Evaluatie van de integriteit van het spindelassemblagecontrolepunt in muizenoöcyten

Aneuploïdie is de belangrijkste genetische oorzaak van een vroege miskraam bij de mens. De meeste fouten in chromosoomsegregatie treden op tijdens meiose in eicellen. Daarom is het evalueren van het controlepunt voor de spindelassemblage in eicellen van cruciaal belang om te begrijpen waarom eicellen foutgevoelig zijn.

Hier beschrijven we drie technieken om de SAC-integriteit in muizenoöcyten uitgebreid te evalueren door verschillende kritieke stappen op het checkpoint te onderzoeken met behulp van een combinatie van live beeldvorming en immunofluorescentie. Dr. Cecilia Blengini, een onderzoeksmedewerker van mijn laboratorium, demonstreert de procedure. Om te beginnen met het bereiden van een milliliter kweekmedia die nocodazol bevatten en reversine met DMSO als een controle zoals beschreven in het manuscript.

Gebruik voor de rijping van eicellen en live beeldvorming een voorverwarmde 96-well plaat in een incubator. En laad de eerste, tweede en derde put met respectievelijk 150 microliter van de controle DMSO, nocodazol en nocodazol plus reversinebehandeling. Terwijl de plaat in de couveuse wordt bewaard onder de omstandigheden zoals beschreven in het manuscript.

Om de myotische rijping te starten, verwijdert u milrinon door de eicellen achtereenvolgens over te brengen door 6 druppels van 100 microliter milrinonvrije kweekmedia die DMSO bevatten. En plaats ze in de overeenkomstige put van de 96-well plaat. Met behulp van een hand- of mondbediende pipet tijdens het bekijken van de eicellen onder een stereomicroscoop.

Breng de eicellen in beeld met behulp van een heldere veldmicroscoop uitgerust met een incubatorkamer met een gecontroleerde omgeving bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide en 80% vochtigheid. Leg beelden vast in het middelste vlak van de eicellen met intervallen van 20 minuten gedurende 24 uur. Na het kwantificeren van het aantal eicellen dat een polair lichaam extrudeert door de cellen te identificeren die door asymmetrische cytokines gaan met een kleine cel naast het ei en binnen de gedeelde zona pellucida.

Bekijk de beelden met behulp van imaging software. Micro-injectie pro-fase één arresteerde eicellen met 100 nanogram per microliter eerder bereid securin-gfp cRNA. Laat na micro-injectie de eicellen gedurende ten minste drie uur het RNA in de kooldioxide-incubator herstellen en vertalen.

Laad vervolgens 150 microliter kweekmedia met of zonder vijf micromolaire nocodazol. En 150 microliter kweekmedia met 0,5 micromolaire omkering in drie verschillende putten van een 96-well plaat. Was de micro geïnjecteerde eicellen door zes druppels milrinonvrije kweekmedia En breng een derde van de eicellen over in elke behandeling.

Houd de plaat in de couveuse op 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide en 80% vochtigheid totdat de eicellen meiose hervatten, ongeveer drie uur na het wassen van milrinon. Registreer beelden van de rijping van eicellen met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een incubatorkamer. Gebruik beeldanalysesoftware om securin-gfp-vernietiging te kwantificeren en de beelden van het GFP-kanaal te openen, beginnend bij tijd 0,1.

Gebruik in de gewenste analysesoftware het selectie- of vormgereedschap om elke eicel te markeren en een interessant gebied voor elke cel te genereren. Gebruik dezelfde interesseregio om een achtergrondgebied te selecteren dat later moet worden afgetrokken en meet de GFP-pixelintensiteit in elke interesseregio op alle tijdstippen. Als laatste trekt u bij elke GFP-waarde de meting van het interessegebied op de achtergrond af.

Na het splitsen van meiose in drie groepen, breng elke groep meiose over in 100 microliter druppels milrinonvrije kweekmedia. Bedek de druppels met minerale olie en plaats ze drie, vijf en zeven uur in de incubator om respectievelijk de vroege prometafase één, late prometafase één en metafase één fase te bereiken. Op de toegewezen tijdstippen fixeren de eicellen door ze over te brengen in 500 microliter druppels van 2% paraformaldehyde in PME-buffer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een glazen schaal met negen putten.

Breng vervolgens de cellen over naar een schone put met een druppel van 500 microliter blokkerende oplossing. Om de MAD2-detectie voort te zetten, brengt u de eicellen over naar een schone put met een druppel van 500 microliter permeabilisatieoplossing. Breng na 20 minuten incuberen bij kamertemperatuur de cellen over naar een nieuwe put van blokkerende oplossing en incubeer gedurende 10 minuten.

Breng de eicellen over in een druppel van 30 microliter blokkerende oplossing met anti-MAD2-antilichaam en anti-centromeerantilichaam en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Om overtollige primaire antilichamen te wassen na het overbrengen van de cellen naar 30 microliter druppel PME-buffer aangevuld met 0,5% Triton, incubeer gedurende 10 minuten in de bevochtigde kamer. Breng de cellen over naar een druppel van 30 microliter blokkerende oplossing met secundaire antilichamen zoals anti-human 633 en anti-konijn 568.

En incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur. Om de cellen op de microscoopglaas te monteren, brengt u de cellen over naar een druppel van 10 microliter montagemedia die DAPI bevatten. Voeg kleine puntjes vaseline toe aan elke hoek van de afdekplaat.

Plaats ze voorzichtig op de bovenste mediaval en druk langzaam om te verdelen. Sluit de afdekglijm naar de glijbaan af met heldere nagellak. Beeldkinochen met behulp van een confocale microscoop uitgerust met een 40 of 63 X objectief.

En met behulp van het anti-centromeerantilichaamsignaal het Z-bereik bepalen dat beeldvorming van het hele chromosoomgebied mogelijk maakt. De met DMSO behandelde controle-eicellen extrudeerden een polair lichaam ongeveer 14 uur na afgifte uit milrinon. Na SAC-activering werden met nocodazol behandelde eicellen gearresteerd in metafase één en extrudeerden ze geen polair lichaam.

Bij afwezigheid van SAC-activering extrudeerden eicellen echter een polair lichaam ondanks het feit dat ze geen kinetochore microtubule-aanhechtingen hadden. De snelheid van securine-gfp-afbraak tijdens myotische rijping werd geëvalueerd. Waarbij de controle DMSO behandelde eicellen securin-gfp intensiteit begint af te nemen na ongeveer 10 uur na milrinon washout.

Wanneer eicellen werden gerijpt in aanwezigheid van het SAC-activerende middel, nocodazol, waren de securine-gfp-niveaus stabiel gedurende de gehele periode van myotische rijping. Bij het voorkomen van SAC-activering met reversinebehandeling daarentegen versnelde het securin-gfp-patroon en begon de afbraak ongeveer vier uur na milrinonuitwassing consistent met SAC-remming. Confocale beeldvorming werd gebruikt om centromeren en MAD2 van eicellen gerijpt tot vroege prometafase één, late prometafase één en metafase één te detecteren.

Om de sterkte van het SAC-signaal te evalueren, werd de kinetochore gelokaliseerde, MAD2-pixelintensiteit gekwantificeerd. Significante niveaus van MAD2-rekrutering naar kinetochoren treden op in de vroege prometafase wanneer de meeste kinetochoren niet aan microtubuli waren gehecht. De niveaus van MAD2 verminderden in latere prometafase en waren bijna afwezig in metafase één wanneer alle kinetochoren stabiel aan microtubuli waren bevestigd.

Het is belangrijk om te benadrukken dat elk van deze technieken zijn beperkingen en hun interpretatie heeft. En we stellen voor om een combinatie van deze methoden uit te voeren om de SAC-integriteit te evalueren. Deze drie essays stellen onderzoekers in staat om de strengheid van de zak in eicellen te evalueren en inzicht te geven in een mogelijke oorzaak van aneuploïdie in menselijke eieren.