Name: Liganden modelleren in kaarten afgeleid van elektronencryomicroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Ontdek hoe je kleine-molecuulliganden modelleert in cryoEM-kaarten van macromoleculen met behulp van single-particle cryoEM-technieken. Deze methode verbetert het begrip van membraaneiwitstructuren voor drug discovery.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SJ is een ontvanger van het PhD-studentschap van DAE-TIFR, en de financiering wordt erkend. KRV erkent DBT B-Life-subsidie DBT/PR12422/MED/31/287/2014 en de steun van het Department of Atomic Energy, Government of India, onder Project Identification No. RTI4006.

Modelleren van liganden van kleine moleculen in CryoEM-kaarten van macromoleculen

De auteurs hebben niets te onthullen.

De verbeteringen in de hardware en software van microscopen hebben de afgelopen jaren geleid tot een toename van het aantal cryoEM-structuren. Hoewel de hoogste resolutie die op dit moment wordt bereikt in cryoEM met één deeltje 1,2 Å 57,58,59 is, wordt het merendeel van de structuren bepaald rond de 3-4 Å resolutie. Het modelleren van liganden in kaarten met een gemiddelde tot lage resolutie kan lastig zijn en vaak beladen met dubbelzinnigheid. Gezien het wijdverbreide gebruik van cryoEM in zowel de academische wereld als de farmaceutische industrie voor translationeel onderzoek en het ontdekken van geneesmiddelen, is het essentieel om ervoor te zorgen dat liganden correct en zonder dubbelzinnigheid worden gemodelleerd. Het is dus verstandig om de oplosbaarheid van ligandatomen te kwantificeren door Q-scores60 te berekenen, die nu beschikbaar is in de EMDB als een metriek om de kwaliteit van de kaarten en de pasvorm van het model te evalueren, evenals in Chimera.
In het eerste voorbeeld werd ChimeraX gebruikt om de verschilkaart in de werkelijke ruimte te berekenen tussen de apo en de ligandgebonden afbeeldingen in het M. tuberculosis enolase-enzym. De extra dichtheid bij een hoge drempel suggereert de aanwezigheid van het ligand, fosfoenolpyruvaat, in de actieve plaats en Mg2+ gebonden aan het ligand. Het is belangrijk op te merken dat de kaart in dit geval een gemiddelde resolutie heeft (3,2 Å) en dat watermoleculen niet met zekerheid kunnen worden gemodelleerd (Figuur 1). De beperking van deze methode is dat deze alleen kan worden toegepast wanneer ligandbinding geen significante conformationele veranderingen in het eiwit induceert. Kaartnormalisatie werd in dit geval niet uitgevoerd, omdat zowel de apo- als de ligand-gebonden datasets met dezelfde pixelgrootte werden verkregen en met identieke parameters in Relion werden verwerkt. Het is echter vermeldenswaard dat bij het vergelijken van kaarten die zijn gegenereerd door verschillende reconstructieprogramma's, zoals Relion46,47 en CryoSparc61, of met verschillende kwaliteit, normalisatie van de kaarten essentieel wordt voordat zinvolle vergelijkingen kunnen worden gemaakt.
Het volgende voorbeeld is mGlu5, dat een grote moleculaire reorganisatie ondergaat na agonistbinding, zoals blijkt uit de cryoEM-structuren51,62 (Figuur 2). In dit scenario is het niet haalbaar om een eenvoudige verschilkaart te berekenen tussen de ongebonden (apo) en ligand-gebonden receptoren vanwege substantiële verschillen tussen de kaarten. Hier werd Servalcat gebruikt, dat onverscherpte en ongewogen halve afbeeldingen gebruikt als input voor verfijning in de reciproke ruimte en vervolgens een verschilkaart berekent tussen de experimentele kaart en de kaart die van het model is afgeleid. Bij een hoge drempel kan men verschillen visualiseren en als leidraad dienen voor correctie en verbetering van het model. Verschillende niet-gemodelleerde blobs in het extracellulaire en nabij het transmembraandomein van mGlu5 werden waargenomen en gebruikt als leidraad voor het modelleren van liganden (Figuur 2).
Het derde voorbeeld laat zien hoe resolutie (2,3 Å) een cruciale rol speelt bij de kaartinterpretatie en modellering van een remmer ter grootte van een fragment in β-galactosidase. Hier was de uitdaging om een zeer kleine ligand (<200 Da) in de Servalcat-verschilkaart te identificeren te midden van de inherente ruis in de gegevens en deze nauwkeurig te modelleren. Naast de hoge globale resolutie die werd bepaald met behulp van Fourierschaalcorrelatie (FSC), was de lokale resolutie die specifiek is voor de ligand ook voldoende hoog om een nauwkeurige plaatsing van de chirale centra van de liganden te garanderen (Figuur 3). De dichtheid van oplosmiddelmoleculen werd waargenomen in de verschilkaart door het hele enzym en vooral rond het ligand. Het effect van resolutie op het modelleren van liganden en oplosmiddelatomen werd ook aangetoond (Figuur 4). Het is belangrijk om voorzichtig te zijn bij het modelleren van water- of oplosmiddelmoleculen, omdat ruis op een lage drempel soms kan lijken op water- of oplosmiddelmoleculen, wat kan leiden tot mogelijke verkeerde interpretaties.
Een andere belangrijke overweging is dat de cryoEM-kaarten alleen mogelijk niet voldoende zijn om een metaalion op zichzelf nauwkeurig te identificeren. Aanvullende biofysische methoden zoals Extended X-ray Absorption Fine Structure (EXAFS) of Energy-Dispersive X-ray Spectroscopy (EDX) zijn vaak nodig om de aanwezigheid en identiteit van het metaalion te bevestigen. In zowel enolase- als β-galactosidase-enzymen werd Mg2+ gemodelleerd vanwege de schat aan informatie die al beschikbaar was over deze eiwitten, die de identiteit van het metaalion bevestigt. Ook de coördinatie van de metaalionen in deze gevallen, geïllustreerd door de klassieke octaëdrische geometrie en de bijna ideale coördinatieafstanden van Mg2+, leverde een substantieel bewijs van hun identiteit.
Over het algemeen moet rekening worden gehouden met een paar belangrijke overwegingen bij het modelleren van liganden in cryoEM-kaarten. Om te beginnen is het belangrijk om de juiste kaart te kiezen voor ligandidentificatie en -modellering. In alle gevallen is een niet-verscherpte en ongewogen kaart of een halve kaart aan te raden boven een verscherpte en gewogen kaart om de liganddichtheid te visualiseren, aangezien verscherping en weging kunnen resulteren in onder- of oververscherpte (ruis als gevolg van seriebeëindiging) gebieden in de kaart. Dit kan resulteren in een suboptimale liganddichtheid, en het gebruik van verschillende B-factor verscherping kan worden gebruikt om de dichtheid te evalueren tijdens het bouwen van modellen in Coot. Hoewel er een risico bestaat bij het gebruik van de verscherpte kaart om liganden in een cryoEM-kaart te identificeren, toont de niet-verscherpte kaart mogelijk niet het volledige detail van de liganddichtheid, maar kan deze worden gebruikt voor demonstratiedoeleinden, zoals weergegeven in figuur 1B,C.
De pose van de gemodelleerde ligand moet worden gevalideerd, vooral in gevallen waarin de gegevens zwak zijn. Zoals hier voor mGlu5 te zien is, varieert de lokale resolutie over de cryoEM-kaart, en onbevooroordeelde modellering van het ligand kan een uitdaging zijn. Servalcat kan worden gebruikt als een waardevol hulpmiddel voor het detecteren van mogelijke onnauwkeurigheden in eiwit- en ligandmodellering22.
Samenstellingsheterogeniteit kan aanwezig zijn in een eiwit-ligandcomplex waar alleen een specifieke populatie het ligand aanwezig kan hebben (als het ligand een laag molecuulgewicht heeft, kan de classificatiestap de heterogeniteit mogelijk niet verwijderen). Desalniettemin is het belangrijk om de stap3D-classificatie 63 iteratief uit te voeren tijdens de beeldverwerking voorafgaand aan ligandmodellering en te controleren of de dichtheid van het ligand verbetert. Als er meerdere kopieën van eiwit aanwezig zijn, moet voorzichtigheid worden betracht bij het toepassen van symmetrie over de kaart tijdens de eerste modelgeneratie en verfijning, omdat dit het gemiddelde kan zijn van de liganddichtheid in alle symmetriegerelateerde moleculen. Symmetrie mag alleen worden opgelegd nadat de kaart grondig is geïnspecteerd om de aanwezigheid van liganddichtheid in alle eiwitketens te bevestigen.
Afhankelijk van de toestand (kristal of oplossing) en de locatie (begraven of oppervlak), kunnen de atomen dynamisch zijn, en in modelverfijning wordt dit de atomaire verplaatsingsparameter (ADP) genoemd. Samen met de verschilkaart, die visuele aanwijzingen geeft voor mogelijke onnauwkeurigheden in het model, kunnen ADP-waarden worden gebruikt om de nauwkeurigheid van de liganden na verfijning 64,65,66,67 te evalueren. Normaal gesproken zou de ligand vergelijkbare ADP-waarden moeten hebben als de omringende residuen, d.w.z. als ze stabiel gebonden en nauwkeurig gemodelleerd zijn. Liganden aan de periferie of atomen van een ligand (zoals lipiden) die ver van macromoleculen verwijderd zijn, kunnen echter hogere ADP-waarden hebben. Naast het verfijnen van de coördinaten, maken zowel Refmac33,34 als Phenix verfijning van ADP-waarden 28,68 mogelijk. In Refmac wordt de Mott-Bethe-benadering gebruikt om de elektronenverstrooiingsfactor van individuele atomen te berekenen tijdens de kaartberekening. In de recente versie van Phenix is individuele B-factorverfijning, vergelijkbaar met kristallografie, geïntroduceerd om rekening te houden met atoomwanorde. Heel vaak wordt in de verfijnde modellen die zijn afgeleid van cryoEM een breed scala aan ADP-waarden waargenomen (soms waarden dicht bij nul), en zelfs de Q-score die in EMDB wordt gebruikt om de pasvorm van het model met de kaart te evalueren, hangt af van de primaire kaart die is gedeponeerd en de aard van de B-factorverscherping60. Bij het bouwen van cryoEM-modellen worden vaak meerdere kaarten gebruikt, en daarom moeten de kaarten die worden gebruikt bij het modelleren en verfijnen duidelijk worden vermeld in de methoden, omdat vanwege de anisotrope resolutie in veel macromoleculen één enkele kaart mogelijk niet voldoende is om alle details te verklaren. 
Bij het modelleren van liganden in macromoleculen is een van de belangrijkste beperkingen van cryoEM-kaarten (zoals in de kristallografie) dat als de ligandbindingsplaats een lage resolutie heeft of als het gebonden ligand dynamisch is, het moeilijk kan zijn om de juiste conformatie vast te stellen. Bovendien hebben de meeste cryoEM-structuren resoluties van minder dan 3 Å, en is de weergave van watermoleculen in de kaarten beperkt, waardoor het moeilijk is om de rol van hydratatie in ligand of geneesmiddelbinding te beoordelen (zoals hier wordt getoond met de voorbeelden van enolase en mGluR). Computationele methoden kunnen worden gebruikt in combinatie met cryoEM-gegevens om deze beperkingen aan te pakken69. In tegenstelling tot kristallografie wordt alleen het model verfijnd, niet de kaart. Momenteel is de enige methode om de aanwezigheid van een ligand aan te geven of nauwkeurige modellering te garanderen, het genereren van weglatingskaarten (met behulp van tools zoals Servalcat). Er zijn dus een aantal hulpmiddelen om onderzoekers te helpen bij het bouwen en evalueren van het model, maar er zijn verschillende gebieden in modelverfijning waar in de nabije toekomst nieuwere benaderingen of aanpassingen van de huidige benaderingen kunnen worden verwacht.
In dit artikel hebben we ons gericht op de huidige benaderingen voor het modelleren van liganden, waaronder handmatige inspectie van de liganddichtheid, het genereren van het ligandgeometriebestand, gevolgd door het modelleren van de ligand in de cryoEM-kaart. Dit is een opwindende periode in de structurele biologie en de ontdekking van geneesmiddelen, aangezien directe elektronendetectoren met snellere framesnelheden en het gebruik van snellere data-acquisitie70 hebben geresulteerd in het verkrijgen van hoge-resolutiekaarten (<2,8 Å) van verschillende macromoleculen die vaak zijn gebonden aan liganden van kleine moleculen in een relatief korte tijd. De recente introductie van geautomatiseerde ligandmodelleringstools zoals GEMspot69 in de Schrödinger-suite en EMERALD17 in de Rosetta-suite, die probeert de meest waarschijnlijke gebonden pose van de ligand te vinden terwijl rekening wordt gehouden met de experimentele cryoEM-gegevens, is veelbelovend om dit proces te stroomlijnen en te automatiseren. Net als bij röntgenkristallografie wordt verwacht dat het identificeren van de bindingsmodi van liganden met kleine moleculen door cryoEM, misschien twee of meer op één dag, een realistische mogelijkheid zal worden.

Cellen vervullen hun functies door talloze chemische reacties tegelijkertijd en onafhankelijk uit te voeren, elk zorgvuldig gereguleerd om hun overleving en aanpassingsvermogen te garanderen als reactie op omgevingssignalen. Dit wordt bereikt door moleculaire herkenning, waardoor biomoleculen, met name eiwitten, voorbijgaande of stabiele complexen kunnen vormen met andere macromoleculen en met kleine moleculen of liganden1. Eiwit-ligandinteracties zijn dus van fundamenteel belang voor alle processen in de biologie, waaronder de regulatie van eiwitexpressie en -activiteit, de herkenning van substraten en cofactoren door enzymen, evenals hoe cellen signalen waarnemen en doorgeven 1,2. Een beter begrip van de kinetische, thermodynamische en structurele eigenschappen van het eiwit-ligandcomplex onthult de moleculaire basis van ligandinteractie en vergemakkelijkt ook een rationeel geneesmiddelontwerp door de geneesmiddelinteractie en specificiteit te optimaliseren. Een economische en snellere benadering voor het bestuderen van eiwit-ligandinteractie is het gebruik van moleculaire docking, een computationele methode die virtueel een breed scala aan kleine moleculen screent en de bindingsmodus en affiniteit van deze liganden aan doeleiwitten voorspelt3. Experimenteel bewijs van structuren met een hoge resolutie bepaald door röntgendiffractie (XRD), nucleaire magnetische resonantie (NMR) of elektronencryomicroscopie (cryoEM) levert echter het essentiële bewijs voor dergelijke voorspellingen en helpt bij de ontwikkeling van nieuwere en effectievere activatoren of remmers voor een bepaald doelwit. In dit artikel wordt de afkorting 'cryoEM' gebruikt, zoals de techniek gewoonlijk wordt genoemd. Er is echter een voortdurend debat gaande over het kiezen van de juiste nomenclatuur, en onlangs is de term cryogenic-sample Electron Microscopie (cryoEM) voorgesteld om aan te geven dat het monster op cryogene temperatuur is en in beeld is gebracht met elektronen4. Evenzo worden de kaarten die zijn afgeleid van cryoEM elektronenpotentiaal, elektrostatische potentiaal of Coulomb-potentiaal genoemd, en voor de eenvoud gebruiken we hier cryoEM-kaarten 5,6,7,8,9,10.
Hoewel XRD de gouden standaardtechniek is geweest voor de bepaling van de structuur van eiwit-ligandcomplexen met hoge resolutie, is cryoEM na resolutie-revolutie11 in een stroomversnelling geraakt, zoals blijkt uit de golf van Coulomb-potentiaalkaarten of cryoEM-kaarten die de afgelopen jaren in de Electron Microscopy Database (EMDB)12,13 zijn gedeponeerd14. Als gevolg van de vooruitgang in monstervoorbereiding, beeldvorming en gegevensverwerkingsmethoden is het aantal Protein Data Bank (PDB)14-afzettingen met cryoEM tussen 2010 en 2020 toegenomen van 0,7% naar 17%, waarbij ongeveer 50% van de gerapporteerde structuren in 2020 werd bepaald met een resolutie van 3,5 Å of beter15,16. CryoEM is snel geadopteerd door de structurele biologiegemeenschap, inclusief de farmaceutische industrie, omdat het de studie mogelijk maakt van flexibele en niet-kristallijne biologische macromoleculen, met name membraaneiwitten en multi-eiwitcomplexen, met een bijna atomaire resolutie, waardoor het proces van kristallisatie wordt overwonnen en goed diffracterende kristallen worden verkregen die nodig zijn voor structuurbepaling met hoge resolutie door XRD.
Nauwkeurige modellering van het ligand in de cryoEM-kaart is van het grootste belang, omdat het dient als een blauwdruk van het eiwit-ligandcomplex op moleculair niveau. Er zijn verschillende geautomatiseerde hulpmiddelen voor het opbouwen van liganden die worden gebruikt in röntgenkristallografie die afhankelijk zijn van de vorm en topologie van de liganddichtheid om het ligand in de elektronendichtheid 17,18,19,20 te passen of te bouwen. Desalniettemin, als de resolutie lager is dan 3 Å, hebben deze benaderingen de neiging om minder gewenste resultaten te produceren omdat de topologische kenmerken waarvan ze afhankelijk zijn voor herkenning en opbouw minder gedefinieerd worden. In veel gevallen zijn deze methoden niet effectief gebleken bij het nauwkeurig modelleren van liganden in cryoEM-kaarten, omdat deze kaarten zijn bepaald in het bereik van lage tot gemiddelde resolutie, meestal tussen 3,5 Å-5 Å17.
De eerste stap in de 3D-structuurbepaling van een eiwit-ligandcomplex door cryoEM omvat ofwel het co-zuiveren van het ligand met het eiwit (wanneer het ligand een hoge bindingsaffiniteit heeft met het eiwit) of het incuberen van de eiwitoplossing met het ligand voor een bepaalde duur vóór de roostervoorbereiding. Vervolgens wordt een klein monstervolume op een met plasma gereinigd holey TEM-rooster geplaatst, gevolgd door flash-invriezen in vloeibaar ethaan en uiteindelijk beeldvorming met een cryo-TEM. De 2D-projectiebeelden van honderdduizenden tot miljoenen individuele deeltjes worden gemiddeld om een 3-dimensionale (3D) Coulomb-potentiaalkaart van het macromolecuul te reconstrueren. Het identificeren en modelleren van liganden en oplosmiddelmoleculen in deze kaarten levert in veel gevallen aanzienlijke uitdagingen op vanwege de anisotrope resolutie over de kaart (d.w.z. de resolutie is niet uniform over het macromolecuul), flexibiliteit in het gebied waar het ligand is gebonden en de ruis in de gegevens. Veel van de modellerings-, verfijnings- en visualisatietools die voor XRD zijn ontwikkeld, worden nu aangepast voor gebruik in cryoEM voor dezelfde doeleinden 18,19,20,21. In dit artikel wordt een overzicht gegeven van verschillende methoden en software die momenteel worden gebruikt om liganden te identificeren, modellen te bouwen en de coördinaten afgeleid van cryoEM te verfijnen. Er is een stapsgewijs protocol opgesteld om de processen te illustreren die betrokken zijn bij het modelleren van liganden met behulp van specifieke eiwit-ligandcomplexen met verschillende resolutie en complexiteit.
De eerste stap in het modelleren van liganden in cryoEM-kaarten omvat de identificatie van de liganddichtheid (niet-eiwit) in de kaart. Als ligandbinding geen conformationele verandering in het eiwit veroorzaakt, dan markeert het berekenen van een eenvoudige verschilkaart tussen het eiwit-ligandcomplex en het apo-eiwit in wezen de gebieden met extra dichtheid, wat de aanwezigheid van het ligand suggereert. Dergelijke verschillen kunnen onmiddellijk worden waargenomen, omdat er slechts twee kaarten nodig zijn, en zelfs tussenliggende kaarten tijdens het proces van 3D-verfijning kunnen worden gebruikt om te controleren of de ligand aanwezig is. Bovendien, als de resolutie hoog genoeg is (<3.0 Å), kan de verschilkaart ook inzicht geven in de locatie van watermoleculen en ionen die interageren met de ligand en de eiwitresiduen.
Bij afwezigheid van de apo-eiwitkaart is het nu mogelijk om Servalcat22 te gebruiken, dat beschikbaar is als een op zichzelf staande tool en ook is geïntegreerd in de CCP-EM-softwaresuite23,24 als onderdeel van de Refmac-verfijning en in CCP4 8.0 release25,26. Servalcat maakt het mogelijk om een FSC-gewogen verschilkaart (Fo-Fc) te berekenen met behulp van de niet-verscherpte half-maps en het apoproteïnemodel als invoer. De Fo-Fc weggelaten kaart geeft de ongelijkheid weer tussen de experimentele kaart (Fo) en de kaart die is afgeleid van het model (Fc). Bij afwezigheid van een ligand in het model, suggereert een positieve dichtheid in een Fo-Fc-kaart die overlapt met de experimentele EM-kaart doorgaans de aanwezigheid van het ligand. De aanname hier is dat de eiwitketen goed in de kaart past, en de resterende positieve dichtheid geeft de locatie van het ligand aan. Het is echter belangrijk om nauwgezet te onderzoeken of de positieve dichtheid voortkomt uit onnauwkeurigheden in het modelleren, zoals de verkeerde rotamer van een eiwitzijketen.
De tweede stap is het verkrijgen of maken van een cartesisch coördinatenbestand van de ligand met een goed gedefinieerde geometrie op basis van de beschikbare chemische informatie. Standaard liganden (bijvoorbeeld ATP en NADP+) die al beschikbaar zijn in de CCP4-monomeerbibliotheek kunnen worden gebruikt voor verfijning door de coördinaten- en geometriebestanden op te halen via hun monomeertoetredingscode. Voor onbekende of niet-standaard liganden zijn er echter verschillende tools beschikbaar om de geometriebestanden te maken. Enkele van de voorbeelden zijn de eLBOW27 - (elektronische ligandbouwer en optimalisatiewerkbank) in Phenix28, Lidia - een ingebouwde tool in Meerkoet29, JLigand/ACEDRG30,31, CCP-EM23,24, Ligprep32-een module van Glide binnen de Schrödinger-suite. Het ligandcoördinatenbestand wordt vervolgens in de dichtheid gepast, geleid door zowel de experimentele cryoEM-kaart als de verschilkaart in Coot. Dit wordt gevolgd door real-space verfijning in Phenix28 of wederzijdse verfijning in Refmac33. Een Linux-werkstation of een laptop uitgerust met een goede grafische kaart en de bovengenoemde software is vereist. De meeste van deze programma's zijn opgenomen in verschillende suites. CCP-EM24 en Phenix28 zijn gratis beschikbaar voor academische gebruikers en bevatten een verscheidenheid aan tools die in dit artikel worden gebruikt, waaronder Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, enz. Evenzo bieden Chimera37 en ChimeraX38 gratis licenties aan academische gebruikers.

<table><tbody><tr><td>CCP4-8.0</td><td>Consortium van verschillende instituten</td><td>https://www.ccp4.ac.uk</td><td>Gratis voor academische gebruikers en bevat Coot en een lijst van tools ontwikkeld voor röntgenkristallografie</td></tr><tr><td>CCP-EM</td><td>Consortium van verschillende instituten</td><td>https://www.ccpem.ac.uk/download.php</td><td>Gratis voor academische gebruikers en bevat Coot, Relion en vele anderen</td></tr><tr><td>Coot&nbsp;</td><td>Paul Emsley, LMB, Cambridge</td><td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td><td>Algemene software voor modelbouw maar ook beschikbaar met andere suites hierboven beschreven</td></tr><tr><td>DockinMap (Phenix)</td><td>Consortium van verschillende instituten</td><td>https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html</td><td>Software binnen de Phenix suite voor het docken van modellen in cryoEM kaarten</td></tr><tr><td>Electron Microscopy Data Bank&nbsp;</td><td>Consortium van verschillende instituten</td><td>https://www.ebi.ac.uk/emdb/</td><td>Publieke opslagplaats voor elektronenmicroscopie kaarten</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf</td><td>Commercieel, camera van Thermo Fisher&nbsp;</td></tr><tr><td>Phenix&nbsp;</td><td>Consortium van verschillende instituten</td><td>https://phenix-online.org/download</td><td>Gratis voor academische gebruikers en bevat Coot</td></tr><tr><td>Protein Data Bank</td><td>Consortium van verschillende instituten</td><td>https://rcsb.org</td><td>Publieke database van macromoleculaire structuren</td></tr><tr><td>Pymol</td><td>Schrodinger</td><td>https://pymol.org/2/</td><td>Moleculair visualisatietool. Educatieve versie is gratis maar komt met beperkingen. De volledige versie kan worden verkregen tegen een kleine vergoeding.</td></tr><tr><td>Relion</td><td>MRC-LMB, Cambridge</td><td>https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html</td><td>Software voor cryoEM beeldverwerking, ook beschikbaar met CCP-EM</td></tr><tr><td>Titan Krios</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&amp; gad_source=1&amp;gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE</td><td>Commercieel, cryoTEM van Thermo Fisher</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF, USA</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</td><td>Algemeen doel software voor weergave, analyse en meer</td></tr><tr><td>UCSF Chimera X</td><td>UCSF, USA</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/</td><td>Algemeen doel software voor weergave, analyse en meer</td></tr></tbody></table>

liganden modelleren in kaarten afgeleid van elektronencryomicroscopie

Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy

Het ontcijferen van de eiwit-ligandinteracties in een macromoleculair complex is cruciaal voor het begrijpen van het moleculaire mechanisme, de onderliggende biologische processen en de ontwikkeling van geneesmiddelen. In de afgelopen jaren is cryogene monsterelektronenmicroscopie (cryoEM) naar voren gekomen als een krachtige techniek om de structuren van macromoleculen te bepalen en om de wijze van ligandbinding bij bijna-atomaire resolutie te onderzoeken. Het identificeren en modelleren van niet-eiwitmoleculen in cryoEM-kaarten is vaak een uitdaging vanwege de anisotrope resolutie over het betreffende molecuul en de inherente ruis in de gegevens. In dit artikel maken de lezers kennis met verschillende software en methoden die momenteel worden gebruikt voor ligandidentificatie, modelbouw en verfijning van atomaire coördinaten met behulp van geselecteerde macromoleculen. Een van de eenvoudigste manieren om de aanwezigheid van een ligand te identificeren, zoals geïllustreerd met het enolase-enzym, is door de twee afbeeldingen die met en zonder het ligand zijn verkregen, af te trekken. De extra dichtheid van het ligand zal waarschijnlijk opvallen in de verschilkaart, zelfs bij een hogere drempel. Er zijn gevallen, zoals aangetoond in het geval van metabotrope glutamaatreceptor mGlu5, waarin dergelijke eenvoudige verschilkaarten niet kunnen worden gegenereerd. De onlangs geïntroduceerde methode voor het afleiden van de Fo-Fc weglaatkaart kan dienen als een hulpmiddel om de aanwezigheid van het ligand te valideren en aan te tonen. Ten slotte wordt, met behulp van het goed bestudeerde β-galactosidase als voorbeeld, het effect van resolutie op het modelleren van de liganden en oplosmiddelmoleculen in cryoEM-kaarten geanalyseerd en wordt een kijk gepresenteerd op hoe cryoEM kan worden gebruikt bij het ontdekken van geneesmiddelen.

Dit protocol introduceert de tools die beschikbaar zijn voor het modelleren van liganden van kleine moleculen in cryoEM-kaarten van macromoleculen.

Liganden modelleren in kaarten afgeleid van elektronencryomicroscopie

Deciphering the protein-ligand interactions in a macromolecular complex is crucial for understanding the molecular mechanism, underlying biological ...

We zijn geïnteresseerd in het begrijpen van de fysiologische processen die in de cel plaatsvinden, met name op het membraangrensvlak. We gebruiken Cryo-EM als hoofdtechniek en werken aan verschillende interessante en uitdagende biologische problemen door meerdere macromoleculaire complexen te bestuderen. Het bepalen van de structuren van membraaneiwitten en andere labiele complexen was een paar decennia geleden een uitdaging.Technische vooruitgang in Cryo-EM, een nieuw wasmiddel en lipidenmimeticum en met schenkingen, maakte echter de weg vrij voor een snelle structuurbepaling van deze complexen. Deze structuren kunnen nu met hoge resolutie worden verkregen en mogelijk worden gebruikt bij het ontdekken van geneesmiddelen. In Cryo-EM met één deeltje zijn de uitdagingen onder meer het verkrijgen van een stabiel en homogeen monster, het inbedden van het monster in willekeurige oriëntatie in dun ijs, het verwerken van een groot aantal afbeeldingen met een lage signaal-ruisverhouding en het nauwkeurig bepalen van de hoekoriëntatie en classificatie tijdens 3D-reconstructie.Het identificeren en modelleren van kleine moleculen in cryo-EM-kaarten van ligand-eiwitcomplexen is een uitdaging vanwege de inherente ruis in de gegevens en isotrope en lage kaartresolutie, heterogeniteit van monsters en ligandflexibiliteit. Dit protocol is een stap-voor-stap handleiding voor het identificeren en modelleren van liganden en oplosmiddelmoleculen in Cryo-EM met een lage tot gemiddelde resolutie.

modeling-ligands-into-maps-derived-from-electron-cryomicroscopy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Analyse van één deeltje in cryo-elektronenmicroscopie is een van de belangrijkste technieken die worden gebruikt om de structuur van biologische ensembles met hoge resolutie te bepalen. Scipion biedt de tools om de hele pijplijn te creëren om de informatie die door de microscoop wordt verkregen te verwerken en een 3D-reconstructie van het biologische specimen te bereiken.

Cryo-EM en single-particle analyse met Scipion

Structuurbepaling van macromoleculaire complexen met behulp van cryoEM is routine geworden voor bepaalde klassen van eiwitten en complexen. Hier wordt deze pijplijn samengevat (monstervoorbereiding, screening, gegevensverzameling en -verwerking) en worden lezers gericht op verdere gedetailleerde bronnen en variabelen die kunnen worden gewijzigd in het geval van meer uitdagende exemplaren.

Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur

Een belangrijke vaardigheid in biomoleculaire modellering is het weergeven en annoteren van actieve plaatsen in eiwitten. Deze techniek wordt gedemonstreerd met behulp van vier populaire gratis programma's voor macromoleculaire visualisatie: iCn3D, Jmol, PyMOL en UCSF ChimeraX.

Modellering van een Enzyme Active Site met behulp van Moleculaire Visualisatie Freeware

In dit artikel wordt een protocol voor het verwerken van cryo-EM-beelden gepresenteerd met behulp van de software suite SPHIRE. Het onderhavige protocol kan toegepast worden op bijna alle enkel-deeltjes-EM-projecten die zich richten op bijna atomaire resolutie.

Hoge resolutie single particle analyse van elektroncryo-microscopie beelden met behulp van SPHIRE

Presenteren we een protocol voor snelle karakterisering van biomoleculaire vouwen en inbinden interacties met thermolabile liganden met behulp van differentiële scanning calorimetrie.

Biomoleculaire DSC profielen met Thermolabile liganden te karakteriseren snel vouwen en inbinden van interacties te meten

Biopanning bacteriële display bibliotheken is een bewezen techniek voor ontdekking van peptide affiniteit reagentia, een robuust alternatief voor antilichamen. De semi-automatische sorteermethode hierin heeft gestroomlijnd biopanning als u wilt verkleinen van het optreden van valse positieven. We illustreren hier het denkproces en de technieken toegepast in de beoordeling van kandidaten en het minimaliseren van de downstream-analyse.

Semi-automatische Biopanning van bacteriële Display bibliotheken voor Peptide affiniteit reagens detectie en analyse van de resulterende isolaten

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

Hier zijn twee methoden die afzonderlijk of in combinatie kunnen worden gebruikt voor het analyseren van het effect van bèta-amyloid op fibrine clot structuur. Inbegrepen is een protocol voor het maken van een in vitro fibrine clot, gevolgd door clot turbiditeit en scanning elektronen microscopie methodes.

Analyse van β-Amyloid-geïnduceerde afwijkingen op fibrine Clot structuur door spectroscopie en Scanning elektronen microscopie

Dit protocol beschrijft de verwijdering van endogene lipiden uit allergenen en hun vervanging door door de gebruiker gespecificeerde liganden door middel van omgekeerde fase HPLC in combinatie met thermisch gloeien. 32 P-NMR en circulair dichroïsme zorgen voor een snelle bevestiging van ligandverwijdering/-belasting en het herstel van de inheemse allergenenstructuur.

Verwijdering en vervanging van endogene liganden uit lipidegebonden eiwitten en allergenen

Hier beschrijven we de procedures die in ons laboratorium zijn ontwikkeld voor het bereiden van poeders van kleine molecuulkristallen voor microkristalelektronendiffractie (MicroED) -experimenten.

Microkristal elektronendiffractie van kleine moleculen

Ontdek hoe je kleine-molecuulliganden modelleert in cryoEM-kaarten van macromoleculen met behulp van single-particle cryoEM-technieken. Deze methode verbetert het begrip van membraaneiwitstructuren voor drug discovery.

Liganden modelleren in kaarten afgeleid van elektronencryomicroscopie

Meer video's verkennen