Bepaling van in vitro en cellulaire inschakelkinetiek voor fluorogene RNA-aptameren
9 augustus 2022
Het protocol presenteert twee methoden om de kinetiek van de fluorogene RNA-aptameren Spinazie2 en Broccoli te bepalen. De eerste methode beschrijft hoe fluorogene aptamerkinetiek in vitro kan worden gemeten met een platenlezer, terwijl de tweede methode de meting van fluorogene aptamerkinetiek in cellen door flowcytometrie beschrijft.
Het bestuderen van in vitro en cellulaire fluorogene aptamerkinetiek stelt de gebruiker in staat om te evalueren of aptamerkleurstofinteracties snel genoeg zijn om een proces van interesse in realtime te bestuderen. De gepresenteerde technieken maken kwantitatieve kinetische metingen zowel binnen als buiten de cel mogelijk, die beide relevant kunnen zijn, afhankelijk van de toepassing van het aptamer. De gepresenteerde methoden kunnen worden toegepast op elk fluorogeen RNA-systeem, inclusief alternatieve aptameren en op RNA gebaseerde biosensoren voor kleine moleculen.
Om te beginnen, stel het RNA-renaturatieprogramma van de thermocycler in. Maak het programma door nieuwe programma's maken"nieuwe fase toevoegen" te selecteren en voeg meerdere keren een nieuwe stap toe om temperatuurspecifieke stappen toe te voegen voordat u op opslaan drukt"Aanvullende instellingen aanpassen aan het programma. Om spinazie twee en broccoli RNA's te renatureren, bereidt u twee micromolaire stengels van elk RNA in dubbel gedestilleerd water in een 0,5 milliliter dunwandige PCR-buis.
Voeg vervolgens gelijke volumes van twee x renaturatiebuffer toe om één micromolaire RNA-oplossing te maken. Plaats de buizen in de thermocycler. Open het opgeslagen renaturatieprogramma en druk op run"Next, set the plate-reader injector program.
Selecteer op de fluorescentieplaatlezer de temperatuur en stel deze in op 37 graden Celsius. Voordat u met de kinetiek begint, moet u ervoor zorgen dat de temperatuur in evenwicht is met deze waarde. Open de software voor de platenlezer.
Selecteer instellingen"en vervolgens acquisitieweergave" om het programma in te voeren voor kinetische metingen, selecteer lus" voor elke put. Stel vervolgens de basislijninstelling in op 60 basislijnwaarden en slimme injecteerinstellingen voor injectie van 10 microliter. Stel de fluorescentiewaarde excitatiegolflengte in op 448 nanometer, de emissiegolflengte op 506 nanometer en de cartridge op mono.
Stel de totale leestijd in op 10 minuten met een leesinterval van 0,5 seconden. Stel PMT en optiek in op zes flitsen per aflezing. Dan invoerlus naar volgende put.
Om de injector van de platenlezer voor te bereiden, selecteert u injecteren op de plaatlezer en levert u een afvalinzamelplaat wanneer deze wordt voorgeschreven. Selecteer vervolgens wassen en reinig de injectiebuis volgens de instructies op de plaatlezer met één millilitervolumes dubbel gedestilleerd water, 75% ethanol en vervolgens gedestilleerd water. Selecteer vervolgens aspirate"waardoor de injector overtollige vloeistof kan uitwerpen.
Selecteer vervolgens prime"om de injector te primen met twee 260 microliter van 100 micromolar D F H B I.To voer één kinetisch experiment uit voeg 80 microliter bindingsbuffermastermix toe aan één put van een 96 goed heldere bodemplaat. Voeg vervolgens 10 microliter gereatureerd RNA toe. Laat de plaat en D F H B I-oplossing in de injector gedurende 15 minuten in evenwicht komen tot 37 graden Celsius.
Selecteer vervolgens de put die moet worden geanalyseerd in de software-instellingen onder het leesgebied. Selecteer vervolgens onder het tabblad Home de optie uitvoeren om het eerder beschreven kinetische programma uit te voeren. Herhaal dit proces totdat alle experimenten zijn voltooid.
Was na de run de injector om de resterende D F H B I-oplossing uit de injectiebuis te verwijderen, zoals eerder aangetoond. Om de experimentele bestanden in te stellen, schakelt u de flowcytometer en computer in. Maak een nieuw bestand op het tabblad experimentverkenner door met de rechtermuisknop op de gebruikersnaam van de flowcytometer te klikken.
Selecteer vervolgens nieuw experiment"in het vervolgkeuzevenster en wanneer een nieuw venster op het computerscherm verschijnt, selecteert u experimenttype als buizen" en selecteert u vervolgens ok"Klik in het nieuwe experimentbestand met de rechtermuisknop op de groepsmap en selecteer nieuwe monsterbuis toevoegen"Label de monsterbuizen voor elk specifiek tijdstip en repliceer door met de rechtermuisknop op voorbeeld te klikken" en hernoeming te selecteren" in het vervolgkeuzemenu. Bereid vervolgens een verdunde celoplossing door 1,5 milliliter van één X P B S en drie microliter geïnduceerde cellen in AI-media in een kweekbuis toe te voegen. Voordat u kleurstof toevoegt, meet u de achtergrondfluorescentie van de cellen om te zien hoe de vouw na verloop van tijd wordt ingeschakeld.
Zodra de kleurstof is toegevoegd, plaatst u de kweekbuis met cellen in P B S in de lifter van de monsterbuis en tilt u de lifter op naar de injectienaald van het monster. Selecteer vervolgens het juiste voorbeeldbestand op het tabblad van het verzamelpaneel en klik op opnemen"Zodra de run is voltooid, verlaagt u de monsterbuisheffer met de kweekbuis met de hand. Om een spoelstap te starten, om het vloeistofsysteem te spoelen en de overdracht tussen elk biologisch replicatiemonster te minimaliseren.
Als u naar het volgende voorbeeld wilt gaan, selecteert u het volgende voorbeeldbestand door op het pijlpictogram naar rechts te klikken bij de naam van de voorbeeldbuis onder het recordpictogram. Om de fluorescentie van cellen met kleurstof te meten, voegt u 1,4 microliter geconcentreerde kleurstofvoorraad toe aan één X P B S met cellen, om een eindconcentratie van 50 micromoleriek D F H B I één T te geven.Bevestig het deksel van de kweekbuis en keer drie tot vijf keer om de oplossing gelijkmatig te mengen. Verwijder vervolgens het deksel en plaats de kweekbuis in de monsterbuisheffer.
Nadat u de houder naar de injectienaald van het monster hebt gebracht, klikt u op het recordpictogram onder het juiste monsterbestand. Begin vervolgens een timer door op start te drukken"In vitro kinetiek van fluorogene aptameren spinazie twee en broccoli, weergegeven tweefasige associatiekinetiek voor binding aan de D F H B I-kleurstof. Voor beide aptameren waren de kinetische gegevens beter geschikt door tweefasige associatie dan één fase bij lange meettijden.
De best fit curve bepaalde de snelheidsconstanten en halfwaardetijden voor de snelle en langzame associaties. Spinazie twee in de bindingscompetentietoestand, vertoonde een snellere aanzet dan broccoli. De tweede fase kinetiek voor beide aptameren is vergelijkbaar en kan overeenkomen met een gemeenschappelijke snelheidsbeperkende stap.
De kinetische krommen van aptameren zijn samengesteld uit een vergelijkbare mate van snel associërende RNA's. Voor cellen die spinazie twee T-RNA tot expressie brengen, neemt de gemiddelde fluorescentie-intensiteit of M F I onmiddellijk toe op het nultijdspunt. Bovendien bereikte cellulaire fluorescentie binnen vijf minuten zijn maximale gebalanceerde M F I-waarde.
Controlecellen vertoonden daarentegen een lage achtergrondfluorescentie en geen verandering in M F I-waarden met D M S O-toevoeging De gepresenteerde methoden stellen onderzoekers in staat om te bepalen hoe ze op RNA gebaseerde sensoren in fluorogene aptameren sneller kunnen maken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft twee methoden voor het bepalen van de kinetica van fluorescinerende RNA aptameren Spinach2 en Broccoli. De eerste methode maakt gebruik van een plate reader voor in vitro metingen, terwijl de tweede flowcytometrie gebruikt voor cellulaire metingen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Moleculair biologie
Achtergrond
- Fluorescerende RNA aptameren zijn nuttig voor real-time studies van moleculaire interacties.
- Het begrijpen van aptamerkinetica is cruciaal voor hun toepassing in verschillende biologische processen.
- De methoden kunnen worden aangepast voor verschillende RNA-systemen en biosensoren.
- Meettechnieken omvatten in vitro en cellulaire omgevingen.
Doel van de studie
- Om de kinetica van RNA-aptameren in real-time te evalueren.
- Om methodologieën te bieden die van toepassing zijn op verschillende fluorescinerende RNA-systemen.
- Om kwantitatieve metingen van aptamere interacties mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- In vitro kinetische metingen met behulp van een plate reader.
- Cellulaire kinetische metingen met behulp van flowcytometrie.
- Instellen van het RNA-renaturatieprogramma in een thermocycler.
- Bereiding van RNA-monsters in PCR-buisjes.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle meting van aptamerkinetica in vitro en in cellen.
- Aangetoond snelle aptamere-kleurstofrelaties geschikt voor real-time studies.
- Methoden toepasbaar op verschillende RNA-gebaseerde biosensoren.
- Kwantitatieve gegevens verkregen voor beide experimentele setups.
Conclusies
- De gepresenteerde methoden maken effectieve studie van RNA-aptamerkinetica mogelijk.
- Zowel in vitro als cellulaire metingen zijn haalbaar en informatief.
- Deze technieken kunnen onderzoek in RNA-gebaseerde toepassingen bevorderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative determination of fluorogenic RNA aptamer turn-on kinetics is critical for enabling real-time RNA visualization and biosensor applications in live-cell systems. Accurate kinetic profiling ensures that aptamer-dye interactions are sufficiently rapid to support dynamic studies of gene expression and metabolite signaling. This capability directly impacts the predictive confidence and translational value of RNA-based discovery tools across the biopharma pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Supports interrogation of RNA function and pathway activity in live cells.
- Enables biological de-risking by confirming aptamer responsiveness aligns with experimental timescales.
- Facilitates functional target validation for RNA-based biosensors and reporters.
Screening & Assay Development
- Provides validated kinetic parameters for assay standardization and reproducibility.
- Enables development of high-throughput screening assays for RNA-targeted compounds.
- Delivers quantitative outputs essential for reliable compound evaluation and comparison.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biosensor performance with disease-relevant cellular models for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement of RNA-based tools into preclinical workflows.
- Improves predictive de-risking by quantifying aptamer kinetics in physiologically relevant contexts.
Pipeline & Workflow Integration
These kinetic measurement methods integrate at the interface of early discovery, assay development, and translational research, providing a foundation for robust RNA-based tool deployment.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by quantifying real-time RNA dynamics.
- Screening: Establishes assay readiness and reproducibility through standardized kinetic benchmarks.
- Analytics: Supplies quantitative fluorescence readouts and kinetic rate constants for comparative analysis.
- Translational Research: Ensures biosensor kinetics are compatible with preclinical model requirements.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable workflow for diverse fluorogenic RNA systems and biosensors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RNA-targeted studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable kinetic measurement protocols.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and enhances capital efficiency in RNA tool development.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of RNA-based discovery assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling and fluorescence-based kinetic analysis.
- Depends on access to plate readers with injectors and flow cytometry instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of kinetic measurement protocols.
- Adaptable to a range of fluorogenic RNA aptamers and biosensor platforms.
- Limited by the diffusion rates and cellular uptake characteristics of specific dyes and cell types.
