Bepaling van in vitro en cellulaire inschakelkinetiek voor fluorogene RNA-aptameren

Het bestuderen van in vitro en cellulaire fluorogene aptamerkinetiek stelt de gebruiker in staat om te evalueren of aptamerkleurstofinteracties snel genoeg zijn om een proces van interesse in realtime te bestuderen. De gepresenteerde technieken maken kwantitatieve kinetische metingen zowel binnen als buiten de cel mogelijk, die beide relevant kunnen zijn, afhankelijk van de toepassing van het aptamer. De gepresenteerde methoden kunnen worden toegepast op elk fluorogeen RNA-systeem, inclusief alternatieve aptameren en op RNA gebaseerde biosensoren voor kleine moleculen.

Om te beginnen, stel het RNA-renaturatieprogramma van de thermocycler in. Maak het programma door nieuwe programma's maken"nieuwe fase toevoegen" te selecteren en voeg meerdere keren een nieuwe stap toe om temperatuurspecifieke stappen toe te voegen voordat u op opslaan drukt"Aanvullende instellingen aanpassen aan het programma. Om spinazie twee en broccoli RNA's te renatureren, bereidt u twee micromolaire stengels van elk RNA in dubbel gedestilleerd water in een 0,5 milliliter dunwandige PCR-buis.

Voeg vervolgens gelijke volumes van twee x renaturatiebuffer toe om één micromolaire RNA-oplossing te maken. Plaats de buizen in de thermocycler. Open het opgeslagen renaturatieprogramma en druk op run"Next, set the plate-reader injector program.

Selecteer op de fluorescentieplaatlezer de temperatuur en stel deze in op 37 graden Celsius. Voordat u met de kinetiek begint, moet u ervoor zorgen dat de temperatuur in evenwicht is met deze waarde. Open de software voor de platenlezer.

Selecteer instellingen"en vervolgens acquisitieweergave" om het programma in te voeren voor kinetische metingen, selecteer lus" voor elke put. Stel vervolgens de basislijninstelling in op 60 basislijnwaarden en slimme injecteerinstellingen voor injectie van 10 microliter. Stel de fluorescentiewaarde excitatiegolflengte in op 448 nanometer, de emissiegolflengte op 506 nanometer en de cartridge op mono.

Stel de totale leestijd in op 10 minuten met een leesinterval van 0,5 seconden. Stel PMT en optiek in op zes flitsen per aflezing. Dan invoerlus naar volgende put.

Om de injector van de platenlezer voor te bereiden, selecteert u injecteren op de plaatlezer en levert u een afvalinzamelplaat wanneer deze wordt voorgeschreven. Selecteer vervolgens wassen en reinig de injectiebuis volgens de instructies op de plaatlezer met één millilitervolumes dubbel gedestilleerd water, 75% ethanol en vervolgens gedestilleerd water. Selecteer vervolgens aspirate"waardoor de injector overtollige vloeistof kan uitwerpen.

Selecteer vervolgens prime"om de injector te primen met twee 260 microliter van 100 micromolar D F H B I.To voer één kinetisch experiment uit voeg 80 microliter bindingsbuffermastermix toe aan één put van een 96 goed heldere bodemplaat. Voeg vervolgens 10 microliter gereatureerd RNA toe. Laat de plaat en D F H B I-oplossing in de injector gedurende 15 minuten in evenwicht komen tot 37 graden Celsius.

Selecteer vervolgens de put die moet worden geanalyseerd in de software-instellingen onder het leesgebied. Selecteer vervolgens onder het tabblad Home de optie uitvoeren om het eerder beschreven kinetische programma uit te voeren. Herhaal dit proces totdat alle experimenten zijn voltooid.

Was na de run de injector om de resterende D F H B I-oplossing uit de injectiebuis te verwijderen, zoals eerder aangetoond. Om de experimentele bestanden in te stellen, schakelt u de flowcytometer en computer in. Maak een nieuw bestand op het tabblad experimentverkenner door met de rechtermuisknop op de gebruikersnaam van de flowcytometer te klikken.

Selecteer vervolgens nieuw experiment"in het vervolgkeuzevenster en wanneer een nieuw venster op het computerscherm verschijnt, selecteert u experimenttype als buizen" en selecteert u vervolgens ok"Klik in het nieuwe experimentbestand met de rechtermuisknop op de groepsmap en selecteer nieuwe monsterbuis toevoegen"Label de monsterbuizen voor elk specifiek tijdstip en repliceer door met de rechtermuisknop op voorbeeld te klikken" en hernoeming te selecteren" in het vervolgkeuzemenu. Bereid vervolgens een verdunde celoplossing door 1,5 milliliter van één X P B S en drie microliter geïnduceerde cellen in AI-media in een kweekbuis toe te voegen. Voordat u kleurstof toevoegt, meet u de achtergrondfluorescentie van de cellen om te zien hoe de vouw na verloop van tijd wordt ingeschakeld.

Zodra de kleurstof is toegevoegd, plaatst u de kweekbuis met cellen in P B S in de lifter van de monsterbuis en tilt u de lifter op naar de injectienaald van het monster. Selecteer vervolgens het juiste voorbeeldbestand op het tabblad van het verzamelpaneel en klik op opnemen"Zodra de run is voltooid, verlaagt u de monsterbuisheffer met de kweekbuis met de hand. Om een spoelstap te starten, om het vloeistofsysteem te spoelen en de overdracht tussen elk biologisch replicatiemonster te minimaliseren.

Als u naar het volgende voorbeeld wilt gaan, selecteert u het volgende voorbeeldbestand door op het pijlpictogram naar rechts te klikken bij de naam van de voorbeeldbuis onder het recordpictogram. Om de fluorescentie van cellen met kleurstof te meten, voegt u 1,4 microliter geconcentreerde kleurstofvoorraad toe aan één X P B S met cellen, om een eindconcentratie van 50 micromoleriek D F H B I één T te geven.Bevestig het deksel van de kweekbuis en keer drie tot vijf keer om de oplossing gelijkmatig te mengen. Verwijder vervolgens het deksel en plaats de kweekbuis in de monsterbuisheffer.

Nadat u de houder naar de injectienaald van het monster hebt gebracht, klikt u op het recordpictogram onder het juiste monsterbestand. Begin vervolgens een timer door op start te drukken"In vitro kinetiek van fluorogene aptameren spinazie twee en broccoli, weergegeven tweefasige associatiekinetiek voor binding aan de D F H B I-kleurstof. Voor beide aptameren waren de kinetische gegevens beter geschikt door tweefasige associatie dan één fase bij lange meettijden.

De best fit curve bepaalde de snelheidsconstanten en halfwaardetijden voor de snelle en langzame associaties. Spinazie twee in de bindingscompetentietoestand, vertoonde een snellere aanzet dan broccoli. De tweede fase kinetiek voor beide aptameren is vergelijkbaar en kan overeenkomen met een gemeenschappelijke snelheidsbeperkende stap.

De kinetische krommen van aptameren zijn samengesteld uit een vergelijkbare mate van snel associërende RNA's. Voor cellen die spinazie twee T-RNA tot expressie brengen, neemt de gemiddelde fluorescentie-intensiteit of M F I onmiddellijk toe op het nultijdspunt. Bovendien bereikte cellulaire fluorescentie binnen vijf minuten zijn maximale gebalanceerde M F I-waarde.

Controlecellen vertoonden daarentegen een lage achtergrondfluorescentie en geen verandering in M F I-waarden met D M S O-toevoeging De gepresenteerde methoden stellen onderzoekers in staat om te bepalen hoe ze op RNA gebaseerde sensoren in fluorogene aptameren sneller kunnen maken.