Name: Een geoptimaliseerde single-molecule pull-down test voor kwantificering van eiwitfosforylering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Ontdek de SiMPull-methode voor kwantificering van eiwitfosforylering met geoptimaliseerde antilichaamlabeling en fixatie. Deze techniek reduceert autofluorescentie en biedt robuuste algoritmen voor enkelmolecuulanalyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health R35GM126934, R01AI153617 en R01CA248166 to DSL. EMB werd ondersteund door het ASERT-IRACDA-programma (NIH K12GM088021) en JAR door het UNM MARC-programma (NIH 2T34GM008751-20). We erkennen dankbaar het gebruik van de gedeelde bron van fluorescentiemicroscopie van het University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, ondersteund door NIH P30CA118100. We willen Drs. Ankur Jain en Taekijip Ha erkennen, wiens oorspronkelijke ontwikkeling van SiMPull dit werk inspireerde. ES-C presenteer adres: Immunodynamics Group, Laboratory of Integrative Cancer Immunology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, Bethesda

<ol><li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Signaling+by+Receptor+Tyrosine+Kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases.</a> Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).</li>
<li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reading+protein+modifications+with+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).</li>
<li>Coba, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitters+drive+combinatorial+multistate+postsynaptic+density+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks.</a> Science Signaling. 2 (68), (2009).</li>
<li>Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+modulates+the+affinity+of+light-activated+rhodopsin+for+g+protein+and+arrestin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin.</a> Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).</li>
<li>Stites, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+mechanistic+models+to+integrate+and+analyze+multiple+proteomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets.</a> Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).</li>
<li>Hause, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+binary+interaction+mapping+of+SH2+domains+via+fluorescence+polarization+reveals+novel+functional+diversification+of+ErbB+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors.</a> PLOS ONE. 7 (9), 44471(2012).</li>
<li>Lau, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+encoding+of+the+effect+of+a+partial+agonist+on+individual+opioid+receptors+by+multisite+phosphorylation+and+threshold+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection.</a> Science Signaling. 4 (185), (2011).</li>
<li>Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+and+analysis%3A+next+generation+Western+blotting+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).</li>
<li>Brunner, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+multiple+fragmentation+methods+on+an+orbitrap+fusion+for+top-down+phospho-proteoform+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).</li>
<li>Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Value+of+using+multiple+proteases+for+large-scale+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).</li>
<li>Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MARQUIS%3A+A+multiplex+method+for+absolute+quantification+of+peptides+and+posttranslational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+protein+complexes+using+single-molecule+pull-down%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down.</a> Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).</li>
<li>Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+pull-down+for+studying+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-molecule pull-down for studying protein interactions.</a> Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).</li>
<li>Kim, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pairwise+detection+of+site-specific+receptor+phosphorylations+using+single-molecule+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).</li>
<li>Salazar-Cavazos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+EGFR+phosphorylation+is+regulated+by+adaptor+protein+abundances+and+dimer+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695(2020).</li>
<li>Huyer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+inhibition+of+protein-tyrosine+phosphatases+by+vanadate+and+pervanadate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+lenses+for+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Objective lenses for confocal microscopy.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).</li>
<li>Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHendriks%2C+CLL+%22Dipimage%3A+a+scientific+image+processing+toolbox+for+MATLAB%22">Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB</a>. , (1999).</li>
<li>fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html">https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html</a> (2013).</li>
<li>Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+autofluorescence+on+DNA+microarrays+and+slide+surfaces+by+treatment+with+sodium+borohydride%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride.</a> Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).</li>
<li>Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+single-cell+single-molecule+pull-down%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Toward single-cell single-molecule pull-down.</a> Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het hier beschreven protocol is geoptimaliseerd om kwantitatieve metingen van receptorfosforylering op het niveau van één eiwit mogelijk te maken. Verschillende eenvoudige maar belangrijke wijzigingen in het SiMPull-protocol werden ontwikkeld die de betrouwbaarheid van de meting voor fosfo-tyrosinedetectie verbeterden, waaronder vermindering van autofluorescentie met NaBH4-behandeling en postfixatie van het monster om antilichaamdissociatie te voorkomen. Het gebruik van het groene kanaalmasker om receptorlocat...

Membraan-geassocieerde signalering wordt afgestemd door een combinatie van ligand-geïnduceerde membraanreceptoractivering en rekrutering van downstream accessoire-eiwitten die het signaal verspreiden. Fosforylering van belangrijke tyrosines in receptorcytoplasmatische staarten is van cruciaal belang voor het initiëren van de vorming van signaleringscomplexen, of signaalosomen 1,2. Daarom is een belangrijke vraag in de biologie hoe fosforyleringspatronen worden gecreëerd en onderhouden om signaalpartners te werven en cellulaire uitkomsten te dicteren. Dit omvat het begrijpen van de heterogeniteit van receptorfosforylering, zowel in overvloed als in de specifieke fosfotyrosinepatronen die een middel kunnen bieden om signaaluitgangen te manipuleren door de samenstelling van het signaalosoom 3,4,5,6,7 te dicteren. Er zijn echter beperkingen in de huidige methoden om eiwitfosforylering te ondervragen. Western blot-analyse is uitstekend voor het beschrijven van trends van eiwitfosforylering, maar is semikwantitatief8 en geeft geen informatie over de heterogeniteit van het systeem omdat duizenden tot miljoenen receptoren samen worden gemiddeld. Hoewel western blots het mogelijk maken om een monster te onderzoeken met behulp van fosfo-specifieke antilichamen tegen specifieke tyrosines, kunnen ze geen informatie geven over multisite fosforyleringspatronen binnen hetzelfde eiwit. Kwantitatieve fosfoproteomica rapporteren over de abundantie van fosfoyrosine, maar er zijn beperkingen aan het detecteren van multisietfosforylering, omdat de residuen van belang zich moeten bevinden in hetzelfde peptide (meestal 7-35 aminozuren) dat wordt gegenereerd door enzymatische vertering 9,10,11.
Om de hierboven genoemde beperkingen te overwinnen, is de single-molecule pull-down (SiMPull) assay aangepast om de fosforyleringstoestanden van intacte receptoren op het niveau van één molecuul te kwantificeren. SiMPull werd voor het eerst gedemonstreerd als een krachtig hulpmiddel voor het ondervragen van macromoleculaire complexen door Jain et al.12,13. In SiMPull werden macromoleculaire complexen immunoprecipitated (IP) op antilichaam-gefunctionaliseerde glazen coverslips en vervolgens geanalyseerd door middel van single-molecule microscopie voor eiwit subunitnummer en co-IP met complexe componenten12. Een modificatie door Kim et al.14, genaamd SiMBlot, was de eerste die een variatie van SiMPull gebruikte om fosforylering van gedenatureerde eiwitten te analyseren. Het SiMBlot-protocol is gebaseerd op het vastleggen van gebiotinyleerde celoppervlakeiwitten met behulp van NeutrAvidin-gecoate coverslips, die vervolgens worden onderzocht op fosforylering met fosfo-specifieke antilichaametikettering14. Ondanks deze vooruitgang waren verbeteringen nodig om de kwantificering van posttranslationele modificatie robuuster en toepasbaarder te maken voor een breder scala aan eiwitten.
Het huidige protocol beschrijft een geoptimaliseerde SiMPull-benadering die werd gebruikt om fosforyleringspatronen van intacte epidermale groeifactorreceptor (EGFR) te kwantificeren als reactie op een reeks ligandcondities en oncogene mutaties15. Hoewel dit werk zich richt op EGFR, kan deze aanpak worden toegepast op elke membraanreceptor en cytosolische eiwitten van belang (POI), waarvoor kwaliteitsantistoffen beschikbaar zijn. Het protocol bevat stappen om de autofluorescentie van monsters te verminderen, een ontwerp van een monsterarray dat een minimaal monstervolume vereist met gelijktijdige voorbereiding van maximaal 20 monsters, en optimalisatie van antilichaametikettering en fixatieomstandigheden. Data-analyse-algoritmen zijn ontwikkeld voor detectie en kwantificering van gefosforyleerde eiwitten met één molecuul.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td>MTC Bio</td><td>C2000</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl</td><td></td><td></td><td>T50 Buffer</td></tr><tr><td>100 mm Tissue Culture dish</td><td>CELLTREAT</td><td>229620</td><td>Storage of piranha etched glass/arrays</td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde Aqueous Solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Gevaarlijk</td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td></td><td></td><td>Functionalized Glass storage/ KOH reuse</td></tr><tr><td>50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl</td><td></td><td></td><td>Lysis Buffer Component</td></tr><tr><td>60 mm Tissue Culture dish</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>8% Glutaraldehyde Aqueous Solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16020</td><td>Gevaarlijk</td></tr><tr><td>Acetone (C3H6O)</td><td>Millipore Sigma</td><td>270725</td><td>Gevaarlijk</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-20006</td><td></td></tr><tr><td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human EGFR (External Domain) &ndash; Biotin</td><td>Leinco Technologies, Inc</td><td>E101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7020 AF647</td><td></td></tr><tr><td>Bath-sonicator</td><td>Branson</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SVA, MW 5,000</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-420-1</td><td>Tyrode's Buffer Component</td></tr><tr><td>Buchner funnel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bunsen burner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride (CaCl2)</td><td>Millipore Sigma</td><td>C4901</td><td>Tyrode's Buffer Component</td></tr><tr><td>Cell Scraper</td><td>Bioworld</td><td>30900017-1</td><td></td></tr><tr><td>Conical Filtering Flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>S15464</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>WHEATON</td><td>900470</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Automated Cell Counter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 24 x 60 #1.5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63793</td><td></td></tr><tr><td>DipImage</td><td></td><td></td><td>https://diplib.org/</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Caisson Labs</td><td>DML19-500</td><td></td></tr><tr><td>emCCD camera</td><td>Andor iXon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Optima</td><td>Bio-Techne</td><td>S12450H</td><td>Heat Inactivated</td></tr><tr><td>Fusion 360 software</td><td>Autodesk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geneticin G418 Disulfate</td><td>Caisson Labs</td><td>G030-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid (CH3COOH)</td><td>JT Baker</td><td>JTB-9526-01</td><td>Gevaarlijk</td></tr><tr><td>Glass serological pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass Stir Rod</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose (D-(+)-Glucose)</td><td>Millipore Sigma</td><td>D9434</td><td>Tyrode's Buffer Component</td></tr><tr><td>Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78446</td><td>Lysis Buffer Component</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td>Tyrode's Buffer Component</td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid (HCl)</td><td>VWR</td><td>BDH7204-1</td><td>Gevaarlijk</td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%)</td><td></td><td>HX0645</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%)</td><td>EMD Millipore</td><td>HX0635-2</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (NP-40)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I8896</td><td>Lysis Buffer Component</td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518F immersion oil</td><td>Zeiss</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>in-house vacuum line</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O)</td><td>MPBio</td><td>2191421</td><td>Tyrode's Buffer Component</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox</td></tr><tr><td>Methanol (CH3OH)</td><td>IBIS Scientific</td><td>MX0486-1</td><td>Gevaarlijk</td></tr><tr><td>Milli-Q water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits</td><td>Biotium</td><td>92245</td><td>Suggested conjugation kit</td></tr><tr><td>mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000</td><td></td></tr><tr><td>N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane</td><td>UCT United Chemical</td><td>A0700</td><td>Gevaarlijk</td></tr><tr><td>Nanogrid</td><td>Miraloma Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin Biotin Binding Protein</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen (compressed gas)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NVIDIA GPU with CUDA</td><td></td><td></td><td>Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html</td></tr><tr><td>Olympus iX71 Microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M Sealing Film</td><td>The Lab Depot</td><td>HS234526C</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL06</td><td></td></tr><tr><td>PC-200 Analog Hot Plate</td><td>Corning</td><td>6795-200</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2236BF</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Millipore Sigma</td><td>529552</td><td>Tyrode's Buffer Component</td></tr><tr><td>Potassium Hydroxide (KOH)</td><td>Millipore Sigma</td><td>1050330500</td><td>Gevaarlijk</td></tr><tr><td>Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter</td><td>Raise 3D</td><td>PMS:2035U/RAL:

een geoptimaliseerde single-molecule pull-down test voor kwantificering van eiwitfosforylering

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Fosforylering is een noodzakelijke posttranslationele modificatie die de eiwitfunctie reguleert en de celsignaleringsresultaten stuurt. De huidige methoden om eiwitfosforylering te meten, kunnen de heterogeniteit in fosforylering tussen individuele eiwitten niet behouden. De single-molecule pull-down (SiMPull) assay werd ontwikkeld om de samenstelling van macromoleculaire complexen te onderzoeken via immunoprecipitatie van eiwitten op een glazen coverslip gevolgd door single-molecule imaging. De huidige techniek is een aanpassing van SiMPull die robuuste kwantificering biedt van de fosforyleringstoestand van membraanreceptoren over de volledige lengte op het niveau van één molecuul. Door duizenden individuele receptoren op deze manier in beeld te brengen, kunnen eiwitfosforyleringspatronen worden gekwantificeerd. Het huidige protocol beschrijft de geoptimaliseerde SiMPull-procedure, van monstervoorbereiding tot beeldvorming. Optimalisatie van glaspreparatie- en antilichaamfixatieprotocollen verbetert de gegevenskwaliteit verder. Het huidige protocol biedt code voor de single-molecule data-analyse die de fractie van receptoren berekent die in een monster worden gefosforyleerd. Hoewel dit werk zich richt op fosforylering van de epidermale groeifactorreceptor (EGFR), kan het protocol worden gegeneraliseerd naar andere membraanreceptoren en cytosolische signaalmoleculen.

Een cartoon met het SiMPull-proces is weergegeven in figuur 1A. Coverslips worden gefunctionaliseerd met Behulp van NeutrAvidin als een anker voor gebiotinyleerde anti-EGFR-antilichamen om EGFR-GFP te vangen uit totale eiwitlysaten. Na het wegspoelen van ongebonden eiwit worden de gefosforyleerde receptoren gelabeld met een antifosfotyrosine (anti-PY) antilichaam15. Figuur 1B toont een afbeelding van de hydrofobe array, waarbij meerdere m...

Het huidige protocol beschrijft monstervoorbereiding en gegevensanalyse om eiwitfosforylering te kwantificeren met behulp van een verbeterde single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

Een geoptimaliseerde single-molecule pull-down test voor kwantificering van eiwitfosforylering

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Dit SiMPull-protocol maakt een kwantificering van eiwitfosforylering mogelijk door de etiketterings- en fixatieomstandigheden van antilichamen te verbeteren, autofluorescentie in het groene kanaal te verminderen en robuuste analysealgoritmen voor één molecuul te bieden. Het belangrijkste voordeel van SiMPull is dat het ons in staat stelt om de fosforyleringsstatus van individuele intacte eiwitten te ondervragen. Met deze methode kunnen we nieuwe informatie verkrijgen die niet toegankelijk is via traditionele technieken, zoals western blotting en massaspecificatieanalyse.We hebben een team van onderzoekers om het protocol te demonstreren. Eerst zal Julian Rojo laten zien hoe je piranha het coverglas kunt etsen. Rachel Grattan zal dan de stappen voor het coaten van het afdekglas laten zien.En Elizabeth Bailey zal laten zien hoe je de array- en afbeeldingsmonsters kunt tekenen. Om te beginnen ets piranha de hoes door het reactiebekerstuk elke vijf minuten gedurende 30 minuten voorzichtig te roeren. Neutraliseerde de piranha-oplossing door geleidelijk een zwakke basis toe te voegen.Breng met een glazen staaf de geëtste deksels over in een Buchner-trechter en spoel gedurende vijf minuten in dubbel gedestilleerd water. Plaats vervolgens de dekselslips in een glazen Coplin-pot en dek af met methanol. Sluit het deksel af met een afdichtingsfilm en bad soniceer gedurende 10 minuten.Na ultrasoonapparaat leegt u de methanol in een glazen opslagfles. Herhaal deze stap met aceton. Spoel de deksels driemaal af met dubbel gedestilleerd water in de Coplin pot.Giet het water van de afdekglijders af en droog ze door door de vlam van een Bunsenbrander te zwaaien. Plaats de dekselslips in een droge Coplin-pot. Voeg vervolgens amino-silaanoplossing toe aan de Coplin-pot om afdekslip-aminosilanisatie uit te voeren.Dek af en breng een afdichtingsfolie aan ter bescherming tegen licht. Spoel de afdeksel met methanol en gooi de gebruikte oplossing weg. Spoel de hoes nogmaals driemaal af met dubbel gedestilleerd water gedurende elk twee minuten.Dep overtollig vocht weg en droog volledig aan de lucht gedurende 10 minuten. Teken vervolgens een rasterarray met een hydrofobe barrièrepen. Markeer een id op de afdekplaat om de juiste oriëntatie te identificeren.Nadat de inkt is opgedroogd, plaatst u de afdekselglijders in een bevochtigde kamer. Resuspend 153 milligram mPEG en 3,9 milligram biotine-PEG in 609 microliter 10 millimolair natriumbicarbonaat en vortex. Centrifugeer bij 10.000 x g vanaf één minuut bij kamertemperatuur om bellen te verwijderen.Breng 10 tot 15 microliter van deze oplossing per vierkant aan om de array volledig te bedekken zonder over te lopen. Bewaar de hoes in de vochtige kamer in het donker gedurende drie tot vier uur bij kamertemperatuur. Was vervolgens de dekselslips door ze 10 seconden achter elkaar in drie bekers gevuld met dubbel gedestilleerd water te dopen.Verwijder al het vocht uit de afdekslips met behulp van stikstofgas. Bewaar de afdekselglijders rug aan rug in een conische buis van 50 milliliter gevuld met stikstof en sluit af met een afdichtingsfilm. Wikkel de buis in met afdichtingsfolie en plaats deze op min 20 graden Celsius.Verwijder de biotine-PEG gefunctionaliseerde arrays uit de vriezer en breng ze in evenwicht tot kamertemperatuur. Plaats de afdeksel met de array naar boven gericht over een weefselkweekschaal van 100 millimeter bekleed met afdichtingsfolie. Incubeer elk vierkant van de array met 10 milligram per milliliter natriumboorhydride in PBS gedurende vier minuten bij kamertemperatuur.Driemaal wassen met PBS. Vervolgens incuberen met 0,2 milligram per milliliter NeutrAvidin in T50 gedurende vijf minuten, gevolgd door driemaal wassen met T50 BSA. Herhaal de incubatie met twee microgram per milliliter gebiotinyleerd POI-specifiek antilichaam in T50 BSA gedurende 10 minuten gevolgd door wassen.Ontdooi eerst het lysaat door te pipetteren. Verdun één microliter van het lysaat tot 100 microliter ijskoude T50 BSA PPI. Incubeer het lysaat op de array gedurende 10 minuten, gevolgd door wassen.Bereid AF647 geconjugeerd antifosfotyrosine-antilichaam in ijskoude T50 BSA PPI en incubeer gedurende één uur op de array. Deponeer een druppel olie op het doel. Plaats het nanogrid op het podium voor beeldvorming.Gebruik doorgelaten wit licht om scherp te stellen op het rasterpatroon. Verkrijg een reeks van 20 afbeeldingen van het raster, zorg ervoor dat pixels niet verzadigd zijn en sla de afbeeldingsreeks op als fiduciaal. Defocus van het nanogrid om een luchtig patroon te creëren, verkrijg een reeks van 20 afbeeldingen voor versterkingskalibraties en sla het beeld op als versterking.Verkrijg vervolgens een reeks van 20 afbeeldingen voor camera-offset door al het licht naar de camera te blokkeren en de achtergrond van de afbeelding op te slaan. Om eenvoudige afbeeldingen te verkrijgen, reinigt u eerst het olieobjectief en deponeert u extra olie op het doel. Bevestig de cover slip array op de microscooptrap.Verkrijg beelden voor elk monster, eerst in het verrode kanaal, gevolgd door fluoroforen met een lagere golflengte. Controleer het bufferniveau elke 30 tot 45 minuten en vul het indien nodig aan. Met behulp van deze techniek werd EGFR-GFP gevangen uit totale eiwitlysaten.De autofluorescentie van de hydrofobe inkt werd gebruikt als leidraad voor het vinden van het brandpuntsvlak van het monster. Raw-gegevensafbeeldingen werden verkregen met spectrale kanalen gescheiden op de camerachip. Een overlay van de groene en verrode kanalen werd verder onderzocht voor data-acquisitie.Kanaalregistratie werd uitgevoerd op beelden die zijn verkregen van het nanogrid. Een overlay van fiduciale afbeeldingen toonde onvolledige registratie. Uitlijning werd gedaan door een lokaal gewogen gemiddelde transformatie toe te passen op de verrode en groene kanaalcoördinaten, die werd gebruikt om de daaropvolgende SiMPull-gegevens te registreren.Enkele emitters boven het aantal achtergrondfotonen van de GFP- en AF647-kanalen werden ingepakt en Gaussische lokalisatie werd uitgevoerd om de locaties te identificeren. Colocalisatie van EGFR-GFP in een F647 werd gedaan om gefosforyleerde receptoren te identificeren. En het percentage colocalisatie werd gebruikt om de fractie van gefosforyleerde receptoren te bepalen.Achtergronddetecties werden verminderd wanneer piranha geëtst glas werd behandeld met natriumboorhydride. Robuuste binding van EGFR-GFP in het lysaat werd waargenomen met minimale niet-specifieke PY99-AF647-binding, wat retentie van oppervlaktefunctionalisatie met behulp van deze techniek aantoont. SiMPull geeft informatie over eiwitfosforylering en kan een breed scala aan zelfsignaleringsvragen beantwoorden.Dit kan ons begrip van signalering in zowel normale als ziektetoestanden verbeteren.

an-optimized-single-molecule-pull-down-assay-for-quantification

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Beschrijving van een kwantitatieve fosforylering procedure met behulp van cryolysis, ureum solubilziation, HILIC fractionering en IMAC verrijking van gefosforyleerde peptiden.

Kwantitatieve Phosphoproteomics in Fatty Acid Gestimuleerd Saccharomyces cerevisiae</em

This video demonstrates a sensitive quantification technique of protein phosphorylation using a single-molecule pull-down assay. The functionalization of polyethylene glycol-biotin and the use of labeled antibodies increases the detection of phosphorylated tyrosine with specificity.

Single-Molecule Pull-Down Assay for Protein Phosphorylation Analysis: A High Throughput Technique to Quantify Protein Phosphorylation in Cell Lysate

We beschrijven hier een protocol voor de zuivering en karakterisering van plantaardig eiwit complexen. We zien dat door immunoprecipitatie een eiwit in een complex, zodat we kunnen zijn post-translationele modificaties en zijn interactie partners identificeren.

Identificatie van post-translationele modificaties van Plant eiwitcomplexen

We rapporteren en demonstreren een geoptimaliseerde nitrocellulose-bindendheidstest die kan worden gebruikt om de autofosforylering van gezuiverde bacteriële histidinekinasen te kwantificeren. Onze methode heeft verschillende voordelen ten opzichte van traditionele SDS-PAGE-gebaseerde technieken en biedt een waardevolle alternatief voor het karakteriseren van deze belangrijke eiwitten.

Kwantificering van bacteriële histidine kinase autofosforylering Met een Nitrocellulose bindingsassay

Proteïne kinasen zijn hoog geëvolueerde signaal enzymen en steigers die kritisch zijn voor inter- en intracellulaire signaaltransductie. Wij presenteren een protocol voor het meten van kinase-activiteit door middel van radioactief gemerkte adenosintrifosfaat ([γ-32P] ATP), een betrouwbare methode om te helpen bij het ophelderen van cellulaire signalering regulering.

Analyse van proteïnekinaseactiviteit met radiolabelde ATP

Peptide competitiebepalingen worden veel gebruikt in een verscheidenheid aan moleculaire en immunologische experimenten. Dit document beschrijft een gedetailleerde methode voor een in vitro oligopeptide-concurrerende kinase-analyse en de bijbehorende validatieprocedures, die nuttig kunnen zijn om specifieke fosforyleringsplaatsen te vinden.

Oligopeptide Concurrentie Assay voor Fosforylatie Site Bepaling

We kenmerkten een nieuwe kinase eiwit met behulp van robuuste biochemische benaderingen: Western Blot analyse met een dedicated specifieke antilichaam op verschillende cel lijnen en weefsels, interacties door coimmunoprecipitation experimenten, kinase activiteit gedetecteerd door westerse Vlek gebruikend een phospho-specifiek antilichaam en door γ [32P] ATP etikettering.

Karakterisering op moleculair niveau met behulp van robuuste biochemische benaderingen van een nieuwe kinase proteïne

Dit protocol beschrijft een niet-radioactieve test om kinase activiteit van polynucleotide kinases (PNKs) te meten op kleine DNA- en RNA-substraten.

Niet-radioactieve test om polynucleotide fosforylatie van kleine nucleotide substraten te meten

Tijd-opgeloste Förster resonantie energieoverdracht cel-gebaseerde assay protocollen worden beschreven voor de eenvoudige, specifieke, gevoelige en robuuste kwantificering van endogene gefosforyleerde signaal transducer en activator van transcriptie (STAT) 1/3/4/5/6 eiwitten in cellysaten in een 384-well formaat.

Tijd-opgeloste Förster Resonantie Energie Transfer Assays voor meting van endogene gefosforyleerde STAT-eiwitten in menselijke cellen

Hier presenteren we een protocol voor de verrijking van endogene fosfoproteïnefosfatasen en hun interagerende eiwitten uit cellen en weefsels en hun identificatie en kwantificering door op massaspectrometrie gebaseerde proteomica.

Een op massaspectrometrie gebaseerde benadering om fosfoproteïnefosfatasen en hun interactoren te identificeren

Ontdek de SiMPull-methode voor kwantificering van eiwitfosforylering met geoptimaliseerde antilichaamlabeling en fixatie. Deze techniek reduceert autofluorescentie en biedt robuuste algoritmen voor enkelmolecuulanalyse.

Een geoptimaliseerde single-molecule pull-down test voor kwantificering van eiwitfosforylering

Meer video's verkennen