Technische toepassingen van micro-elektrode array en patchklemopnamen op door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten

Cardiale veiligheidsbeoordeling is een cruciaal onderdeel tijdens het ontwikkelingsproces van geneesmiddelen. Menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten hebben bewezen een betrouwbaar, efficiënt en op mensen gebaseerd model te zijn voor preklinische cardiale veiligheidsbeoordeling. We hebben methodologieën opgesteld om het functionele kenmerk van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten uitgebreid te onderzoeken, die van echt belangrijke ziektemodellering, door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteitsscreening en precisiegeneeskunde zijn.

De groeiende opname van van humane iPSC afgeleide cardiomyocyten in het standaard preklinische veiligheidsevaluatieproces heeft het potentieel om de nauwkeurigheid van toxiciteitsvoorspelling van de verbindingen van een kandidaat te verbeteren. Begin met het kweken van de menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten gedurende ten minste 10 dagen voordat de meting wordt uitgevoerd. Zet de temperatuurregelaar aan en zet deze op 37 graden.

Schakel de microscoop, camera en kooldioxidetoevoer in. Vul de watermantel van de plaathouder met een geschikte hoeveelheid steriel gedeïoniseerd water. Plaats de 96 putplaat op de plaathouder en incubeer de cellen gedurende ten minste vijf minuten.

Open de weergavesoftware en stel de framesnelheid van de camera in op 75 frames per seconde en de video- of beeldresolutie op 1024 x 1024 pixels. Pas de autofocus- en automatische helderheidsfuncties toe, neem video's en afbeeldingen op van menselijke iPSC afgeleide cardiomyocyten. Plaats voorzichtig een druppeltje van acht microliter extra cellulaire matrixcoatingoplossing over het opname-elektrodegebied van elke put van de 48 goed micro-elektrode arrayplaten.

Voeg vervolgens drie milliliter steriel gedeïoniseerd water toe aan het gebied rond de putten om verdamping van de coatingoplossing te voorkomen. Verwijder met behulp van een pipetpunt van 200 microliter het grootste deel van het extra cellulaire matrixmedium van het putoppervlak binnen dezelfde enkele rij of kolom zonder de elektroden aan te raken. Zaai 50.000 cellen per putje in een druppeltje van acht microliter zaaimedium over het opname-elektrodegebied.

Herhaal dit totdat alle putten zijn verguld met cellen. Incubeer vervolgens de micro-elektrode arrayplaten in een bevochtigde celkweekincubator. Voeg langzaam 150 microliter zaaimedium toe aan elk putje van de micro-elektrode arrayplaten.

Controleer op dag 10 na het plateren de dichtheid van spontane kloppende menselijke iPSC CM-monolaag onder een microscoop. Plaats de 48-putjes micro-elektrode arrayplaat in het opname-instrument. Zorg ervoor dat de temperatuur 37 graden celsius is en koolstofdioxide 5% Open de navigatorsoftware.

Selecteer in het experimentele installatievenster cardiale real-time configuratie en veld potentiële opnames. Pas spontane of plak kloppende configuraties toe. Stel in beatdetectieparameters de detectiedrempel in op 300 microvolt, de minimale slagtijd op 250 milliseconden en de maximale slagtijd op vijf seconden.

Selecteer polynomiale regressie voor de berekening van de potentiële duur van het veld. Controleer of het basislijn elektrische activiteitssignaal volwassen en stabiel is en verkrijg de baseline cardiale activiteiten gedurende één tot drie minuten. Voer de opname 10 dagen na de beplating uit.

Vervang het menselijke iPSC CM-onderhoudsmedium door de oplossing van tyrode en laat de cellen gedurende 15 minuten acclimatiseren. Plaats de temperatuursensoren in de kamer en plaats de schotel van 35 millimeter erin. Stel de temperatuur in op 37 graden.

Trek de micropipetetten uit borosilicaatglasvaten met behulp van een micropipettrekker. Vul de micropipetjes met de intracellulaire oplossing en plaats ze in de houder die is aangesloten op de koptrap van de patchklemversterker. Open de acquisitiesoftware, laad het opnameprotocol voor actiepotentialen en selecteer de configuratie van de spanningsklem.

Plaats de micropipet in de badoplossing en selecteer de juiste iPSC-CM's voor één mens. Pas de positie van de micropipet naast de geselecteerde cel aan en verlaag deze met behulp van een micromanipulator. Wanneer de pipetpunt in de badoplossing wordt ingebracht, controleert u op de pipetweerstand op de oscilloscoopmonitor.

Plaats de pipet dicht bij de cel en de stroompulsen zullen iets afnemen om de toenemende weerstand van de afdichting weer te geven. Breng zachte zuigkracht met onderdruk aan om de weerstand te verhogen. Dit zal een gigaseal vormen.

Pas vervolgens de sealfunctie toe. Pas extra zuigkracht toe om het membraan te breken om een hele celopnameconfiguratie te krijgen. Schakel op dit punt over van de spanningsklemmodus naar de huidige klemmodus of geen stroominjectie met behulp van het versterkerdialoogvenster.

Druk op de opnameknop om de potentiële opnamebestanden voor actie te genereren en op te slaan. Voer de calciumtransiënte meting ten minste 10 dagen na het plateren uit. Bereid verse tyrode's oplossing en Fura-2 AM laadoplossing.

Aspirateer het menselijke iPSC CM-onderhoudsmedium en was de kamers tweemaal met de oplossing van tyrode. Breng 100 microliter Fura-2 AM laadoplossing aan en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Vervang de Fura-2 AM laadoplossing door tyrode's oplossing en incubeer gedurende ten minste vijf minuten voor volledige ontsterving van Fura-2 AM. Voeg een druppel dompelolie toe aan het 40x olie-onderdompelingsdoel van een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop.

Plaats de celkamer in de podiumadapter van de microscoop. Installeer de draden van de temperatuurregelaar in de badkamer en stel deze in op 37 graden Celsius. Installeer de elektroden voor elektrische veldstimulatie en stel de pulsen in op 0,5 hertz met een duur van 20 milliseconden.

Schakel de ultrasnelle golflengte schakelende lichtbron in en stel deze in op 340 nanometer en 380 nanometer snelle schakelmodus. Pas een belichtingstijd van 20 milliseconden toe voor beide golflengten en een opnametijd van 20 seconden. Neem de video op die real-time veranderingen van calciumtransiënt weergeeft, exporteer de gegevens naar een spreadsheet voor analyse.

Humane iPSC afgeleide cardiomyocyten monolaag werd gebruikt voor de contractiebewegingsmeting. Analyse van een spoor van de contractie-relaxatiebeweging met behulp van de analyzersoftware detecteerde het begin van de weeën, de contractiepiek, het contractie-einde, de ontspanningspiek en het ontspanningseinde. Volledige dekking van de menselijke iPSC afgeleide cardiomyocyten monolaag werd waargenomen op alle elektroden in de micro-elektrode arrayplaten.

De volwassen golfvormen die door elke elektrode werden geregistreerd, weerspiegelden het cardiale veldpotentiaal met identificeerbare kenmerken. Na analyse werden de beatperiode, de duur van het veldpotentiaal en de spike-amplitude verkregen. Whole cell patch clamp opnames in de huidige klemmodus registreerden de spontane actiepotentialen van enkele cardiomyocyten.

Na analyse werden verschillende parameters verkregen, waaronder de amplitude, de maximale diastolische potentiaal en de duur van de actiepotentiaal. Na de analyse van calciumbeeldvorming werd F340 door F380-verhouding in de loop van de tijd verkregen en werden ruwe sporen van gestimuleerde calciumtransiënten uitgezet. Bovendien werden parameters zoals amplitude, diastolisch calcium en calciumverval tau verkregen.

Het is belangrijk om de menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten te gebruiken die zich in goede kloppende omstandigheden bevinden, en om de hoge zuiverheid van de menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten te garanderen. Dit protocol omvat vier specifieke technieken om menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocytenfunctionaliteit, andere configuratie of automatische onderzoek naar cardiale ionische stromen te bestuderen die een cruciale rol spelen in cardiale