Name: Expressie van recombinant Cellulase Cel5A uit Trichoderma reesei In tabaksplanten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Leer de transientie-expressie van cellulase TrCel5A in tabaksplanten voor plantaardige enzymproductie. Deze methode toont de haalbaarheid van snelle eiwitexpressie en enzymkarakterisatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door het BMBF Forschungsinitiative &quot;BioEnergie 2021 - Forschung für die Nutzung von Biomasse&quot; en de Cluster of Excellence &#39;op maat uit biomassa &quot;, dat wordt gefinancierd door de Excellence initiatief van de Duitse federale en deelstaatregeringen om de wetenschap te bevorderen en onderzoek aan Duitse universiteiten.

1. Groei van Wild Type N. tabacum Planten <ol><li> N. groeien tabacum L. cv. Petit Havana SR1 planten op de bodem, plaatst tabak zaden op de juiste potten gevuld met normale potgrond voor kieming. Na 2 weken overdragen zaailingen individuele potten. Incubeer planten in een kas met een constante 22 ° C (donkere periode) of 25 ° C (licht periode) en 70% relatieve luchtvochtigheid. Zorg voor verlichting in een 16/8 uur licht / donker-cyclus (bv. Philips IP65 400 W lampen, 180 micromol · sec -1 · m -2; λ = 400-700 nm) en water dagelijks. </li></ol> 2. Transient Expressie van TrCel5A en TrCel5A-mCherry Eiwitten <ol><li> Onder steriele omstandigheden, pick enkele kolonies van Agarobacterium tumefaciens (GV3101 :: pMP90RK gmr, KmR, RifR) die ofwel pTRAkc-ER-TrCel5A of pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry en transfer naar een erlenmeyer met 10 ml gistextractbouillon (YEB, bereid volgens specificaties van de fabrikant) medium en kanamycine (50 mg / ml), rifampicine (50 mg / ml) en carbenicilline (100 mg / ml) voor selectie. Incubeer 36-40 uur bij 26 ° C en 180 rpm. Opmerking: Het ontwerpen van passende constructies voor eiwitexpressie is buiten het bestek van dit artikel, maar voor begeleiding kunnen de werkwijzen van Maclean et al. 13 en Munro en Pellham 14 worden gevolgd voor construct ontwerp.. </li><li> Neem 200 pi van elke cultuur 20 ml YEB inoculeren met antibioticum concentraties bovengenoemde en incuberen onder dezelfde omstandigheden als hiervoor. </li><li> Na 36-40 uur, preinduce de kweken door toevoegen van 2 pl acetosyringon (200 uM eindconcentratie), 100 pl 40% (w / v) glucoseoplossing en 200 gl 1 M MES-buffer pH 5,6. Incubeer overnacht. </li><li> Bereid 100 ml 2x infiltratie buffer (100 g / L sucrose, 3,6 g / L glucose, 8,6 g / l Murashige en Skoog basale zouten, Breng de pH op 5,6 met behulp van kaliumhydroxide). </li><li> Meet OD 600 van de kweken met 1:05 verdunningen tot deze een OD600 van 5-6 bereikt. Bereken cultuur benodigde volume 30 ml infiltratie medium bij OD 600. Voeg 15 ml 2x infiltratie buffer, voeg dan gedemineraliseerd H 2 O om de buffer te maken tot 30 ml. </li><li> Neem planten uit de kas en gebruik een pipet tip om nick de abaxiale kant van de 3e tot 5e blad van de top naar infiltratie verlichten. </li><li> Gebruik een pipet tip om nick de abaxiale kant van de bladeren om infiltratie te verlichten. </li><li> Vul een spuit met infiltratie medium en zet het (zonder naald) op een van de eerder gemaakte nicks. Ondersteunen spuit met een vinger op de adaxiale blad zijde. Druk het medium voorzichtig in het weefsel van Intraveneuze blad zones. Opmerking: Na infiltratie cultiveren planten in een kas onder dezelfde omstandigheden als hierboven beschreven. Ook, maar ook een gelijk aandeel van untrat &#39;s avonds, niet-transiënte expressie planten (NTEPs) als controles, onder dezelfde voorwaarden als geïnfiltreerd planten. </li></ol> 3. Beoordeling van TrCel5A-mCherry Expressie in Plant Leaves <ol><li> Na 4-6 dagen, nemen planten geïnfiltreerd met A. tumefaciens met pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry uit de kas en leg ze in een donkere kamer voor fluorescentie analyse. </li><li> Om de fluorescentie te visualiseren in blad secties uitdrukken TrCel5A-mCherry, licht planten met behulp van een draagbare lichtbron emitting groen licht bij 515 nm met een rode filter (620-750 nm). Opmerking: In diepte karakterisering van eiwit expressie in de plant bladeren kunnen worden bereikt door dunne-snijden bladeren met een vibratoom en onderzoek onder licht en fluorescentie microscopie. Hiervoor volgt u de onderstaande stappen: <ol><li> Snijd kleine secties van ongeveer 5 x 5 mm grootte van een geïnfiltreerd blad en insluiten in 4% agarose opgelost in 50 mM fosfaatbuffer (pH 5,7). </li><li> Gesnedensectie van 80-90 micrometer grootte van ingesloten bladeren met behulp van een vibratome. Leg ze op een microscoop dia, dek af met buffer of een dekglas en onderzoekt ze met behulp van een microscoop bij een vergroting van 10x met een fluorescentie detector, met dezelfde golflengte en filter hierboven vermeld. </li></ol></li></ol> 4. TrCel5A Winning Tabaksbladeren <ol><li> Snijd stukken uit tabaksbladeren tot een gewicht van 1 g bij benadering uit planten geïnfecteerd met A. tumefaciens met pTRAkc-ER-TrCel5A en plaats in een mortier voorgekoeld met vloeibare stikstof. Voeg een geschikte hoeveelheid vloeibare stikstof aan de monsters. Grind laat tot poeder met behulp van een voorgekoeld stamper. </li><li> Voeg 2 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride de grond bladkwestie en meng tot het meeste blad materie in suspensie. Centrifugeer extract bij 15.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C en te-eiwit bevattende supernatant. </li><li> Centrifuge het extract bij 15.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C en te-eiwit bevattende supernatant voorzichtig de pellet te verstoren. Gooi de pellet. </li><li> Gedeeltelijk zuiveren TrCel5A door het incuberen van het eiwit bevattende supernatant bij 55 ° C gedurende 10 minuten. Laat rusten bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Herhaal gedeeltelijke zuivering van niet-geïnfiltreerde planten controlemonsters verkrijgen. Gebruik deze monsters voor alle volgende experimenten. Opmerking: Eiwit oplossingen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 1 week bij -20 ° C maximaal 3 maanden. </li><li> Herhaal de gedeeltelijke zuivering van niet-geïnfiltreerde planten controlemonsters verkrijgen. Gebruik deze monsters voor alle volgende experimenten. Opmerking: Eiwit oplossingen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 1 week bij -20 ° C maximaal 3 maanden. </li></ol> 5. SDS-PAGE, Western blotting, en Azo-CMC zymografie van TrCel5A-mCherry &lt;/ P&gt; <ol><li> Aankoop of bereid 12% (w / v) SDS-PAGE gels volgens gevestigde methoden 15. </li><li> CMC oplossen in water tot een 1,5% (w / v) oplossing. CMC-SDS-PAGE gels maken, vervangen 1 ml 1,5% CMC 1 ml water in 10 ml SDS-PAGE-gel mix oplossing, resulterend in een 0,1% (w / v) CMC + 12% (w / v ) SDS-PAGE gel mix. Giet gel normaal. Opmerking: Zorg ervoor dat de CMC in de oorspronkelijke oplossing volledig is opgelost door een combinatie van roeren en verwarmen tot 40 ° C (herhalen direct voorafgaand aan de voorbereiding van de gel-oplossing). </li><li> Denatureren monsters door koken in de aanwezigheid van SDS, volgens vastgestelde methoden 12. Als een positieve controle, gebruikt een 1:500 verdunning van een in de handel verkrijgbaar mengsel van cellulase T. reesei, zoals T. reesei ATCC 26921. Als negatieve controle gebruikt een vergelijkbare wijze bereid eiwitoplossing van niet-geïnfiltreerde bladeren (NTEPs). </li><li> Voer de elektroforese als per normale protocollen 15,bijvoorbeeld gebruiken 200 V ~ 50 min met de elektroforese gestopt wanneer de kleurstof voorkant tot de onderkant van de gel. </li><li> Vlekken op een SDS-PAGE-gel met 0,1% (w / v) Coomassie brilliant blauw en destain met methanol / ijsazijn. Opmerking: Snelle kleuren en ontkleuren kan worden uitgevoerd door voorzichtige verwarming kleuring en ontkleuren oplossingen, dat wil zeggen met een magnetron ~ 15 seconden eerst warm (maar niet koken) kleuring en het ontkleuren oplossingen, veranderen de ontkleuroplossing na 10 min , of wanneer gekoeld, en herhaal met nieuwe ontkleuroplossing. </li><li> Voer Western blot van een SDS-PAGE gel met vastgestelde protocollen 16,17. Gebruik de volgende antilichamen: een polyklonaal konijn antilichaam tegen een His-tag (primair) en een polyklonaal geit anti-konijn antilichaam Fc-gebied dat is geconjugeerd aan een alkalische fosfatase (secundaire). Opmerking: secondaire antilichamen worden gekozen visualisatie mogelijk gebruik nitroblue tetrazoolium chloride/5-bromo-4-chloro-3 &#39;-indolyphosphate p-toluidine zout (NBT / BCIP), zoals beschreven 18. </li><li> Voer in-gel proteïne hervouwing van 0,15% (w / v) CMC SDS-PAGE-gel door het incuberen van de gel in 1,5% (w / v) β-cyclodextrine, 20 mM fosfaat-citraatbuffer, pH 6,5, bij kamertemperatuur zacht schudden gedurende 15 minuten 19. </li><li> Gooi de β-cyclodextrine oplossing Spoel even de gel met H2O Incubeer bij kamertemperatuur in 50 mM natriumacetaatbuffer (pH 4,8) gedurende een verdere 15 minuten. Voer CMC zymografie met het hervouwen 0,15% CMC SDS-PAGE-gel door het incuberen van de gel in 30 mM natriumacetaat buffer pH 4,8 gedurende 20 minuten bij 50 ° C. </li><li> Voer CMC zymografie met het hervouwen 0,15% (w / v) CMC SDS-PAGE-gel door het incuberen van de gel in 30 mM natriumacetaatbuffer (pH 4,8) gedurende 20 min bij 50 ° C. </li><li> Vlekken op de gel gedurende 10 minuten met een 0,1% gew / vol oplossing Congo rood en destain gedurende 30 minuten of totdat duidelijke banden worden waargenomen met behulp van 1 M NaCl. Was de gel met 0,3% (v / v) azijnzuur duidelijkere beeldvorming. </li></ol> 6. 4-MUC activiteit Assay van TrCel5A <ol><li> Bereid een voorraad oplossing van 10 mM 4-MUC in 50% (v / v) methanol, en bewaar deze in het donker bij kamertemperatuur </li><li> Onmiddellijk voorafgaand aan de test, bereiden een 4-MUC 2x werkende oplossing, bestaande uit 1 mm 4-MUC en 60 mM natriumacetaat, pH 4,8. </li><li> Voer deze test monsters die 100 gl blad eiwit (met of zonder TrCel5A induceerbaar expressie), 100 pi van een commercieel verkrijgbaar mengsel van cellulase T. reesei 1:1000 en zuivere H2O respectievelijk. Run elk monster in drievoud. </li><li> Pipetteer 100 ul van de 4-MUC werkoplossing in afzonderlijke putjes van een 96-well plaat, voeg 100 ul van elk monster. </li><li> Bepaal 0 min tijdpunt van 4-MU fluorescentie door fluorescentie spectroscopie, met een excitatiegolflengte van 360 nm en een emissiegolflengte van 465 nm. </li><li> Incubeer de platen gedurende 20min bij 50 ° C, bedekt met lijm deksels om verdamping te voorkomen. Stop de reactie door bevriezing (of door combinatie van 100 pi 0,15 M glycine, pH 10,0, en 100 gl monster in een afzonderlijke plaat). </li><li> Bepaal het eindpunt van 4-MU fluorescentie door fluorescentie spectroscopie, met een excitatiegolflengte van 360 nm en een emissiegolflengte van 465 nm. Trek 0 min van eindpunt (20 min) tijdpunt de verandering in fluorescentie waarden te komen. </li></ol> 7. Azo-carboxymethylcellulose activiteit Assay van TrCel5A <ol><li> Bereid een voorraad van 1,5% (w / v) Azo-CMC wordt opgeslagen bij kamertemperatuur en een neerslag oplossing die 18 mM zinkacetaat, 0,5 M natriumacetaat, pH 5 en 80% ethanol (v / v), opslag bij kamertempera temperatuur. </li><li> Vlak voor de test bereidt een Azo-CMC 2x werkoplossing, bestaande uit 1% (w / v) Azo-CMC (in H2O) en 60 mM natriumacetaat, pH 4,8. </li><li> Combineer 50 pi monster en 50 ul van de werking oplossing in 1,5 ml buizen. </li><li> Testmonsters die 50 ul blad eiwit (met of zonder TrCel5A tijdelijk tot expressie); 100 pi van een commercieel verkrijgbaar mengsel van cellulase T. reesei verdund 1:1000; en zuiver H2O Run monsters en standaarden in drievoud. </li><li> Incubeer monsters gedurende 20 minuten bij 50 ° C. Stop de reactie door toevoeging van 250 ul van neerslag oplossing. Vortex elk monster krachtig gedurende 10 seconden te waarborgen oplossingen werden volledig gecombineerd. </li><li> Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en daarna weer vortex. Centrifugeer monsters bij 1000 xg gedurende 10 minuten. Verwijder 200 pi van elk monster supernatant van een 96-well plaat, verzorgen de pellet te verstoren. </li><li> Assay middels absorptie spectroscopie bij een golflengte van 590 nm. </li></ol> 8. PAHBAH Assay van TrCel5A <ol><li> Gebruik een hole-punch om een ​​cirkel (~ 5,5 mm diameter) van de filter papier te snijden. Voeg 100 ul 60 mM NaAc, pH 4,8, en 100 pl monsters, hetzij met blad eiwit (met of zonder TrCel5A induceerbaar expressie) of een commercieel T. reesei cellulase mengsel verdund 1:1000 en incubeer met filtreerpapier cirkels gedurende 20 uur bij 50 ° C met 300 rpm schudden. Voor elk monster geïncubeerd met filterpapier, ook uitbroeden een duplicaat oplossing zonder papieren filter als individuele steekproef-controles. </li><li> Bereid een 330 mM p-hydroxybenzoëzuur hydrazide (PAHBAH) oplossing A door oplossen PAHBAH in H2O onder toevoeging van 5 ml geconcentreerd HCl gedurende een totaal van 100 ml oplossing, en bewaar bij kamertemperatuur. Opmerking: De beste resultaten worden bereikt door het toevoegen van de HCl tot een kleiner volume PAHBAH suspensie, namelijk 30 ml, die is geroerd onder temperatuur oplossen helpen alvorens het volume op 100 ml met H2O </li><li> Bereid PAHBAH oplossing B, die 50 mM natriumcitraat, 10 mM calciumchloride, en 500 mM NaOH en bewaar bij kamertemperatuur. </li><li> Immediately voorafgaand aan de test bereid een 1.5x werkoplossing van 1 ml PAHBAH reagens 9 ml bufferoplossing, opslag tot gebruik op ijs (te gebruiken binnen 4 uur). </li><li> Bereid monsters thermostabiele 0,2 of 0,5 ml buizen. Combineer 5 ui van elke oplossing geïncubeerd met filtreerpapier (stap 8.1) 45 ui H2O en 100 ui PAHBAH werkoplossing. Voorbeeld controles (monsters geïncubeerd zonder filterpapier) worden uitgevoerd onder dezelfde concentraties (5 pl monster, 45 pl H2O, 100 pl PAHBAH werkoplossing). Ook testen 5 normen (5 ui) die tussen 0 en 0,2 g / l glucose en zuiver H2O Run monsters en standaarden in drievoud. </li><li> Incubeer monsters gedurende precies 10 minuten bij 100 ° C, daarna afgekoeld bij kamertemperatuur gedurende precies 10 minuten. Pipetteer oplossingen in een plaat met 96 putjes en spectroscopisch onderzoek bij een golflengte van 410 nm. Aftrekken individuele sample-controles (geïncubeerd zonder papieren filter) van monsters definitief te verkrijgenwaarden. </li></ol>

<ol><li>Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulases+for+biomass+degradation%3A+comparing+recombinant+cellulase+expression+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms.</a> Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).</li>
<li>Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+inducible+expression+of+a+mesophilic+cellulase+avoids+adverse+effects+on+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development.</a> Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).</li>
<li>Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperthermophilic+endoglucanase+for+in+planta+lignocellulose+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion.</a> Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).</li>
<li>Sharma, A. K., Sharma, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plants+as+bioreactors%3A+recent+developments+and+emerging+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities.</a> Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).</li>
<li>Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco%2C+a+highly+efficient+green+bioreactor+for+production+of+therapeutic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins.</a> Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).</li>
<li>Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+study+of+Hypocrea+jecorina+Cel5A%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A.</a> Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).</li>
<li>Saloheimo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGIII%2C+a+new+endoglucanase+from+Trichoderma+reesei%3A+the+characterization+of+both+gene+and+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme.</a> Gene. 63, 11-21 (1988).</li>
<li>Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+fluorescent+proteins%3A+innovations+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineered fluorescent proteins: innovations and applications.</a> Nature Methods. 6, 713-717 (2009).</li>
<li>Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retention+signal+for+soluble+proteins+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum.</a> Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).</li>
<li>Béguin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+cellulase+activity+in+polyacrylamide+gels+using+Congo+red-stained+agar+replicas%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas.</a> Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).</li>
<li>Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+enzyme+production+by+three+Penicillium+species+on+monosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides.</a> Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).</li>
<li>Lever, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+reaction+for+colorimetric+determination+of+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates.</a> Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).</li>
<li>Maclean, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+human+papillomavirus+type+16+%28HPV-16%29+L1+expression+in+plants%3A+comparison+of+the+suitability+of+different+HPV-16+L1+gene+variants+and+different+cell-compartment+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization.</a> Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).</li>
<li>Munro, S., Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C-terminal+signal+prevents+secretion+of+luminal+ER+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins.</a> Cell. 48, 899-907 (1987).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%E2%80%9CWestern+Blotting%E2%80%9D%3A+Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">“Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elelctrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets+-+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets - procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li>
<li>Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+sensitive+method+for+detection+of+alkaline+phosphatase-conjugated+anti-antibody+on+Western+blots%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots.</a> Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).</li>
<li>Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+%CE%B2-cyclodextrin+on+the+renaturation+of+enzymes+after+sodium+dodecyl+sulfate%E2%80%93polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).</li>
<li>Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+molecular+farming+in+the+future%3A+transient+protein+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Applied+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).</li>
<li>Sammond, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulase+linkers+are+optimized+based+on+domain+type+and+function%3A+Insights+from+sequence+analysis%2C+biophysical+measurements%2C+and+molecular+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+heterologous+expression+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+II+and+cellobiohydrolase+II+in+the+yeasts+Pichia+pastoris+and+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica.</a> Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Recombinante expressie van cellulasen is een gebied van groot belang, vanwege het verlangen naar efficiëntere biobrandstoffen productiesystemen 1. Planten bieden vele mogelijkheden voor een succesvolle cellulase productie, met functies zoals economische oogsttechnieken en autohydrolysis methoden zeer wenselijke eigenschappen voor grootschalige productie van biobrandstoffen. Verder, het gebruik van verschillende lokalisaties voor het produceren van eiwitten toestaan, indien nodig, posttranslationele modificati...

<html> Afbraak van lignocellulose biomassa en het aanmaken van vloeibare brandstof is voorgesteld als een methode om afhankelijkheid van fossiele brandstoffen. Een belangrijke hindernis bij het ​​vaststellen economisch haalbare biomassa-systemen in de enzymatische afbraak van cellulose en hemicellulose 1. Plant expressiesystemen enorme mogelijkheden voor de productie van enzymen op industriële schaal. Landbouwsystemen te oogsten planten economisch als in volume zijn al gevestigd, zoals ze al duizenden jaren zijn geweest. De productie van cellulasen in planten gewenst door factoren zoals het gemak van autohydrolysis 2, en de mogelijkheden voor maximalisering van het gebruik van lagere enzym niveaus door het verhogen van de verteerbaarheid van plantaardige celwanden 1. Tot slot, plantaardige systemen maken het mogelijk de targeting van recombinante eiwitten naar specifieke gebieden van plantencellen en zijn in staat om enzymen waar vereist 3 posttranslationeel wijzigen. ve_content &quot;&gt; Nicotiana tabacum (tabak) wordt zeer vaak gebruikt als modelorganisme voor heterologe eiwitexpressie studies in planten, vanwege de snelle groei en biomassa accumulatie functies 4. Tijdelijke expressie van recombinante eiwitten is een techniek die eiwitproductie mogelijk maakt in korte perioden 5, met behoud van flexibiliteit om de lokalisatie en dus posttranslationele modificaties van de geselecteerde eiwitten, namelijk cellulasen. Dit maakt de productie van de cellulase (s) voor basis-analyse, terwijl ook de basis te leggen voor verdere expressie strategieën in planten. Met dergelijke transiënte expressie strategie is een endoglucanase van glycosyl hydrolase familie 5, Cel5A, afgeleid van de schimmelgastheer Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) 6 geproduceerd (hierna TrCel5A). TrCel5A is een 42 kDa eiwit dat natief geglycosyleerd en is zeer actief in hydroylzing celluloseketens 7. De tijdelijke expressie techniek die hier beschreven is gebaseerd op relatief gebruikte systeem, infiltreren de bladeren met Agrobacterium die het gen van belang in een geschikte expressievector. Te zorgen voor een snelle analyse van succesvolle in planta expressie, kan TrCel5A ook worden uitgedrukt als een fusie-eiwit met mCherry, een monomeer fluorescerend eiwit oorspronkelijk afkomstig van Discosoma sp. Eiwit DsRed 8, met een extra zes Histidineresten (His-tag) gefuseerd met de C-terminus (TrCel5A-mCherry). Expressie van het heterologe fusie-eiwit, TrCel5A-mCherry kunnen dus worden gecontroleerd in de groeiende plant met groen licht mCherry verspreiding te onderzoeken. Desgewenst kunnen dunne secties van het plantenmateriaal met groen licht worden microscopisch onderzocht op de specifieke lokalisatie van het eiwit vast. Voor dit werk, signaal en tranzitten peptiden werden opgenomen in het construct, om het heterologe eiwit export naar het endoplasmatisch reticulum 9 lokaliseren. Om de activiteit van plantaardige expressie cellulasen, zoals TrCel5A een aantal cellulase activiteit testen kunnen uitgevoerd worden geanalyseerd. Na de winning van de totale oplosbare plantaardige eiwitten, kan TrCel5A gedeeltelijk worden gezuiverd met behulp van een thermische incubatie techniek. Eiwit maat wordt ingesteld met behulp van SDS-PAGE gevolgd door Western blotting. Zymografie kan worden gebruikt om de activiteit te analyseren tegen substraten, bijv. cellulose die carboxy-gemethyleerd is (waardoor carboxymethylcellulose CMC) voor oplosbaarheid 10. Cellulase en glucosidase activiteit kan worden gecontroleerd met de fluorofoor 4-methylumbelliferyl (4-MU) geassocieerd met β-D-cellobioside (gecombineerde 4-MUC). Een andere methode om endoglucanase activiteit bij omvat de spectrometrische analyse CMC die is geassocieerd met een azo-dgij (Remazolbrilliant Blue R) 11. Daarnaast kunnen eiwit activiteit van zowel endoglucanasen en verschillende cellulasen worden gecontroleerd door het gebruik van een suiker analysetest, zoals p-hydroxybenzoëzuur hydrazide (PAHBAH) test 12. Deze technieken kunnen gebruikt worden om op te helderen en kwantificeren van de activiteit van de tot expressie gebrachte cellulase plaats.

<table><tbody><tr><td>4-methylumbelliferyl &beta;-D-cellobioside</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M6018</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>ROTH</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringon (geconcentreerd)</td><td>ROTH</td><td>6003</td><td></td></tr><tr><td>Antibioticum - kanamycine</td><td>ROTH</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Antibioticum - rifampicine</td><td>ROTH</td><td>4163</td><td></td></tr><tr><td>Antibioticum - carbencillin</td><td>ROTH</td><td>6344</td><td></td></tr><tr><td>Antilichaam - konijn anti His(6) pAb</td><td>ROCKLAND</td><td>600-401-382</td><td></td></tr><tr><td>Antilichaam - geit anti konijn AP, FC pAb</td><td>DIANOVA</td><td>111-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Azo-carboxymethylcellulose</td><td>MEGAZYME</td><td>S-ACMC</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-cyclodextrine</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C4805</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride dihydraat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Carboxymethylcellulose</td><td>ROTH</td><td>3333.1</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase van Trichoderma reesei ATCC 26921</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C2730</td><td></td></tr><tr><td>Congo rood</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>75768</td><td></td></tr><tr><td>Coomasie briljantblauw G 250</td><td>ROTH</td><td>9598.2</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-glucose</td><td>ROTH</td><td>8337</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>ROTH</td><td>K928</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier - Rotilabo blotting paper</td><td>ROTH</td><td>CL67</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>72091</td><td></td></tr><tr><td>MES-buffer</td><td>ROTH</td><td>4256</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>ROTH</td><td>8388</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitraat</td><td>ROTH</td><td>3580</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat</td><td>SERVA</td><td>20765</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>ROTH</td><td>6771</td><td></td></tr><tr><td>Grond, Einheitserde classic&nbsp;</td><td>PATZER GMBH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer - Infinite M200</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S-5390</td><td></td></tr><tr><td>4-Hydroxy benzhydrazide&nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H9882</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>ROTH</td><td>1058</td><td></td></tr><tr><td>UV lichtbron - BLAK RAY</td><td>UVP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome - VT1000S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

expressie van recombinant cellulase cel5a uit<em&gt; trichoderma reesei</em&gt; in tabaksplanten

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Cellulose afbrekende enzymen, cellulasen, zijn doelwit van zowel onderzoek en industriële belangen. Het overwicht van deze enzymen op moeilijk-cultuur organismen, zoals hyfen opbouw schimmels en anaërobe bacteriën is bespoedigd het gebruik van recombinante technologieën op dit gebied. Plant expressiewerkwijzen zijn gewenst voor grootschalige productie van enzymen en andere industrieel bruikbare eiwitten. Hierin werkwijzen voor de transiënte expressie van een endoglucanase schimmel, Trichoderma reesei Cel5A in Nicotiana tabacum worden gedemonstreerd. Succesvolle eiwitexpressie blijkt, gecontroleerd door fluorescentie met een mCherry-enzym fusieproteïne. Bovendien, een aantal standaard tests worden gebruikt om de activiteit van tijdelijk tot expressie T. onderzocht reesei Cel5A, waaronder SDS-PAGE, Western blotting, zymografie, evenals fluorescentie en kleurstoffen gebaseerde substraat degradatie assays. Het hier beschreven systeem kan worden gebruikt om een ​​actieve cel producerenUlase in een korte tijdsperiode, om het potentieel voor verdere productie in planten te evalueren door constitutieve of induceerbare expressiesystemen.

TrCel5A en TrCel5A-mCherry succesvol in tabaksplanten uitgedrukt in het tijdelijke expressiesysteem (Figuren 1A en 1B). Onderzoek van het expressiepatroon van de TrCel5A-mCherry fusie-eiwit onthulde gezonde bladeren (figuur 1C), die wijdverspreid eiwitexpressie onder groen licht (figuur 1D) toonde. Extractie van totaal oplosbare proteïnen werd uitgevoerd op tabak planten die bladeren die bevatte had tijdelijk tot expressie T...

Tabaksplanten werden gebruikt om een ​​schimmel cellulase, TrCel5A produceren via een tijdelijk expressiesysteem. De uitdrukking zou kunnen worden gecontroleerd met behulp van een fluorescerende fusie-eiwit, en het eiwit activiteit werd gekenmerkt post-expressie.

Expressie van recombinant Cellulase Cel5A uit<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; In tabaksplanten

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om doeleiwitten transient te expresseren in tabak om een idee te krijgen van de haalbaarheid van plant-gebaseerde enzymexpressie binnen een kort tijdsbestek. Deze transiënte expressie wordt bereikt door tabaksbladeren te infiltreren met een stam van Agrobacterium tumefaciens, die een vector bevat met het gen van belang als tweede stap. Na incubatie worden de geïnfiltreerde plantenbladeren geoogst en worden eiwitextracten gedeeltelijk gezuiverd om een werkende enzymoplossing te verkrijgen. Vervolgens wordt een eiwitanalyse uitgevoerd om de effecten van plant-gebaseerde expressie op het enzym te beoordelen en de enzymatische activiteit ervan te verifiëren.Er worden resultaten verkregen die de eiwitgrootte, mogelijke glycosyleringseffecten en enzymatische activiteit aantonen op basis van western blotting, zymografie en substraatdegradatie-assays. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de conversie van plantenbiomassa en kan ook inzicht bieden in de activiteit van enzymen nadat deze transient zijn tot expressie gebracht in tabak. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de infiltratiestap

expression-recombinant-cellulase-cel5a-from-trichoderma-reesei

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Beschrijven we een low cost, high throughput methode voor het screenen op schimmels endoglucanase activiteit...

High Throughput Screening van Fungal endoglucanase activiteit in Escherichia coli</em

Planten bieden een nieuw systeem voor de productie van farmaceutische eiwitten op commerciële schaal die is beter schaalbaar, kostenefficiënte en veilige dan de huidige expressie paradigma. In deze studie, rapporteren we een eenvoudig en handig, toch schaalbare aanpak van target-gen-bevattende...

Efficiënte Agroinfiltration van planten voor High-level Tijdelijke expressie van recombinante eiwitten

Voorbijgaande eiwitproductie in Nicotiana planten op basis van vacuüm infiltratie met Agrobacteriën uitvoeren lancering vectoren (tabak mozaïek virus-based) is een snelle en economische benadering van vaccin antigenen en therapeutische eiwitten te produceren. We vereenvoudigde de procedure en verbeterd doel accumulatie door het optimaliseren van de voorwaarden van bacteriën kweken, selecteren gastheer soorten, en co-introduceren van RNA-silencing onderdrukkers.

Optimalisatie en het gebruik van<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Gemedieerde Transient eiwitproductie in<em&gt; Nicotiana</em

We beschrijven een experimenteel ontwerp aanpak die kan worden bepaald en modelleren invloed van transgene regulerende elementen plantengroei en ontwikkeling parameters en incubatieomstandigheden de tijdelijke expressie van monoklonale antilichamen en reporter eiwitten in planten.

Karakterisering van complexe systemen met behulp van de Design of Experiments Aanpak: Transient Eiwitexpressie in tabak als een case study

Dit werk beschrijft een nieuwe werkwijze voor het selectief richten subcellulaire organellen in planten, bepaald met de BioRad Gene Gun.

Voorbijgaande Gene Expression Tobacco gebruik Gibson Vergadering en de Gene Gun

Vorming van eiwitcomplexen in vivo kan worden gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie complementatie. Interactie partners gefuseerd aan complementaire delen van fluorescente labels en tijdelijk tot expressie gebracht in tabaksbladeren, waardoor een opnieuw fluorescentiesignaal op nabijheid van de twee eiwitten.

Eiwit-eiwit interacties gevisualiseerd door Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie in Protoplasten en Bladeren Tabak

In deze studie werd de expressie van een doelgerichte humane recombinante eiwit in verschillende productieplatforms vergeleken. We concentreerden ons op traditionele fermentor-gebaseerde culturen en op planten, waarbij we de instelling van elk systeem beschreven en, op basis van de gerapporteerde resultaten, de inherente grenzen en voordelen voor elk platform benadrukten.

Een vergelijkende analyse van recombinant eiwit expressie in verschillende biofactories: Bacteriën, Insect Cells and Plant Systems

Op subcellulair niveau worden signaleringsgebeurtenissen dynamisch gemoduleerd door ontwikkelings- en omgevingssignalen. Hier beschrijven we een protocol dat het tabaks-transiente expressiesysteem gebruikt om dynamische eiwit-eiwitinteracties te monitoren en om de ruimtelijke organisatie van signaaltransductie in plantencellen bekend te maken.

Beeldvorming Ruimtelijke Reorganisatie van een MAPK signaalroute Met behulp van de Tabak Transient Expression System

We hebben een nieuwe methode voor het uitdrukken van mede meerdere chimeer fluorescerende fusie-eiwitten in planten te overwinnen van de moeilijkheden van conventionele methoden ontwikkeld. Duurt het voordeel van het gebruik van een enkele uitdrukking plasmide waarin meerdere functioneel onafhankelijk eiwit uiting van cassettes om eiwituitdrukking mede.

Co expressie van meerdere chimeer fluorescerende Fusion eiwitten op een efficiënte manier in planten

Voorbijgaande heterologe expressie van biosynthetic enzymen in Nicotiana benthamiana bladeren kunt doorschakelen endogene leveringen van 2,3-oxidosqualene op de productie van nieuwe producten van hoogwaardige triterpene. Hierin is beschreven van een gedetailleerd protocol voor snelle (5 dagen) preparative-schaal productie van triterpenen en analogen met behulp van dit krachtige plantaardige platform.

Voorbijgaande expressie in Nicotiana Benthamiana verlaat voor de productie van de Triterpene op een voorbereidende schaal

Hier presenteren we de protocollen voor het gebruik van het insect cel en baculovirus eiwit expressie systeem voor de productie van grote hoeveelheden uitgescheiden eiwithoudende gewassen voor eiwit kristallisatie. Een vector baculovirus expressie is gewijzigd met GP67 of insect hemolin signaal peptide voor plant secretie eiwituitdrukking in insect cellen.

Wijzigen Baculovirus expressievectoren voor de productie van plantaardige eiwitten in Insect cellen uitgescheiden

Leer de transientie-expressie van cellulase TrCel5A in tabaksplanten voor plantaardige enzymproductie. Deze methode toont de haalbaarheid van snelle eiwitexpressie en enzymkarakterisatie.

Expressie van recombinant Cellulase Cel5A uit

Meer video's verkennen