dan de stappen voor het coaten van het afdekglas laten zien.

En Elizabeth Bailey zal laten zien hoe je de array- en afbeeldingsmonsters kunt tekenen. Om te beginnen ets piranha de hoes door het reactiebekerstuk elke vijf minuten gedurende 30 minuten voorzichtig te roeren. Neutraliseerde de piranha-oplossing door geleidelijk een zwakke basis toe te voegen.

Breng met een glazen staaf de geëtste deksels over in een Buchner-trechter en spoel gedurende vijf minuten in dubbel gedestilleerd water. Plaats vervolgens de dekselslips in een glazen Coplin-pot en dek af met methanol. Sluit het deksel af met een afdichtingsfilm en bad soniceer gedurende 10 minuten.

Na ultrasoonapparaat leegt u de methanol in een glazen opslagfles. Herhaal deze stap met aceton. Spoel de deksels driemaal af met dubbel gedestilleerd water in de Coplin pot.

Giet het water van de afdekglijders af en droog ze door door de vlam van een Bunsenbrander te zwaaien. Plaats de dekselslips in een droge Coplin-pot. Voeg vervolgens amino-silaanoplossing toe aan de Coplin-pot om afdekslip-aminosilanisatie uit te voeren.

Dek af en breng een afdichtingsfolie aan ter bescherming tegen licht. Spoel de afdeksel met methanol en gooi de gebruikte oplossing weg. Spoel de hoes nogmaals driemaal af met dubbel gedestilleerd water gedurende elk twee minuten.

Dep overtollig vocht weg en droog volledig aan de lucht gedurende 10 minuten. Teken vervolgens een rasterarray met een hydrofobe barrièrepen. Markeer een id op de afdekplaat om de juiste oriëntatie te identificeren.

Nadat de inkt is opgedroogd, plaatst u de afdekselglijders in een bevochtigde kamer. Resuspend 153 milligram mPEG en 3,9 milligram biotine-PEG in 609 microliter 10 millimolair natriumbicarbonaat en vortex. Centrifugeer bij 10.000 x g vanaf één minuut bij kamertemperatuur om bellen te verwijderen.

Breng 10 tot 15 microliter van deze oplossing per vierkant aan om de array volledig te bedekken zonder over te lopen. Bewaar de hoes in de vochtige kamer in het donker gedurende drie tot vier uur bij kamertemperatuur. Was vervolgens de dekselslips door ze 10 seconden achter elkaar in drie bekers gevuld met dubbel gedestilleerd water te dopen.

Verwijder al het vocht uit de afdekslips met behulp van stikstofgas. Bewaar de afdekselglijders rug aan rug in een conische buis van 50 milliliter gevuld met stikstof en sluit af met een afdichtingsfilm. Wikkel de buis in met afdichtingsfolie en plaats deze op min 20 graden Celsius.

Verwijder de biotine-PEG gefunctionaliseerde arrays uit de vriezer en breng ze in evenwicht tot kamertemperatuur. Plaats de afdeksel met de array naar boven gericht over een weefselkweekschaal van 100 millimeter bekleed met afdichtingsfolie. Incubeer elk vierkant van de array met 10 milligram per milliliter natriumboorhydride in PBS gedurende vier minuten bij kamertemperatuur.

Driemaal wassen met PBS. Vervolgens incuberen met 0,2 milligram per milliliter NeutrAvidin in T50 gedurende vijf minuten, gevolgd door driemaal wassen met T50 BSA. Herhaal de incubatie met twee microgram per milliliter gebiotinyleerd POI-specifiek antilichaam in T50 BSA gedurende 10 minuten gevolgd door wassen.

Ontdooi eerst het lysaat door te pipetteren. Verdun één microliter van het lysaat tot 100 microliter ijskoude T50 BSA PPI. Incubeer het lysaat op de array gedurende 10 minuten, gevolgd door wassen.

Bereid AF647 geconjugeerd antifosfotyrosine-antilichaam in ijskoude T50 BSA PPI en incubeer gedurende één uur op de array. Deponeer een druppel olie op het doel. Plaats het nanogrid op het podium voor beeldvorming.

Gebruik doorgelaten wit licht om scherp te stellen op het rasterpatroon. Verkrijg een reeks van 20 afbeeldingen van het raster, zorg ervoor dat pixels niet verzadigd zijn en sla de afbeeldingsreeks op als fiduciaal. Defocus van het nanogrid om een luchtig patroon te creëren, verkrijg een reeks van 20 afbeeldingen voor versterkingskalibraties en sla het beeld op als versterking.

Verkrijg vervolgens een reeks van 20 afbeeldingen voor camera-offset door al het licht naar de camera te blokkeren en de achtergrond van de afbeelding op te slaan. Om eenvoudige afbeeldingen te verkrijgen, reinigt u eerst het olieobjectief en deponeert u extra olie op het doel. Bevestig de cover slip array op de microscooptrap.

Verkrijg beelden voor elk monster, eerst in het verrode kanaal, gevolgd door fluoroforen met een lagere golflengte. Controleer het bufferniveau elke 30 tot 45 minuten en vul het indien nodig aan. Met behulp van deze techniek werd EGFR-GFP gevangen uit totale eiwitlysaten.

De autofluorescentie van de hydrofobe inkt werd gebruikt als leidraad voor het vinden van het brandpuntsvlak van het monster. Raw-gegevensafbeeldingen werden verkregen met spectrale kanalen gescheiden op de camerachip. Een overlay van de groene en verrode kanalen werd verder onderzocht voor data-acquisitie.

Kanaalregistratie werd uitgevoerd op beelden die zijn verkregen van het nanogrid. Een overlay van fiduciale afbeeldingen toonde onvolledige registratie. Uitlijning werd gedaan door een lokaal gewogen gemiddelde transformatie toe te passen op de verrode en groene kanaalcoördinaten, die werd gebruikt om de daaropvolgende SiMPull-gegevens te registreren.

Enkele emitters boven het aantal achtergrondfotonen van de GFP- en AF647-kanalen werden ingepakt en Gaussische lokalisatie werd uitgevoerd om de locaties te identificeren. Colocalisatie van EGFR-GFP in een F647 werd gedaan om gefosforyleerde receptoren te identificeren. En het percentage colocalisatie werd gebruikt om de fractie van gefosforyleerde receptoren te bepalen.

Achtergronddetecties werden verminderd wanneer piranha geëtst glas werd behandeld met natriumboorhydride. Robuuste binding van EGFR-GFP in het lysaat werd waargenomen met minimale niet-specifieke PY99-AF647-binding, wat retentie van oppervlaktefunctionalisatie met behulp van deze techniek aantoont. SiMPull geeft informatie over eiwitfosforylering en kan een breed scala aan zelfsignaleringsvragen beantwoorden.

Dit kan ons begrip van signalering in zowel normale als ziektetoestanden verbeteren.