Concanavaline A-gebaseerde sedimentatietest om substraatbinding van glucaanfosfatasen te meten

Deze concanavaline A-gebaseerde in vitro sedimentatietest is ontworpen om de bindingsaffiniteit van glucaanfosfatasen tegen verschillende STA-substraten te meten. De informatie die we met deze methode verkrijgen, is fundamenteel voor ons begrip van de glucaanfosfatasefamilie van enzymen. Koolhydraateiwitinteracties zijn relatief zwak, daarom kunnen de huidige methoden geen glucaanfosfatase- en glucaaninteracties detecteren.

Onze op lectine gebaseerde cosedimentatietest kan bindingsaffiniteit in het millimolaire bereik detecteren. De karakterisering van SEX4-mutanten en andere leden van de glucaanfosfatasefamilie van enzymen toont het vermogen van deze test om eiwitkoolhydraatinteracties te kwantificeren. Een van de meest uitdagende onderdelen van de test is het optimaliseren van het concentratiebereik van het substraat.

We raden aan om te beginnen met een breder bereik om een idee te krijgen en vervolgens te beperken voor een specifiek bereik. Om te beginnen, pipet 250 microliter ConA-sepharose kralen suspensie in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Centrifugeer de inhoud op 10.000 G gedurende 30 seconden bij vier graden Celsius.

Voeg na het weggooien van het supernatant 750 microliter van de bindbuffer toe aan elke buis met 250 microliter ConA-sepharosekorrels. Centrifugeer de buizen op 10.000 G gedurende één minuut bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant. Bereid vervolgens tweevoudige verdunningen van de opgeloste amylopectine-oplossing om een reeks van twee milliliter verdunde amylopectine-oplossingen te maken.

Om de ConA-sepharose amylopectine-kralen te bereiden, voegt u 250 microliter van elke verdunde amylopectine-oplossing toe aan de buizen met 250 microliter ConA-sepharosekralen die vooraf zijn gebalanceerd en binden. Meng de inhoud goed en label de buisjes met de bijbehorende amylopectineconcentratie. Incubeer de buisinhoud op een roterend wiel bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten en centrifugeer de buizen gedurende één minuut op 10.000 G.

Meng 250 microliter ConA-sepharose amylopectine kralen met 100 microliter van de bindingsbuffer met 10 microgram zetmeel overmaat vier, of SEX4 eiwit, 10 millimolar van dithiothreitol, en 10 micromolar van protease inhibitor cocktail. Incubeer de inhoud bij vier graden Celsius gedurende 45 minuten met zachte rotatie. Centrifugeer vervolgens de buizen gedurende één minuut op 10.000 G en pipetteer voorzichtig 50 microliter van het supernatant in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.

Voeg 20 microliter 4X SDS-paginakleurstof en 10 microliter gedestilleerd water toe aan elke buis met 50 microliter van de verzamelde bovennatantfracties en label ze als S.Voeg op dezelfde manier 20 microliter 4X SDS-paginakleurstof en 80 microliter gedestilleerd water toe aan de buizen met gewassen ConA-sepharose amylopectine SEX4-kralen. Na het toevoegen van kleurstof en water, verwarm alle monsters op 95 graden Celsius gedurende 10 minuten. Zodra de ConA-sepharose amylopectine SEX4-kralen gedurende één minuut bij 10.000 G zijn gecentrifugeerd, slaat u het supernatant op en labelt u het als P.Load 40 microliter van de ongebonden eiwitmonsters gelabeld als S in 4 tot 12% prefab polyacrylamidegelputten van de laagste substraatconcentratie tot de hoogste, waarbij de eerste rijstrook wordt gereserveerd voor een eiwitmoleculaire gewichtsmarker.

Gebruik een tweede gel om de glucaan gebonden eiwitmonsters met het label P. Voeg vers voorbereide SDS-paginaloopbuffer toe aan beide kamers van het apparaat en laat de gel gedurende 35 minuten op 150 volt lopen of totdat de kleurstofvoorkant de bodem van de gel bereikt. Neem vervolgens de gelcassette uit het apparaat en verwijder de afstandhouders en glasplaten om de gel te scheiden voor western blot-analyse. Maak een liter transferbuffer met 5,8 gram trisbase, 2,9 gram glycine, 0,37 gram SDS en 200 milliliter methanol.

Om de grootte gescheiden eiwitten van de polyacrylamidegel over te brengen naar een nitrocellulosemembraan, monteert u de sponzen, filterpapieren, gel en nitrocellulosemembraan volgens het westerse overdrachtsprotocol en draait u gedurende een uur op 70 volt. Na het uitvoeren van de gel, incubeer het nitrocellulosemembraan in een eiwitoplossing van 1 tot 5% runderserumalbumine of melkeiwit in 50 milliliter TBST-buffer gedurende één uur om niet-specifieke eiwitbinding te voorkomen. Was het membraan drie keer met behulp van TBST-buffer om eventuele niet-gebonden blokkerende oplossing te verwijderen.

Incubeer vervolgens het membraan gedurende een uur met het verdunde mierikswortelperoxidase gekoppelde antilichaam dat specifiek is voor histidine gelabeld eiwit. Was vervolgens het membraan drie keer in TBST-buffer om eventuele ongebonden antilichamen te verwijderen. Maak voor digitale beeldvorming een oplossing van gelijke delen chemiluminescente substraatoplossingen, elk 750 microliter in een buis van 1,5 milliliter, en incuber het membraan gedurende ten minste vijf minuten in de oplossing.

Plaats het membraaneiwit met de zijkant naar beneden op de vlekscanner en voer de acquisitiesoftware uit om het eiwit in zowel de pellet- als de bovennatuurlijke fractie te kwantificeren. Om de gegevens te verkrijgen, start u de kwantitatieve signaalmetingen met behulp van de acquisitiesoftware met de blotscanner. Normaliseer alle kwantitatieve metingen in de supernatant- en pelletfracties tot het totale eiwit dat geladen is.

In het verzadigingsbindingsexperiment wordt het percentage eiwitgebonden versus amylopectineconcentratie uitgezet en passen de gegevens toe met behulp van data-analysesoftware om de dissociatieconstante, Kd, te berekenen.De bindingscapaciteit van SEX4 aan ConA-sepharose amylopectine-kralen werd geanalyseerd met behulp van de SDS-pagina. De aanwezigheid van SEX4-eiwit in de pelletfractie en runderserumalbumine in de bovennatuurfractie werd opgemerkt. W278A, een bekende SEX4-mutant met een significant verminderd glucaanbindingsvermogen, verscheen in de bovennatuurlijke fractie, wat het nut en de specificiteit van deze test aangeeft.

Western blotting-analyse onthulde een significante toename in de detectie van SEX4 en de methode is specifiek voor het detecteren van glucaanfosfaten met een eindterminale histidine-tag. De cosedimentatietest werd getest bij drie verschillende SEX4-concentraties. Hoewel twee microgram SEX4 voldoende is om te visualiseren door middel van chemiluminescentiedetectie, zorgt het gebruik van vijf of 10 microgram SEX4 voor een nauwkeurigere detectie.

Ook werd een verhoogde SEX4-binding met een verhoogde amylopectineconcentratie waargenomen. De bindingsaffiniteit van amylopectine en SEX4 wild type eiwit bij verschillende concentraties werd bepaald en de procentuele eiwitgebonden gegevens aan het specifieke one site binding model gaven een Kd van ongeveer 1,03 milligram per milliliter. De toepasbaarheid van deze methode voor het meten van de binding van laforine, LSF2, maïs SEX4 en aardappel SEX4 tegen aardappelamylopectine werd beoordeeld.

De resultaten toonden aan dat de geteste eiwitten uit agronomisch belangrijke gewassen ook differentieel gebonden zijn aan amylopectine. Het is cruciaal om de normalisatie van alle kwantitatieve metingen in de pellet- en bovennatuurlijke fracties tot de totale eiwitbelasting te onthouden. Om ervoor te zorgen dat alle amylopectine aan de kralen is gebonden, slaat u de bovennatuurlijke fracties op om de diepe glucosetest later uit te voeren.

Glucaanfosfatase wordt gebruikt verschillende mechanismen om koolhydraten te binden, lokaliseren en defosforyleren. Deze methode maakt het mogelijk om de binding van glucaanfosfatase aan verschillende structurele domeinen binnen grote polymere complexen te onderzoeken voor positiespecifieke defosforylering.