Aptamer-gebaseerde doeldetectie mogelijk gemaakt door een 3-traps G-Quadruplex isothermische exponentiële versterkingsreactie
6 oktober 2022
Het huidige protocol demonstreert het gebruik van een snelle, 3-traps, aptamer-gebaseerde exponentiële versterkingstest om doelen te detecteren. Monstervoorbereiding, signaalversterking en kleurontwikkeling worden behandeld om dit systeem te implementeren om de aanwezigheid van theofylline te herkennen boven die van cafeïne.
Deze methode biedt een manier om het signaal van bindingsgebeurtenissen te versterken tot een vorm die visueel detecteerbaar is voor een laag gebruik van hulpbronnen of kan worden gekwantificeerd met behulp van op absorptie gebaseerde instrumentatie. Dit is een relatief snel, one-pot protocol om de aanwezigheid van het doelwit van de aptamer in een steekproef van belang te bepalen. De resultaten kunnen worden vergeleken met een standaard kalibratiecurve als kwantificering gewenst is.
Individuen moeten zeer nauwkeurig zijn bij het overbrengen en mengen van de oplossingen, omdat onvoldoende mengen tot negatieve resultaten zal leiden. Zorg er ook voor dat reagentia en oplossingen gekoeld worden bewaard tot gebruik om het achtergrondsignaal te minimaliseren. Begin met het activeren van de ribozyme splitsingsproducten door vijf eenheden T4 polynucleotidekinase toe te voegen in een PCR-buis.
Voeg vervolgens een microliter vooraf voorbereide 5X ribozymbuffer toe aan elke monsterbuis. Om de specificiteit visueel aan te tonen, voegt u 1,5 microliter van twee millimolaire theofylline of twee millimolaire cafeïne toe aan elke monsterbuis als de testmonsters en mengt u elk monster grondig door vijf tot 10 keer te pipetteren. Voeg vervolgens twee microliter 600 nanomolair RNA met een doelspecifiek aptamerisch domein toe aan elke monsterbuis, gevolgd door pipetteren om de componenten snel te mengen.
Plaats nu de buis op een koud blok om het achtergrondsignaal te minimaliseren. Nadat u alle reactiebuizen hebt voorbereid, incubeer u elk monster gedurende precies drie minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie brengt u de monsterbuizen onmiddellijk terug naar het ijs.
Voeg 3,5 microliter nicase polymerase enzymmengsel toe aan elke monsterbuis en meng goed. Voeg vervolgens 31,5 microliter EXPAR-reactiemengsel met sjabloonnucleotiden en reactiebuffer toe aan elke monsterbuis en meng door pipetteren. Zodra alle monsters zijn voorbereid, incubeer je het voorbereide monster gedurende vijf minuten bij 55 graden Celsius met behulp van een timer.
Breng de monsterbuizen na incubatie onmiddellijk terug naar het ijs. Voeg twee microliter heminoplossing toe aan elke monsterbuis voor kleurontwikkeling en meng goed. Voeg vervolgens 58 microliter van de in de handel verkrijgbare TMB-oplossing toe aan elke monsterbuis, meng goed en incuber voor kleurontwikkeling.
Lees de monsters kwalitatief met het oog of kwantificeer de resultaten met behulp van een absorptieplaatlezer, zoals beschreven in het manuscript. Het geoptimaliseerde construct kon slechts 500 nanomolaire theofylline in 30 minuten herkennen. Monsterpreparaten die aan het doelwit worden blootgesteld, produceren een blauwe kleur, terwijl monsters die geen doelwit bevatten, kleurloos blijven.
Een standaardcurve werd voorbereid op basis van het signaal gemeten bij A450 na 30 minuten kleurontwikkeling. Het is belangrijk om monsters op ijs te houden wanneer ze geen incubaties uitvoeren, omdat zelfs het geoptimaliseerde RNA nog steeds een laag achtergrondactiviteitsniveau zal vertonen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol toont een snelle, 3-stadia, aptamer-gebaseerde exponentiële amplificatie-assay voor het detecteren van doelen zoals theofylline. Het omvat monstervoorbereiding, signaalversterking en kleurontwikkeling.
Belangrijkste onderdeel van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Analytische chemie
- Biotechnologie
Achtergrond
- Aptamers zijn korte, enkelstrengse RNA- of DNA-moleculen die zich aan specifieke doelen kunnen binden.
- Signaalversterking is cruciaal voor het detecteren van doelen met een lage abundantie.
- Visuele detectiemethoden kunnen gunstig zijn voor omgevingen met weinig middelen.
- Precieze omgang met reagentia is essentieel voor nauwkeurige resultaten.
Doel van het onderzoek
- Om een snelle methode te ontwikkelen voor het detecteren van theofylline ten opzichte van cafeïne.
- Om een one-pot protocol voor signaalversterking te bieden.
- Om kwantificering van resultaten mogelijk te maken met behulp van een calibratiecurve.
Gebruikte methoden
- Activering van ribozym splitsingsproducten met T4 polynucleotide kinase.
- Visuele detectie van bindingsgebeurtenissen.
- Kwantificering met behulp van op absorptie gebaseerde instrumentatie.
- Zorgvuldig mengen en koelen van reagentia om achtergrondsignalen te minimaliseren.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt het mogelijk om theofylline in monsters te detecteren.
- Resultaten kunnen visueel worden geïnterpreteerd of gekwantificeerd.
- Precisie in oplossingsomgang is cruciaal voor succesvolle uitkomsten.
- Achtergrondsignalen kunnen worden geminimaliseerd met correct reagentiabeheer.
Conclusies
- De aptamer-gebaseerde assay is een snelle en effectieve methode voor doeldetectie.
- Het kan worden aangepast voor verschillende toepassingen in omgevingen met weinig middelen.
- Toekomstige studies kunnen extra doelen onderzoeken en het protocol optimaliseren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Aptamer-based detection systems with isothermal exponential amplification offer rapid, sensitive, and visually interpretable outputs for target validation in early discovery workflows. This three-stage G-quadruplex amplification protocol enables both qualitative and quantitative readouts, supporting robust decision-making at the assay development and screening inflection points. The approach enhances predictive confidence for target engagement and specificity, directly impacting portfolio triage and downstream assay readiness.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of molecular recognition events using aptamer specificity.
- Supports functional validation of target binding through visually detectable outputs.
- Facilitates rapid assessment of target engagement for mechanistic de-risking.
- Improves confidence in target selectivity by distinguishing closely related analytes.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, one-pot protocol for reproducible assay setup.
- Delivers quantitative outputs via absorbance measurement for reliable compound evaluation.
- Enables rapid screening of samples with minimal instrumentation requirements.
- Supports calibration curve-based quantification for assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Offers potential for adaptation to disease-relevant biomarkers when supported by aptamer design.
- Maintains continuity from discovery to preclinical validation through scalable detection formats.
- Reduces risk of false positives by minimizing background signal with optimized protocols.
Pipeline & Workflow Integration
This aptamer-EXPAR system fits within the early discovery to lead identification continuum, providing a bridge from molecular recognition to quantitative assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by confirming target presence and specificity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for high-throughput or resource-limited settings.
- Analytics: Enables absorbance-based measurement and standard curve generation for comparative analysis.
- Translational Research: Can be adapted for biomarker detection if aptamer specificity is established.
- Enterprise Reuse: Protocol modularity allows adaptation to new targets by substituting aptamer domains.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows with a rapid, standardized, and scalable protocol.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and capital-efficient assay development.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust, quantitative detection data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in aptamer design and nucleic acid handling.
- Needs access to basic molecular biology instrumentation and absorbance plate readers for quantification.
- Demands precise reagent handling and temperature control to minimize background signal.
- Protocol can be adapted to different targets by modifying the aptameric domain.
- Careful optimization is necessary to ensure specificity and minimize false positives.
