Experimentele kwantificering van interacties tussen medicijnafgiftesystemen en cellen in vitro: een gids voor preklinische nanogeneeskunde-evaluatie

Dit protocol biedt kwantitatieve gegevens over hoe dragersystemen interageren met cellen. Kwantitatieve gegevens zijn de sleutel tot engineering en optimalisatie. Het stelt ons in staat om van ja of nee biologische vragen, naar hoeveel vragen te gaan.

Deze techniek is nuttig om resultaten van preklinische prestaties van geneesmiddelendragers, die kwalitatief waren, om te zetten in kwantitatieve resultaten. En dit werkt zelfs wanneer u uw drager op een ander systeem karakteriseert dan wanneer u uw cellen karakteriseert. Het kan een paar iteraties duren om de optimale dragerverdunning te vinden die binnen het lineaire of kwantitatieve bereik van de nanokant valt.

Neem de tijd voor het vinden van de juiste voorwaarden. Om te beginnen monteert u de stroomcel op de lasermodule. Spoel de stroomcel langzaam met een snelheid van 0,1 milliliter per seconde met één milliliter gedestilleerd water.

Als zich bellen vormen in de stroomcel, trekt u de suspensie gedeeltelijk in om de bel samen te voegen met de lucht-vloeistofinterface voordat u verder gaat. Vergrendel vervolgens de hele lasermodule op zijn plaats in het instrument. Start de camera ongeveer halverwege het spoelen.

Zorg ervoor dat u bevestigt dat het dragerpuin is weggespoeld. Selecteer vastleggen om het tabblad opname-instellingen te openen en klik op Camera starten. Drijf het systeem aan met één milliliter lucht.

Als er statische dragers zichtbaar zijn op het scherm, reinigt u de stroomcel volgens de instructies van de fabrikant. Bereid de dragers voor op nanodeeltjestraceringsanalyse door ervoor te zorgen dat de dragers goed zijn gesuspendeerd via ultrasoonapparaat of vortexing, afhankelijk van het betrokken dragersysteem. Verdun de dragers in water om ten minste 0,6 tot één milliliter van elk monster te bereiden met een dragerconcentratie tussen 1x10 tot de zevende en 1x10 tot de negende dragers per milliliter.

Haal de lasermodule eruit en plaats deze rechtop. Laat het eerste dragermonster in een spuit van één milliliter vallen en bevestig de spuit aan de buisinlaat. Laad het monster vervolgens voorzichtig in de stroomcel.

Als er bellen ontstaan in de stroomcel, trekt u de suspensie gedeeltelijk in om de bel samen te voegen met de lucht-vloeistofinterface voordat u verder gaat. Zorg ervoor dat de hele stroomcel is gevuld met vloeistof en pauzeer vervolgens het laden. Pas indien nodig de camerafocus aan om individuele dragers te visualiseren.

Maak grove scherpstellingsaanpassingen met de draaiknop aan de rechterkant van het instrument. Breng fijnere aanpassingen aan door het tabblad Hardware te selecteren. Wijzig de scherpstelling door de focusschuifregelaar aan te passen.

Om ervoor te zorgen dat er geen oververzadiging is, selecteert u het optimale cameraniveau door de schuifregelaar op het tabblad Vastleggen aan te passen. Als het instrument met dit accessoire is uitgerust, laadt u de spuit met het dragermonster in de spuitpomp. Selecteer op het tabblad SOP de optie standaardmeting om vijf opnamen van elk 30 seconden te maken.

Voer de naam van het basisbestand in en voeg desgewenst aanvullende voorbeeldinformatie toe door op de geavanceerde knop te klikken die een modaal dialoogvenster met verschillende keuzes opent. Druk op script maken en uitvoeren en wacht tot er een pop-up verschijnt waarin wordt gevraagd om een voorbeeld vooraf te nemen. Als u de spuitpomp gebruikt, selecteert u het hardwaretabblad en vervolgens het tabblad spuitpomp.

Stel de gewenste infusiesnelheid in en druk op infuse. Als u de spuitpomp niet gebruikt, dient u het monster handmatig te verplaatsen. Selecteer in het pop-upvenster OK om te beginnen met vastleggen.

Controleer na elk van de vijf vangsten, wanneer het geavanceerde monster opnieuw verschijnt, of het monster nog steeds door de stroomcel beweegt. Selecteer vervolgens OK om door te gaan met de volgende opname. Stel op het tabblad Proces de schuifregelaar voor detectiedrempels in tussen vier en acht om de verschillende dragers die zichtbaar zijn op het scherm correct te identificeren.

U kunt de schermversterking aanpassen om visualisatie te ondersteunen, dit heeft geen invloed op de downstream-analyse. Druk in de pop-up op OK om de trackinganalyse te starten. Volg de voortgang van de analyse door op de analyse in één analysetabblad te klikken.

Zodra de analyse is voltooid, zoekt u naar een prompt voor exportinstellingen die wordt weergegeven. Controleer of de samenvatting van de pdf opnemen en het experiment opnemen is geselecteerd. Selecteer naar wens andere exportindelingen.

Controleer in het gedeelte resultaten van de PDF-gegevensexport of de gemeten concentratie betrouwbaar is en controleer of de gemeten dragerconcentratie tussen 1x10 en de zevende en 1x10 tot de negende dragers per milliliter ligt en controleer op foutmeldingen of waarschuwingsberichten onder het concentratiemeetresultaat. Herhaal de procedure twee of meer keer met verschillende verdunningen uit de voorraad en zorg ervoor dat de concentratie van elk monster binnen het lineaire bereik van het instrument valt. Bereken de voorraaddragerconcentratie zoals beschreven in het tekstmanuscript.

Bereid de vrije of antilichaam geconjugeerde fluorochroomoplossing zoals beschreven in het tekstmanuscript. Bereken de concentratie van de stamoplossing op basis van de concentratie, het molecuulgewicht en het getal van Avogadro zoals weergegeven in de vergelijking. Voer vervolgens een seriële verdunning van de kleurstof in het dragerverdunningsmiddel uit om standaardcurvemonsters te genereren.

Voeg vervolgens het dragermonster toe aan de meetplaat en meet fluorescentie met behulp van een microplaatlezer. Genereer de standaardcurve zoals beschreven in het tekstmanuscript. Bereken de absolute fluorescentie-intensiteit per drager door de bulkfluorescentie te delen door de dragerconcentratie.

Stel de flowcytometer in voor het uiteindelijke dragercelexperiment door optimale PMT-spanningsinstellingen in de relevante kanalen te bepalen. Voer een negatief controlemonster uit waarbij de cellen niet zijn geïncubeerd met dragers om de achtergrondfluorescentie te bepalen. Bereid de flowcytometriekwantificeringsparels voor en suspensie opnieuw.

Gebruik dezelfde buffer als voor de celmonsters. Als de kralenpopulaties afzonderlijk worden verstrekt, trek ze dan samen. Voer de flowcytometriekwantificeringskraal en de dragercelmonsters uit om de fluorescentie-intensiteit per cel te bepalen.

Voer de quantitatiekralen van de flowcytometer uit om een standaardcurve te genereren, waarbij de absolute fluorescerende intensiteit wordt omgezet in MFI. Gebruik dit om de theoretische MFI van de dragers te berekenen zoals beschreven in het tekstmanuscript. Voer de celdragermonsters uit om de fluorescerende intensiteit per cel van elk monster te bepalen.

Bereken ten slotte het aantal dragers per cel voor elk monster door de achtergrondfluorescentie af te trekken van de gemeten fluorescentie van het monster en vervolgens te delen door de fluorescentie per deeltje. Voor 633 nanometer Polymethacrylzuur kernschildeeltjes waren de concentratie en fluorescerende intensiteit per drager direct kwantificeerbaar met behulp van de cytometerstroom. Daarentegen waren 100 nanometer super paramagnetische ijzeroxide nanodeeltjes te klein om individueel te detecteren en werden geanalyseerd met behulp van de bulkstroom.

Gelabelde quantitatiekorrels werden op meerdere dagen gebruikt om standaardcurven op een flowcytometer te genereren. De correlatie tussen de gemeten MFI en de MESF-waarde van de quantitatiekorrels was lineair en in grote lijnen vergelijkbaar tussen de gemeten data. Tijdsverloopexperimenten met fluorescerende gelabelde HeLa-cellen met 235 nanometer polymethacrylzuurcapsules van nul tot 24 uur toonden een toename van de MFI in de loop van de tijd, wat aangeeft dat de capsules geassocieerd waren met HeLa-cellen.

Het verschil in de schijnbare cellulaire respons op dragers was groot, afhankelijk van relatieve of absolute kwantificering. De absolute kwantificering was onafhankelijk van de labelintensiteit en dus meer vergelijkbaar. Deze technieken vormen de basis voor een diepere analyse en vergelijking van deeltjesprestaties.

We zijn enthousiast over het gebruik van deze technieken om wiskundige modellen te parametriseren waarmee we deeltjesprestaties onafhankelijk van een bepaald experiment kunnen karakteriseren.