Gesplitste hybridisatiesonde die gebruik maakt van een DNA-fluorescerende oplichtende aptameer als signaalreporter voor sequentiespecifieke nucleïnezuuranalyse

We ontwikkelen nieuwe soorten fluorescerende hybridisatiesondes voor sequentiespecifieke nucleïnezuuranalyse. Meest recentelijk zijn hybridisatie-analysetools uitgebreid met tests die gebruik maken van CRISPR-Cas-systemen. Momenteel worden state-of-the-art hybridisatiesondes, zoals TaqMan, en moleculaire bakensondes, het meest gebruikt om nucleïnezuurdoelen te analyseren.

Nauwkeurige detectie van single-nucleotidesubstituties en nucleïnezuurdoelen is nog steeds praktisch uitdagend. Ons protocol zorgt voor het vereiste niveau van celactiviteit en zorgt voor een labelvrije uitlezing van een fluorescerend signaal. Ontwerp om te beginnen de sequenties van twee ongemodificeerde DNA-oligonucleotidestrengen die SLAS vormen.

Gebruik een fragment dat nucleotiden bevat voor 6 tot 39 van DAP-10-42. Zet stam 1 bestaande uit nucleotiden 1 tot 8 en 36 tot 42 om in stam 1 prime door een uitpuilende thymine op positie 5 te verwijderen, de stengel in te korten tot vier basenparen en een terminaal cytosine-guanine-basenpaar toe te voegen. Neem de nucleotiden 9 tot 29 op in de ene SLAS-streng en de nucleotiden 30 tot 35 in de andere.

Breid de drie priemeindige sequenties van het fragment uit met nucleotiden 9 tot 29 door deoxy GGTCAT toe te voegen. Verleng vervolgens de vijf priemeindige sequentie van het 30 tot 35 fragment met deoxy TGACC om een stam 2 van zes basenparen te vormen. Verleng nu stam 1 prime op beide strengen met deoxy TT-linkers en DNA-sequenties die complementair zijn aan het nucleïnezuurdoelwit.

Dit levert de sequenties van strengen SLAS-U en SLAS-S op die de sonde vormen. Maak SLAS-S complementair aan een gebied van 7 tot 10 nucleotides. Dat geldt ook voor de substitutieplaats van één nucleotide.

Zorg er vervolgens voor dat de doelbindingsarm van SLAS-U complementair is aan een 15 tot 25 nucleotidefragment grenzend aan het SLAS-S-gebied. Beoordeel de smelttemperaturen van de doelbindingsduplexen met behulp van de UNAFold-webserver. Klik op het tabblad INAMelt.

Ga naar Toepassingen en selecteer Smelthybridisatie in twee toestanden. Voer de op elkaar inwerkende sequenties in vijf priemgetallen tot drie priemgetallen in de linker- en rechtervakken. Stel vervolgens de analysetemperatuur in op 22 graden Celsius en voer de monovalente en tweewaardige kationenconcentraties in op respectievelijk 20 millimolaire en 25 millimolaire ionen.

Pas de concentraties van de op elkaar inwerkende sequenties in het overeenkomstige vak aan. Druk op verzenden en bekijk de Gibbs-waarden voor energieverandering, enthalpY, entropie en smelttemperatuur voor de bijbehorende duplexen. Controleer of de smelttemperaturen voor perfect op elkaar afgestemde doelen en de doelbindingsarmen van SLAS-S en SLAS-U boven de analysetemperatuur van 22 graden Celsius liggen.

Zorg ervoor dat de duplex tussen SLAS-S en een niet-overeenkomend doel smelttemperaturen oplevert die lager zijn dan de analysetemperatuur om de specificiteit te behouden. Pas indien nodig de lengtes van de doelbindingsarmen aan om aan deze voorwaarden te voldoen. Verkrijg de definitieve SLAS-U- en SLAS-S-oligonucleotidestrengen van een commerciële DNA-leverancier of synthetiseer ze intern met behulp van een geautomatiseerde DNA-synthesizer.

Bereid voorraadoplossingen van Auramine O, SLAS-S, SLAS-U en assaybuffer voor. Bereid het mastermengsel voor dat alle analysecomponenten bevat, behalve het doel. Voeg nucleasevrij water toe aan het laatste vijf tegen zesde volume van de mastermix.

Draai en draai vervolgens de mastermix. Doseer 50 microliter in elke monsterbuis. Label vervolgens één monster als een lege tekst zonder doel en één als een positieve controle.

Voeg 10 microliter doelwitbevattend monster toe aan een buisje met het mastermengsel om een monster van 60 microliter te maken. Voeg voor de blanco 10 microliter nucleasevrij water toe. Piket vervolgens 10 microliter synthetisch DNA-oligonucleotide met de doelsequentie in de positieve controlebuis.

Meng alle monsters in een centrifuge kort met behulp van een microcentrifuge. Incubeer de buisjes vervolgens 10 tot 60 minuten bij 22 graden Celsius. Meet fluorescentie bij 540 nanometer bij excitatie bij 475 nanometer met behulp van een fluorescerende spectrofotometer.

SLAS is op maat gemaakt om zich te richten op een specifiek fragment van het NANOGP8-gen. Target M was volledig complementair aan de SLAS-S-streng, terwijl target MM een cytosinenucleotidepositie 1.423 had, wat een mismatch met SLAS-S introduceerde. Na toevoeging van het volledig complementaire doel M nam de fluorescentie gestaag toe en stabiliseerde na 45 tot 50 minuten.

Een duidelijk signaal was echter binnen 10 minuten detecteerbaar met een signaal-tot-blanco verhouding van 10 SLAS vertoonde een hoog fluorescentiesignaal voor volledig overeenkomende doelen, maar niet voor niet-overeenkomende doelen of blanco's. De fluorescentie-output nam lineair toe met een doelconcentratie tot 500 nanomolair, waardoor kwantificering en bepaling van detectielimieten mogelijk was. PCR-geamplificeerde monsters vertoonden verschillende signaalniveaus, waarbij alleen monster 2 de fluorescentiedrempelwaarde van 2 overschreed.

Op basis van de kalibratiecurve werd de concentratie van NANOGP8 amplicon in monster 2 geschat op 124+of 13 nanomolair. Fluorescentiedetectie van SLAS-signaal was consistent over zowel een benchtop spectrofotometer als een draagbare fluorometer. Een signaal-tot-blanco verhouding van meer dan 20 werd ook visueel waargenomen met behulp van UV-licht.