Aptamer-gebaseerde doeldetectie mogelijk gemaakt door een 3-traps G-Quadruplex isothermische exponentiële versterkingsreactie

Deze methode biedt een manier om het signaal van bindingsgebeurtenissen te versterken tot een vorm die visueel detecteerbaar is voor een laag gebruik van hulpbronnen of kan worden gekwantificeerd met behulp van op absorptie gebaseerde instrumentatie. Dit is een relatief snel, one-pot protocol om de aanwezigheid van het doelwit van de aptamer in een steekproef van belang te bepalen. De resultaten kunnen worden vergeleken met een standaard kalibratiecurve als kwantificering gewenst is.

Individuen moeten zeer nauwkeurig zijn bij het overbrengen en mengen van de oplossingen, omdat onvoldoende mengen tot negatieve resultaten zal leiden. Zorg er ook voor dat reagentia en oplossingen gekoeld worden bewaard tot gebruik om het achtergrondsignaal te minimaliseren. Begin met het activeren van de ribozyme splitsingsproducten door vijf eenheden T4 polynucleotidekinase toe te voegen in een PCR-buis.

Voeg vervolgens een microliter vooraf voorbereide 5X ribozymbuffer toe aan elke monsterbuis. Om de specificiteit visueel aan te tonen, voegt u 1,5 microliter van twee millimolaire theofylline of twee millimolaire cafeïne toe aan elke monsterbuis als de testmonsters en mengt u elk monster grondig door vijf tot 10 keer te pipetteren. Voeg vervolgens twee microliter 600 nanomolair RNA met een doelspecifiek aptamerisch domein toe aan elke monsterbuis, gevolgd door pipetteren om de componenten snel te mengen.

Plaats nu de buis op een koud blok om het achtergrondsignaal te minimaliseren. Nadat u alle reactiebuizen hebt voorbereid, incubeer u elk monster gedurende precies drie minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie brengt u de monsterbuizen onmiddellijk terug naar het ijs.

Voeg 3,5 microliter nicase polymerase enzymmengsel toe aan elke monsterbuis en meng goed. Voeg vervolgens 31,5 microliter EXPAR-reactiemengsel met sjabloonnucleotiden en reactiebuffer toe aan elke monsterbuis en meng door pipetteren. Zodra alle monsters zijn voorbereid, incubeer je het voorbereide monster gedurende vijf minuten bij 55 graden Celsius met behulp van een timer.

Breng de monsterbuizen na incubatie onmiddellijk terug naar het ijs. Voeg twee microliter heminoplossing toe aan elke monsterbuis voor kleurontwikkeling en meng goed. Voeg vervolgens 58 microliter van de in de handel verkrijgbare TMB-oplossing toe aan elke monsterbuis, meng goed en incuber voor kleurontwikkeling.

Lees de monsters kwalitatief met het oog of kwantificeer de resultaten met behulp van een absorptieplaatlezer, zoals beschreven in het manuscript. Het geoptimaliseerde construct kon slechts 500 nanomolaire theofylline in 30 minuten herkennen. Monsterpreparaten die aan het doelwit worden blootgesteld, produceren een blauwe kleur, terwijl monsters die geen doelwit bevatten, kleurloos blijven.

Een standaardcurve werd voorbereid op basis van het signaal gemeten bij A450 na 30 minuten kleurontwikkeling. Het is belangrijk om monsters op ijs te houden wanneer ze geen incubaties uitvoeren, omdat zelfs het geoptimaliseerde RNA nog steeds een laag achtergrondactiviteitsniveau zal vertonen.