Isolatie en kwantificering van epstein-barrvirus uit de P3HR1-cellijn

Met deze methode kunnen we Epstein Barr-virusdeeltjes uit de P3HR1-cellijn isoleren en de virusvoorraad kwantificeren, zodat deze voor verschillende onderzoeksdoeleinden kan worden gebruikt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een relatief eenvoudige, goedkope, snelle en betrouwbare methode biedt om een EB-virale voorraad te bereiden. De vitale deeltjes die door deze techniek worden geproduceerd, kunnen in veel in vitro of in vivo experimentele modellen worden gebruikt voor de diagnose van EB.To beginnen, een volume celsuspensie A bereiden in een conische buis van 15 milliliter, het volume zodanig aanpassen dat het aantal cellen ongeveer 2,2 miljoen cellen is voor een kweekplaat van 100 millimeter.

Voeg vijf milliliter compleet kweekmedium toe aan de buis. Voeg 80 microliter dimethylsulfoxide toe aan de buis. Voeg vervolgens 350 microliter van één milligram per milliliter PMA toe aan de buis.

De uiteindelijke concentratie pma moet 35 nanogram per milliliter zijn en die van DMSO moet 0,08% zijn Voeg 4,27 milliliter kweekmedium toe, zodat het totale volume 10 milliliter is. Meng de inhoud van de buis door te kantelen en breng de inhoud vervolgens over op een kweekplaat van 100 millimeter. Laat de plaat vijf dagen in een celkweekincubator staan bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide.

Na vijf dagen in de incubatorcentrifugeer de inhoud van de plaat op 120 G gedurende acht minuten om de cellen te pelleteren Verzamel het celvrije virus met supernatant en gooi de celpellet weg. Centrifugeer het supernatant opnieuw op 16.000 G gedurende 90 minuten bij vier graden Celsius om de virusdeeltjes te pelleteren. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de viruspellet in vijf milliliter kweekmedium, Aliquot de virale suspensie in 20 buizen die elk 250 microliter van de virale suspensie bevatten en bewaar de suspensie bij min 80 graden Celsius.

Om de eiwitten van DNA te scheiden, voegt u 500 microliter Tris-verzadigd fenol toe aan een van de buizen die het virale preparaat bevatten. Voeg 100 microliter water en vortexput toe om een roze emulsie te verkrijgen. Centrifugeer gedurende 15 minuten op 9.650 G, verzamel het supernatant en breng het over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.

Voeg een equivalent van een tiende van het supernatantvolume koud natriumacetaat toe en meng door op en neer te pipetteren. Voeg vervolgens een microliter van 20 milligram per milliliter glycogeen toe en meng door te pipetteren. Voeg drie keer het volume koude 100% ethanol van het supernatant toe en bewaar het 's nachts bij min 80 graden Celsius.

Om de virale DNA-centrifuge te isoleren op 9, 650 G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg om een DNA-pellet te verkrijgen en was de pellet drie keer met één milliliter koude 70% ethanol. Nogmaals centrifugeren op 9, 650 G gedurende 15 minuten en gooi het supernatant weg.

Nadat u de pellet ongeveer 10 minuten aan de lucht hebt gedroogd, resuspenseert u de pellet in 10 tot 50 microliter nucleasevrij gedestilleerd water. Bewaar de monsters bij min 20 graden Celsius voor latere verwerking of bij vier graden Celsius 's nachts om maximale DNA-oplossing te garanderen, gevolgd door opslag bij min 20 graden Celsius. Na het reinigen van het voetstuk van een microspectrofotometer met een delicate taakwisser laadt u één microliter van het voorbereide DNA-monster en noteert u de concentratie van het DNA in het monster.

Controleer de absorptieverhoudingen op zowel 260 tot 280 nanometer als 260 tot 230 nanometer. DNA absorbeert op 260 nanometer, eiwitten op 280 nanometer en organische stoffen zoals fenol absorberen op 230 nanometer. Een verhouding van 1,8 op 2 wordt voldoende geacht voor realtime PCR.

Om de PCR-reactiemixen te bereiden, plaatst u vijf microliter van een cybergroene realtime PCR-mix in PCR-buizen van 0,2 milliliter. Voeg één microliter van 7,5 picomol per microliter voorwaartse primer en één microliter van 7,5 picomol per microliter omgekeerde primer toe aan elke buis. Hier wordt het EBV-gen voor klein RNA 2 versterkt.

Om het EBV-genoomkopienummer te bepalen. Voeg vervolgens twee microliter nucleasevrij water en een microliter viraal DNA toe aan een van de buizen. Het totale volume van het reactiemengsel is 10 microliter.

Bereid andere buizen voor die zullen worden gebruikt als standaarden met bekende EBV-genoomkopienummers. Laat de PCR-mengsels beginnen met een eerste stap van activering bij 95 graden Celsius gedurende vijf minuten. Dan 40 cycli bij 95 graden Celsius gedurende 15 seconden en bij 58 graden Celsius gedurende 30 seconden.

Exporteer alle datasheets als CSV-bestanden en bereken het logboek van het aantal EBV-genoomkopieën per standaardbuis en gemiddelde CQ-waarden. Genereer een qPCR-standaardcurve door de CT-waarden van de normen uit te zetten tegen het logboek van het aantal genoomkopieën. Met behulp van de standaard curve plot vergelijking, leidt u het aantal EBV-genoomkopieën af in de PCR-buis die het geïnduceerde virale DNA bevat.

Gebruik ten slotte de formule op het scherm om de concentratie van het geïnduceerde virale preparaat te berekenen. Hier is X het aantal EBV-genoomkopieën afgeleid van de standaardcurve en F is de verdunningsfactor die wordt gebruikt om het DNA per PCR-reactie in te stellen. Celtelling met behulp van een hemocytometerkamer wordt hier weergegeven.

Vier kwadranten worden geteld met behulp van een lichtmicroscoop. Hier moeten cellen die in blauw worden aangegeven, worden geteld, terwijl cellen in rood niet mogen worden geteld, omdat ze de bovenste, rechter-, onder- of linkerranden van het kwadrant raken. Een optimalisatiestudie werd uitgevoerd om de concentraties PMA en dimethylsulfoxide te bepalen die het hoogste aantal EBV-deeltjes zouden opleveren.

Een DMSO-concentratie van 0,8% en een PMA-concentratie van 35 nanogram per microliter waren optimaal en resulteerden in hoge EBV-concentraties. Ons laboratorium gebruikte de vitale deeltjes die door deze techniek worden geproduceerd om pro-auto-immuun- of ontstekingsreacties op dit virus te onderzoeken. Evenals om nieuwe anti-EBV-middelen te ontwikkelen.