Expressie van recombinant Cellulase Cel5A uit Trichoderma reesei In tabaksplanten

Het algemene doel van het volgende experiment is om doelwitteiwitten tijdelijk in tabak tot expressie te brengen om een idee te krijgen over de haalbaarheid van op planten gebaseerde enzymexpressie in een korte tijdsspanne. Deze tijdelijke expressie wordt bereikt door tabakbladeren te infiltreren met een stam van agrobacterium tumor fain, die een vector bevat die het gen van belang als tweede stap bevat. Na incubatie worden de geïnfiltreerde plantenbladeren geoogst en worden eiwitextracten gedeeltelijk gezuiverd om een werkbare enzymoplossing te verkrijgen. Vervolgens wordt eiwitanalyse uitgevoerd om de effecten van op planten gebaseerde expressie op het enzym te beoordelen en om de enzymatische activiteit te verifiëren.

Resultaten worden verkregen die eiwitgrootte, mogelijke glycosyleringseffecten en enzymatische activiteit laten zien op basis van western blotting, zy en substraatdegradatietests. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over omzetting van plantenbiomassa en kan ook inzicht geven in de activiteit van enzymen nadat ze tijdelijk in tabak zijn geëxpresseerd. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de infiltratiestappen moeilijk te leren zijn vanwege het feit dat de bladeren gemakkelijk beschadigd kunnen raken door de spuit. Ik zal de experimenten uitvoeren onder steriele omstandigheden.

Breng enkele kolonies van agrobacterium over naar een erlenmeyer kolf met 10 milliliter. Gistextractbouillon met antibiotica. Bewaar de geïncubeerde bouillon vervolgens gedurende 36 tot 40 uur bij 26 graden Celsius met 180 RPM schuddend en incubeer vervolgens 200 microliter van elke cultuur in 20 milliliter gistextractbouillon met dezelfde antibiotica als voorheen en incubeer onder dezelfde omstandigheden na 36 tot 40 uur.

Induceer de culturen met twee microliter acetofenon, 100 microliter 40% glucoseoplossing en 200 microliter een molaire MES-buffer bij een pH van 5,6 en zet de incubatie voort overnacht. Neem nu de planten uit de kas en gebruik een pipettip om de AB axiale zijde van het derde tot vijfde blad vanaf de top van de plant te knippen om de infiltratie te vergemakkelijken. Vul vervolgens een spuit met infiltratiemedium en plaats deze op een van de eerder gemaakte sneden.

Steun de spuit met een vinger aan de axiologische bladzijde en injecteer het medium voorzichtig in de intraveneuze bladzone. Om de fluorescentie in de bladsecties die TR cel 5:00 AM kersenschijn tot expressie brengen, te visualiseren, belicht u de planten met een draagbare lichtbron die groen licht uitzendt. Wanneer bekeken door een rood filter, zal de fluorescentie van TR cel 5:00 AM kersen duidelijk zichtbaar zijn.

Om de tot expressie gebrachte eiwitten te extraheren, selecteert u tabaksbladeren die zijn geïnfiltreerd met AUM die P track ERTR cel vijf A bevat en snijd ze in stukken van één gram. Plaats ze vervolgens in een voorgekoelde vijzel en voeg een geschikte hoeveelheid vloeibare stikstof toe aan de monsters. Maal de bladeren tot poeder met behulp van een stamper.

Herhaal het proces met niet-geïnfiltreerde tabaksbladeren om controlemonsters te verkrijgen. Voeg vervolgens twee milliliter PBS toe dat een millimolair fenylmethylsulvenfluoride bevat aan het gemalen bladmateriaal en meng tot het grootste deel van het bladmateriaal in suspensie is. Centrifugeer het extract gedurende 20 minuten bij 15.000 GS bij vier graden Celsius.

Vervolgens gooit u de pellet weg, gedeeltelijk gezuiverd TR cel vijf A door de eiwitbevattende S natin gedurende 10 minuten bij 55 graden Celsius te incuberen en het vervolgens 10 minuten op kamertemperatuur te laten rusten. Centrifugeer vervolgens een SNAT gedurende 10 minuten bij 15.000 GS bij kamertemperatuur. Gooi de pellet weg en gebruik de eiwitbevattende snat voor alle.

Verdere tests. Voer ook het gedeeltelijke zuiveringsproces uit voor niet-geïnfiltreerde planten om controlemonsters te verkrijgen. Meng in deze procedure ethylcellulose en water om een oplossing van 1,5% te verkrijgen en incubeer met roeren totdat het is opgelost.

Om een A-C-M-C-S-D-S-paginagel te maken, vervangt u één milliliter van 1,5%CMC voor één milliliter water in een 10 milliliter SDS-paginagelmixoplossing en giet de gel normaal. Denatureer vervolgens de monsters door ze te koken in aanwezigheid van SDS. Voer de elektroforese uit bij 200 volt gedurende 50 minuten totdat de kleurstoffront de onderkant van de gel bereikt. Voer nu eiwit hervouwing in de gel uit op het punt van 15%C-M-C-S-D-S paginagel.

Gebruik 1,5% beta cyclodextrine in 20 millimolair fosfaatcitroenzuurbuffer bij een pH van 6,5. Incubeer de gel in deze oplossing bij kamertemperatuur met zacht schudden gedurende 15 minuten. Gooi de beta cyclodextrineoplossing weg en spoel de gel kort af met water, ingecubeerd bij kamertemperatuur in 50 millimolair natriumacetaatbuffer bij een pH van 4,8 gedurende nog eens 15 minuten.

Voer vervolgens CMC zy uit met behulp van de hervouwde punt 15%C-M-C-S-D-S paginagel door de gel gedurende 20 minuten bij 50 graden Celsius in 30 millimolair natriumacetaatbuffer te incuberen. Om te visualiseren waar de CMC is gedegradeerd, kleurt u de gel gedurende 10 minuten met een 0,1% Congoroodoplossing en kleurt u deze vervolgens met een molair natriumchloride gedurende 30 minuten of totdat heldere banden worden waargenomen aan het einde, wast u de gel met 0,3% azijnzuur. Voor duidelijker beeldvorming, bereidt u onmiddellijk voorafgaand aan het uitvoeren van de test een vier MUC twee X werkoplossing voor en pipet 100 microliter van de vier MUC werkoplossing in afzonderlijke putjes van een 96-well plate.

Voeg vervolgens 100 microliter van elk monster toe aan de juiste putjes en voer elk monster uit in drievoudige uitvoering met een excitatiegolflengte van 360 nanometer en een emissiegolflengte van 465 nanometer. Bepaal het nulminuut tijdstip van