Bepaling van de paringsefficiëntie van haploïden in Saccharomyces cerevisiae

Dit protocol is een eenvoudige methode om de efficiëntie te kwantificeren waarmee verschillende stammen en gistsoorten met elkaar paren. De voorgestelde methode is eenvoudig, robuust en efficiënt. De methode kan worden uitgebreid tot elke giststam.

De methode die in deze studie wordt beschreven, kan worden gebruikt om te begrijpen hoe soortvorming optreedt in gist. Bovendien kunnen de stammen die we beschrijven bijzonder nuttig zijn om experimenten met genstroom te ontwerpen. De kracht van de methode is dat het heel eenvoudig is.

Enkele kleine aanpassingen zoals de incubatietijd kunnen nodig zijn, afhankelijk van de specifieke stam die wordt gebruikt. Begin met het doen herleven van de haploïden A en Alpha uit bevroren voorraden door het gistentmateriaal op een gistextract pepton dextrose of YPD-agarplaat te strepen. Laat ze 48 uur groeien bij 30 graden Celsius om enkele kolonies te verkrijgen.

Na incubatie, ent enkele kolonies van de YPD-plaat en vijf milliliter YPD-medium en incubeer bij 30 graden Celsius gedurende 48 uur met 250 RPM schudden. De cellen bevinden zich na deze incubatietijd in de stationaire groeifase. Teken op een verse YPD-plaat paringsefficiëntieraster als een rechthoek van 1 bij 1,5 centimeter, verdeeld in drie vakken, elk met een afmeting van 1 bij 0,5 centimeter.

Ent vijf microliter van de YPD-cultuur van de twee paringstypen op de meest linkse en meest rechtse rechthoeken. Dit volume komt overeen met ongeveer 5 maal 10 tot de vijfde haploïde cellen in elke sectie. Incubeer de platen gedurende 24 uur bij 30 graden Celsius.

Om een gelijk aantal gistcellen te mengen, verwijdert u ongeveer 1/3 van de gistgroei die in de buitenste dozen is ontwikkeld met behulp van een steriele tandenstoker en resuspenseert u de verwijderde cellen in 20 microliter water in een steriele injectieflacon van 1,5 milliliter. Volg dit voor elke haploïde. Verdun vervolgens vijf microliter van deze suspensie in twee milliliter water en meet de optische dichtheid met behulp van een spectrofotometer op 600 nanometer.

Voeg op basis van de optische dichtheidswaarde en het aantal cellen per milliliter bij één optische dichtheid de vereiste volumes van beide haploïden toe in een verse en steriele injectieflacon van 1,5 milliliter. Meng het goed met een pipet. Het uiteindelijke volume van deze suspensie is over het algemeen ongeveer zes tot acht microliter.

Ent vervolgens deze ophanging in het middenrooster. Incubeer de plaat zeven uur lang bij 30 graden Celsius, zodat de haploïden kunnen paren. Schraap na zeven uur incubatie de cellen uit de middelste rechthoek met behulp van een tandenstoker of een pipetpunt en verdun in twee milliliter steriel water.

Voer verdere verdunningen uit en verspreid vervolgens de celsuspensie op YPD-agar om enkele kolonies te verkrijgen. Na het plateren incuberen van de YPD-platen bij 30 graden Celsius gedurende 36 tot 48 uur om enkele kolonies te ontwikkelen. Zorg ervoor dat uit elk paringsexperiment een paar honderd individuele kolonies worden verkregen voor screening om de statistische significantie van de gegevens te garanderen.

Om de diploïde kolonies op de plaat te identificeren, brengt u de enkele kolonies over door ze afzonderlijk op een dubbele uitvalplaat te strijken, zonder de aminozuren waarvoor de stammen auxotroof zijn. Incubeer de platen bij 30 graden Celsius gedurende 48 uur en bereken de paringsefficiëntie, nu. De robuustheid van het protocol maakte een eenvoudige differentiatie van de paringsefficiëntie tussen de twee stammen, SK1AM en ScAM, mogelijk.

Terwijl de SK1-stammen gepaard gingen met een zeer hoog rendement, paren de ScAM-stammen met een relatief lagere efficiëntie. De paringsefficiëntie van de ScAM-stammen daalde aanzienlijk wanneer de omgeving geen glucose als primaire koolstofbron bevatte, wat aangeeft dat paring een energetisch duur proces is en groei op alternatieve koolstofbronnen de efficiëntie van paring kwalitatief vermindert. Wanneer het werd toegestaan om gedurende verschillende tijdsperioden te paren, werd de eerste vier tot vijf uur geen paring waargenomen.

De eerste diploïden verschenen pas na vier tot vijf uur, wat aangeeft dat dit de tijd is die nodig is om het paringsproces in de gegeven omgeving te voltooien. Daarna nam de paringsefficiëntie snel toe. Na zeven uur werden de berekeningen van de paringsefficiëntie beïnvloed door het feit dat de mitotische groei op de plaat begon.

Zorg ervoor dat een gelijk aantal van beide haploïden gemengd zijn. Afwijkingen hiervan zouden leiden tot variaties in onafhankelijke herhalingen van het protocol. Hoe genstroom aanpassing en soortvorming beïnvloedt, is een open vraag.

Omdat de auxotrofe markers naast de MAT-locus in onze stammen worden geplaatst, helpt dit deze belangrijke vraag aan te pakken.