Real-Time Void Spot Assay

De methode die in dit rapport wordt beschreven, kan worden gebruikt om fysiologische en neuro-gedragsaspecten van vrijwillige mictie in gezondheids- en ziektetoestanden te begrijpen. Deze techniek stelt ons in staat om het gedrag van het muisvolume in de lichte en donkere fasen van de dag te volgen en biedt tijdelijke, ruimtelijke en volumetrische informatie over voiding-gebeurtenissen. Om een real-time void spot assay of RT-VSA-opnamekamer voor te bereiden, plaatst u een dun of dik filterpapier, afhankelijk van het tijdstip van de dag, op de bodem van de RT-VSA-opnamekooi.

Plaats bovenop het filtreerpapier een plastic iglo voor de slaapruimte;een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml voor verrijkingsdoeleinden;en een plastic schaal van 60 mm x 15 mm met twee of drie stukjes muisdroge chow;en 14 tot 16 gram water in de vorm van een gelverpakking. Zodra de opnamekamer klaar is, plaatst u de muis voorzichtig op het filterpapier. Zorg ervoor dat de overdracht van de muis van de behuizingskooi naar de opnamekooi met minimale stress plaatsvindt.

Zodra de muis zich in de opnamekooi bevindt, plaatst u het deksel en bedek u de bovenkant van het deksel met een absorberende blauwe pad om directe reflecties van omgevingslicht op het oppervlak van het plexiglas deksel te minimaliseren. Schakel de ultraviolette lichten in de onderste kamer in. Als u RT-VSA-video van de bovenste en onderste camera's wilt opnemen, gebruikt u videobewakingsopnamesoftware die is geconfigureerd om tegelijkertijd op te nemen van meerdere webcams of netwerkcamera's.

Start de opname door op Cmd R in het programmavenster te drukken. Voer video-opnamen uit met één frame per seconde. Onmiddellijk na het initiëren van de opnames, verlaat u de kamer en sluit u de deur voorzichtig.

Zorg ervoor dat de ruimte stil blijft gedurende het hele experiment. Stop de opnames door op Cmd T te drukken.Schakel de ultraviolette lichten uit. Na het stoppen van de opname genereert de software automatisch een filmbestand in m4v-indeling voor elke camera en slaat het op onder de naam van de camera in een eerder geselecteerde doelmap.

Controleer of de experimenten in de map van elke camera zijn geordend in mappen op datum. Controleer in elke datum- of experimentmap of er één m4v-bestand is en alle afzonderlijke JPEG-bestanden die overeenkomen met elk filmframe. Maak een map op het bureaublad met de naam en datum van het experiment en breng de m4v-bestanden over naar deze map.

Kopieer de filmmap naar een flashstation voor analyse op een externe computer. Open een filmbestand dat is verzameld door de onderste camera tijdens de lichte fase of de bovenste camera tijdens de donkere fase voor analyse. Nadat u de kwaliteit van de film hebt beoordeeld, analyseert u experimenten door naar het juiste tijdvenster te gaan met de opdracht vooruitspoelen of de schuifregelaar voor de tijdbalk.

Leegmakende activiteit tijdens de lichtfase wordt geregistreerd tussen 11:00 en 17:00 uur en tijdens de donkere fase, tussen middernacht en 06:00 uur. Speel de film af in de fast forward-modus door op het fast forward-pictogram te klikken of blader handmatig door de film, op zoek naar bewijs dat de muis leegloopt. Let op het plotseling verschijnen van heldere urinevlekken op het filterpapier of de gedragsveranderingen, waaronder beweging naar de hoeken van de kooi en een korte periode van inactiviteit wanneer de muis leegloopt. Registreer het tijdstip waarop elke leegte optreedt.

Als conventie wordt de tijd van de leegte geregistreerd bij het eerste teken dat de urine wordt gedetecteerd. Om de leegte te meten, gebruikt u eerst de schuifbalk om vooruit of achteruit in de tijd te gaan, op zoek naar het punt waarop maximale diffusie van de urinevlek heeft plaatsgevonden. Pauzeer de film op dit punt en plaats de pijl van de computermuis op de plek die wordt geanalyseerd om de interessante plek in de schermafbeelding te markeren.

Geef het screenshotbestand een naam met behulp van correlatieve getallen om rekening te houden met de volgorde van verschijning in de film. Zodra alle lege plekken zijn geanalyseerd, meet u de totale oppervlakte van het filterpapier door een screenshot te maken en de rand van het filterpapier af te bakenen. Bereken het percentage oppervlakte van elk van de urinevlekken.

Transformeer de waarden van het procentuele gebied in het volume urine voor elke lege plek met behulp van de kalibratiecurven en de interpolatiefunctie in de grafische software. Het ledigingsgedrag van vrouwelijke en mannelijke Piezo1, 2, knock-out en controlemuizen werd geregistreerd tijdens de donkere en lichte fase van de dag. Tijdens hun inactieve lichtfase werden geen significante verschillen waargenomen in parameters die werden geanalyseerd voor vrouwelijke of mannelijke knock-outmuizen in vergelijking met de controle.

In de actieve donkere fase vertoonden vrouwelijke en mannelijke knock-outmuizen echter een veranderd voiding-fenotype, gekenmerkt door een significante toename van het aantal en het totale volume van kleine lege plekken. Er waren geen significante verschillen in primaire holteplekken of PVS-aantal, gemiddeld volume per PVS of totaal PVS-volume bij vrouwelijke of mannelijke knock-outmuizen in vergelijking met de controlemuizen. Het ledigingsgedrag van vrouwelijke muizen werd getest onder basale omstandigheden en na behandeling met cyclofosfamide.

In vergelijking met de basale omstandigheden is de hoeveelheid urineafgifte per leegte kleiner na behandeling met cyclofosfamide en komen de mictiegebeurtenissen veel vaker voor. Een belangrijk aspect voor de reproduceerbaarheid van de test is om de dieren zo voorzichtig mogelijk te manipuleren en ze gedurende de hele testperiode onder minimale stress te houden. Omdat dit een niet-invasieve test is, kunnen daarna aanvullende procedures worden uitgevoerd, waaronder cytometrie en elektromyografie om respectievelijk blaas- en externe urethrasfincterfuncties te beoordelen.

Door deze techniek te implementeren, kunnen onderzoekers de bijdrage van specifieke paden aan het ledigingsgedrag in gezondheids- en ziektetoestanden definiëren.