Liganden modelleren in kaarten afgeleid van elektronencryomicroscopie
19 juli 2024
Dit protocol introduceert de tools die beschikbaar zijn voor het modelleren van liganden van kleine moleculen in cryoEM-kaarten van macromoleculen.
We zijn geïnteresseerd in het begrijpen van de fysiologische processen die in de cel plaatsvinden, met name op het membraangrensvlak. We gebruiken Cryo-EM als hoofdtechniek en werken aan verschillende interessante en uitdagende biologische problemen door meerdere macromoleculaire complexen te bestuderen. Het bepalen van de structuren van membraaneiwitten en andere labiele complexen was een paar decennia geleden een uitdaging.
Technische vooruitgang in Cryo-EM, een nieuw wasmiddel en lipidenmimeticum en met schenkingen, maakte echter de weg vrij voor een snelle structuurbepaling van deze complexen. Deze structuren kunnen nu met hoge resolutie worden verkregen en mogelijk worden gebruikt bij het ontdekken van geneesmiddelen. In Cryo-EM met één deeltje zijn de uitdagingen onder meer het verkrijgen van een stabiel en homogeen monster, het inbedden van het monster in willekeurige oriëntatie in dun ijs, het verwerken van een groot aantal afbeeldingen met een lage signaal-ruisverhouding en het nauwkeurig bepalen van de hoekoriëntatie en classificatie tijdens 3D-reconstructie.
Het identificeren en modelleren van kleine moleculen in cryo-EM-kaarten van ligand-eiwitcomplexen is een uitdaging vanwege de inherente ruis in de gegevens en isotrope en lage kaartresolutie, heterogeniteit van monsters en ligandflexibiliteit. Dit protocol is een stap-voor-stap handleiding voor het identificeren en modelleren van liganden en oplosmiddelmoleculen in Cryo-EM met een lage tot gemiddelde resolutie.
Overzicht
Dit protocol introduceert de beschikbare instrumenten voor het modelleren van kleine-molecuul liganden in cryoEM-kaarten van macromoleculen. De studie richt zich op het begrijpen van fysiologische processen op het membraaninterface door gebruik te maken van cryoEM om diverse biologische uitdagingen aan te pakken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Cryo-elektronenmicroscopie (cryoEM)
- Macromoleculaire complexen
- Drug discovery
Achtergrond
- Het begrijpen van fysiologische processen in de gehele cel.
- Uitdagingen bij het bepalen van de structuren van membraaneiwitten.
- Vooruitgang in cryo-EM-technieken.
- Het belang van hoge-resolutiestructuren voor geneesmiddelenontwikkeling.
Doel van de studie
- Om kleine-molecuul liganden in cryo-EM kaarten te modelleren.
- Om het begrip van membraaneiwitstructuren te verbeteren.
- Om de snelle structuurbepaling van labiele complexen te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Single-particle cryo-EM-techniek.
- Inbedden van monsters in dun ijs.
- Verwerken van beelden met een lage signaal-ruisverhouding.
- 3D-reconstructie en classificatie van hoekoriëntatie.
Belangrijkste resultaten
- Hoge-resolutiestructuren van membraaneiwitten verkregen.
- Succesvolle modellering van kleine-molecuul liganden in cryo-EM-kaarten.
- Het overwinnen van uitdagingen op het gebied van monsterstabiliteit en homogeniteit.
- Vooruitgang in het potentieel voor geneesmiddelenontwikkeling door structurele inzichten.
Conclusies
- CryoEM is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van macromoleculaire complexen.
- Het modelleren van liganden verbetert het begrip van geneesmiddelinteracties.
- Technische vooruitgang blijft het onderzoek naar structurele biologie verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Hoge-resolutiemodellering van eiwit-ligandinteracties met behulp van cryoEM-kaarten is steeds crucialer voor vroege fasen van geneesmiddelenontwikkeling en mechanistische risicoreductie. Het vermogen om ligandbinding in complexe macromoleculaire assemblages nauwkeurig te identificeren en te verfijnen, ondersteunt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie en informeert beslissingen over portfoliotriage. De integratie van geavanceerde cryoEM-workflows stelt biofarmaceutische teams in staat om structurele ambiguïteit aan te pakken en de structuurgebaseerde identificatie van leadverbindingen te versnellen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe visualisatie van ligandbindingsplaatsen en interactienetwerken in macromoleculaire complexen mogelijk.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door de structurele basis van target-engagement te verduidelijken.
- Verbetert het voorspellend vertrouwen voor functionele targetvalidatie en daaropvolgende triage.
Screening & assayontwikkeling
- Faciliteert de voorbereiding van gevalideerde structurele modellen voor computationele en experimentele screening-workflows.
- Maakt reproduceerbare identificatie van liganddichtheden en kwantitatieve beoordeling van bindingsmodi mogelijk.
- Ondersteunt assay-standaardisatie door referentiestructuren te bieden voor ligand-gebonden en apo-toestanden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijmt structurele inzichten op ziekterelevante systemen door fysiologisch belangrijke complexen te modelleren.
- Zorgt voor continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door structuurgeleide optimalisatie te ondersteunen.
- Vermindert het translationele risico door ligandbinding in relevante biologische assemblages te bevestigen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze op cryoEM gebaseerde workflow voor ligandmodellering slaat een brug tussen vroege ontdekking, lead-identificatie en preklinisch onderzoek door hoogbetrouwbare structurele gegevens te leveren voor hypothesetesten en optimalisatie van verbindingen.
- Discovery Biology: Maakt hypothese-gestuurde analyse van ligandbinding en pathway-modulatie mogelijk.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve liganddichtheidskaarten voor vergelijkende analyse.
- Analytics: Levert verfijnde atomaire coördinaten en verschilkaarten ter ondersteuning van de statistische evaluatie van bindingsgebeurtenissen.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt structurele bevindingen met ziekterelevante targets en biomarkerstrategieën.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een schaalbare, gestandaardiseerde workflow voor doorlopende initiatieven op het gebied van structure-based drug design.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Standaardiseert ligandmodellering en -verfijning over diverse eiwitsystemen.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verbetert de kapitaalefficiëntie door structurele risico's in een laat stadium te verminderen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van structureel gevalideerde targets.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in cryoEM-gegevensverwerking, modelbouw en software voor verfijning.
- Vereist toegang tot rekeninfrastructuur met hoge prestaties en visualisatietools.
- Maakt cross-team standaardisatie van map-drempelwaarden, validatiecriteria en coördinaatverfijning noodzakelijk.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende proteïneklassen, ligandtypen of resolutieregimes.
- Afhankelijk van monsterkwaliteit, map-resolutie en inherente ruisbeperkingen in cryoEM-gegevens.
