Bepaling van de paringsefficiëntie van haploïden in Saccharomyces cerevisiae
2 december 2022
In dit werk wordt een robuuste methode beschreven voor de kwantificering van de paringsefficiëntie in de gist Saccharomyces cerevisiae . Deze methode is met name nuttig voor de kwantificering van pre-zygote barrières in soortvormingsstudies.
Dit protocol is een eenvoudige methode om de efficiëntie te kwantificeren waarmee verschillende stammen en gistsoorten met elkaar paren. De voorgestelde methode is eenvoudig, robuust en efficiënt. De methode kan worden uitgebreid tot elke giststam.
De methode die in deze studie wordt beschreven, kan worden gebruikt om te begrijpen hoe soortvorming optreedt in gist. Bovendien kunnen de stammen die we beschrijven bijzonder nuttig zijn om experimenten met genstroom te ontwerpen. De kracht van de methode is dat het heel eenvoudig is.
Enkele kleine aanpassingen zoals de incubatietijd kunnen nodig zijn, afhankelijk van de specifieke stam die wordt gebruikt. Begin met het doen herleven van de haploïden A en Alpha uit bevroren voorraden door het gistentmateriaal op een gistextract pepton dextrose of YPD-agarplaat te strepen. Laat ze 48 uur groeien bij 30 graden Celsius om enkele kolonies te verkrijgen.
Na incubatie, ent enkele kolonies van de YPD-plaat en vijf milliliter YPD-medium en incubeer bij 30 graden Celsius gedurende 48 uur met 250 RPM schudden. De cellen bevinden zich na deze incubatietijd in de stationaire groeifase. Teken op een verse YPD-plaat paringsefficiëntieraster als een rechthoek van 1 bij 1,5 centimeter, verdeeld in drie vakken, elk met een afmeting van 1 bij 0,5 centimeter.
Ent vijf microliter van de YPD-cultuur van de twee paringstypen op de meest linkse en meest rechtse rechthoeken. Dit volume komt overeen met ongeveer 5 maal 10 tot de vijfde haploïde cellen in elke sectie. Incubeer de platen gedurende 24 uur bij 30 graden Celsius.
Om een gelijk aantal gistcellen te mengen, verwijdert u ongeveer 1/3 van de gistgroei die in de buitenste dozen is ontwikkeld met behulp van een steriele tandenstoker en resuspenseert u de verwijderde cellen in 20 microliter water in een steriele injectieflacon van 1,5 milliliter. Volg dit voor elke haploïde. Verdun vervolgens vijf microliter van deze suspensie in twee milliliter water en meet de optische dichtheid met behulp van een spectrofotometer op 600 nanometer.
Voeg op basis van de optische dichtheidswaarde en het aantal cellen per milliliter bij één optische dichtheid de vereiste volumes van beide haploïden toe in een verse en steriele injectieflacon van 1,5 milliliter. Meng het goed met een pipet. Het uiteindelijke volume van deze suspensie is over het algemeen ongeveer zes tot acht microliter.
Ent vervolgens deze ophanging in het middenrooster. Incubeer de plaat zeven uur lang bij 30 graden Celsius, zodat de haploïden kunnen paren. Schraap na zeven uur incubatie de cellen uit de middelste rechthoek met behulp van een tandenstoker of een pipetpunt en verdun in twee milliliter steriel water.
Voer verdere verdunningen uit en verspreid vervolgens de celsuspensie op YPD-agar om enkele kolonies te verkrijgen. Na het plateren incuberen van de YPD-platen bij 30 graden Celsius gedurende 36 tot 48 uur om enkele kolonies te ontwikkelen. Zorg ervoor dat uit elk paringsexperiment een paar honderd individuele kolonies worden verkregen voor screening om de statistische significantie van de gegevens te garanderen.
Om de diploïde kolonies op de plaat te identificeren, brengt u de enkele kolonies over door ze afzonderlijk op een dubbele uitvalplaat te strijken, zonder de aminozuren waarvoor de stammen auxotroof zijn. Incubeer de platen bij 30 graden Celsius gedurende 48 uur en bereken de paringsefficiëntie, nu. De robuustheid van het protocol maakte een eenvoudige differentiatie van de paringsefficiëntie tussen de twee stammen, SK1AM en ScAM, mogelijk.
Terwijl de SK1-stammen gepaard gingen met een zeer hoog rendement, paren de ScAM-stammen met een relatief lagere efficiëntie. De paringsefficiëntie van de ScAM-stammen daalde aanzienlijk wanneer de omgeving geen glucose als primaire koolstofbron bevatte, wat aangeeft dat paring een energetisch duur proces is en groei op alternatieve koolstofbronnen de efficiëntie van paring kwalitatief vermindert. Wanneer het werd toegestaan om gedurende verschillende tijdsperioden te paren, werd de eerste vier tot vijf uur geen paring waargenomen.
De eerste diploïden verschenen pas na vier tot vijf uur, wat aangeeft dat dit de tijd is die nodig is om het paringsproces in de gegeven omgeving te voltooien. Daarna nam de paringsefficiëntie snel toe. Na zeven uur werden de berekeningen van de paringsefficiëntie beïnvloed door het feit dat de mitotische groei op de plaat begon.
Zorg ervoor dat een gelijk aantal van beide haploïden gemengd zijn. Afwijkingen hiervan zouden leiden tot variaties in onafhankelijke herhalingen van het protocol. Hoe genstroom aanpassing en soortvorming beïnvloedt, is een open vraag.
Omdat de auxotrofe markers naast de MAT-locus in onze stammen worden geplaatst, helpt dit deze belangrijke vraag aan te pakken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een robuuste en eenvoudige methode voor het kwantificeren van de paringsefficiëntie van verschillende stammen van de gist Saccharomyces cerevisiae, met focus op pre-zygotische barrières relevant voor soortvormingsstudies.
Belangrijke studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Paringsefficiëntie van gist
- Soortvormingsstudies
- Gengevloedexperimenten
Achtergrond
- Paringsefficiëntie is cruciaal voor het begrijpen van soortvorming bij gist.
- Het protocol maakt experimenteren met verschillende giststammen en omstandigheden mogelijk.
- Variabiliteit in paringssucces kan inzichten bieden in evolutionaire processen.
Gebruikte methoden
- Herleving van giststammen uit bevroren voorraden en groei in YPD-medium
- Kwantificering van haploïde paringsefficiëntie door middel van gecontroleerde incubaties
- Optische dichtheidsmetingen om de celconcentratie te beoordelen
Belangrijkste resultaten
- Significante verschillen in paringsefficiëntie waargenomen tussen SK1AM en ScAM stammen.
- Paringsefficiëntie neemt af bij afwezigheid van glucose, wat de metabole eisen benadrukt.
- Tijdsafhankelijke patronen van paringsefficiëntie werden gedocumenteerd, waarbij de belangrijkheid van de incubatieduur benadrukt werd.
Conclusies
- Het protocol is effectief voor het meten van paringsefficiëntie en biedt inzichten in gengevloed en aanpassing.
- De bevindingen kunnen helpen bij het beantwoorden van vragen over soortvorming en evolutionaire biologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantifying mating efficiency in Saccharomyces cerevisiae enables precise interrogation of pre-zygotic reproductive barriers, supporting mechanistic de-risking in genetic and evolutionary studies. This robust protocol provides standardized, reproducible outputs critical for early discovery and target validation in yeast-based model systems. Reliable measurement of mating efficiency informs portfolio decisions in strain engineering and gene flow experiments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of reproductive isolation and gene flow between yeast strains.
- Supports functional validation of genetic modifications impacting mating pathways.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying pre-zygotic barriers in model systems.
- Provides reproducible data for hypothesis-driven strain selection and triage.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, quantitative outputs for mating efficiency across diverse yeast backgrounds.
- Supports assay reproducibility through controlled mixing, incubation, and colony quantification.
- Enables scalable screening of genetic or environmental variables affecting mating success.
- Prepares validated biological systems for downstream genetic or phenotypic screens.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker development by quantifying functional reproductive outcomes.
- Ensures continuity from genetic discovery to preclinical validation in yeast models.
- Supports risk-adjusted advancement of engineered strains for further study.
- Provides predictive confidence for gene flow and adaptation studies relevant to evolutionary biology.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and assay development, enabling robust hypothesis testing and biological de-risking in yeast genetics workflows.
- Discovery Biology: Quantifies mating efficiency to test genetic or environmental hypotheses about reproductive barriers.
- Screening: Standardizes assay conditions for reproducible, quantitative comparison of strain performance.
- Analytics: Employs optical density and colony counts for objective, statistical measurement of mating outcomes.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical model validation in yeast-based systems.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, strain-agnostic protocol for repeated use across genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of yeast mating assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in strain engineering pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of strains and experimental conditions for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics and sterile technique for accurate execution.
- Needs access to standard microbiology instrumentation, including incubators and spectrophotometers.
- Demands cross-team standardization of incubation times, cell mixing, and colony quantification.
- Adaptable to various yeast strains with minor protocol adjustments for strain-specific growth rates.
- Dependent on auxotrophic marker availability for clear haploid/diploid distinction.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:46
Patching of Haploids in the Mating Efficiency Grids
1:55
Mixing of Haploids and Mating
2:55
Plating of Mixed Cells on YPD Agar and Screening for Diploids using Auxotrophic Markers
3:53
Results: Quantification and Dynamics of Mating Efficiency in Saccharomyces cerevisiae (Yeast)
5:03
Conclusion
