Isolatie van adeno-geassocieerde virale vectoren door middel van een eenstaps en semi-geautomatiseerd heparine-affiniteitschromatografieprotocol
April 5th, 2024
Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor het genereren en zuiveren van adeno-geassocieerde virale vectoren met behulp van een geoptimaliseerde op heparine gebaseerde affiniteitschromatografiemethode. Het biedt een eenvoudige, schaalbare en kosteneffectieve aanpak, waardoor ultracentrifugatie niet nodig is. De resulterende vectoren vertonen een hoge zuiverheid en biologische activiteit, wat hun waarde bewijst in preklinische studies.
In dit werk zijn we van plan een verbeterd protocol te ontwikkelen voor de productie, zuivering en karakterisering van mozaïekadeno-geassocieerde virale vectoren die hun waarde zouden kunnen bewijzen in preklinische studies. Ondanks inspanningen om stabiele productiecellijnen op te zetten, is voorbijgaande transfectie in zoogdiercellen nog steeds de overheersende workflow voor AAV-productie. Vervolgens worden de AAV's gezuiverd door centrifugatie met ultrahoge snelheid van dichtheidsgradiënt, of door chromatografietechnieken die afhankelijk zijn van de biochemische eigenschappen van virale deeltjes.
De veelgebruikte methoden om AAV's te zuiveren maken gebruik van cesiumchloride of jodixanol dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie. Ondanks hun voordelen hebben ze enkele beperkingen. Ze zijn tijdrovend, ze hebben een beperkte schaalbaarheid en ze geven vaak resultaten aan sommige vectoren met een lage zuiverheid.
Om deze beperkingen te overwinnen, hebben verschillende onderzoekers hun aandacht gericht op chromatografietechnieken. We beschrijven een stapsgewijs protocol voor het genereren van mozaïek rAAV's op basis van het heparinebindende vermogen van AAV2. Deze methode maakt zeer zuivere en biologisch actieve rAAV's klaar voor gebruik in zes dagen, en presenteert zichzelf als een semi-geautomatiseerde, schaalbare en kosteneffectieve strategie om rAAV's te genereren voor preklinische studies.
Na het aantonen van de toepasbaarheid van deze methode voor het genereren van mozaïek rAAV's, kan het productiesysteem nu worden verfijnd om een betere schaalbaarheid en kosteneffectiviteit te bereiken door het opzetten van een productiecellijn. Daarnaast streven we ernaar om lege deeltjes te verwijderen door een tweede polijstzuiveringsstap op te nemen.
Overzicht
Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor de generatie en zuivering van adeno-geassocieerde virale vectoren met behulp van een geoptimaliseerde heparine-gebaseerde affiniteitschromatografie-methode. De resulterende vectoren vertonen een hoge zuiverheid en biologische activiteit, waardoor hun waarde in preklinische studies wordt bewezen.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Gentherapie
- Adeno-geassocieerde virussen
- Productie van virale vectoren
Achtergrond
- Huidige methoden voor het zuiveren van adeno-geassocieerde virussen (AAV's) omvatten vaak ultracentrifugatie.
- Deze methoden kunnen tijdrovend zijn en hebben een beperkte schaalbaarheid.
- Chromatografietechnieken komen op als alternatieven voor AAV-zuivering.
- Heparine-gebaseerde affiniteitschromatografie wordt onderzocht op hun efficiëntie en effectiviteit.
Doel van het onderzoek
- Om een schaalbaar en kosteneffectief protocol te ontwikkelen voor het produceren van hoogzuivere AAV's.
- Om de noodzaak voor ultracentrifugatie in het zuiveringsproces te elimineren.
- Om de biologische activiteit van de geproduceerde virale vectoren voor preklinische toepassingen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Tijdelijk transfectie van HEK 293T-cellen voor AAV-productie.
- Gebruik van heparine-gebaseerde affiniteitschromatografie voor zuivering.
- Stapsgewijs protocol dat celkweek, transfectie en zuiveringsprocessen beschrijft.
- Evaluatie van de zuiverheid en biologische activiteit van de resulterende AAV's.
Belangrijkste resultaten
- De heparine-gebaseerde methode levert zeer zuivere en biologisch actieve AAV's op.
- Het protocol kan in zes dagen worden voltooid.
- Schaalbaarheid en kosteneffectiviteit zijn verbeterd in vergelijking met traditionele methoden.
- Mogelijkheid tot verdere verfijning door het vestigen van stabiele produceerde cellijnen.
Conclusies
- Het geoptimaliseerde protocol vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang in AAV-productie.
- Het biedt een praktische oplossing voor onderzoekers in gentherapie en aanverwante gebieden.
- Toekomstig werk kan zich richten op het verbeteren van de schaalbaarheid en het verminderen van de aanwezigheid van lege deeltjes.
