Identificatie en kwantificering van gestoorde metabolieten bij ernstig zieke patiënten met behulp van op NMR gebaseerde metabolomics

Ons onderzoek maakt gebruik van op NMR gebaseerde metabolomics om ontregelde metabolieten en biochemische routes te identificeren die veranderen bij ernstig zieke IC-patiënten, en we hebben ook patiënten met ARDS, een ernstige longaandoening, opgenomen. Door de metabole signaturen te profileren en te vergelijken, willen we de biochemische verstoringen blootleggen die verband houden met ziekteprogressie en behandelingen aanpassen om de resultaten te verbeteren. Eigenlijk proberen we de kloof in het begrip van metabole ontregeling bij alle categorieën ARDS-patiënten aan te pakken, waaronder milde, matige en ernstige ARDS-patiënten.

Om onze inzichten te verbeteren, voor een beter begrip van de ziekte, de progressie ervan, met als algemeen doel de uitkomst voor de patiënt te verbeteren door precisie en gepersonaliseerde geneeskunde te bieden. NMR biedt eenvoudige monstervoorbereiding, waardoor de serumintegriteit behouden blijft voor heranalyse en bekende en onbekende metabolieten worden gedetecteerd zonder chemische derivatisering. Het biedt reproduceerbare, kwantitatieve gegevens, waardoor een betrouwbare meting van de metabolieten wordt gegarandeerd.

In tegenstelling tot gerichte benaderingen, maakt NMR gevoelige, onbevooroordeelde verkenning van metabole veranderingen mogelijk, waardoor het ideaal is voor het ontdekken van handtekeningen en routes in ziekteprogressie. Onze bevinding zal het ARDS-onderzoek verbeteren door metabole veranderingen in verschillende stadia bloot te leggen, die onvoldoende zijn bestudeerd. Met behulp van NMR-gebaseerde metabolomics willen we ontregelde metabolieten en pathways identificeren, wat leidt tot mogelijke signaturen voor vroege diagnose, prognose, meer tijdige voorspelling en behandelingen.

Deze aanpak bevordert gepersonaliseerd management en verdiept de kennis van multi-state metabole profilering. Onze resultaten maakten de weg vrij voor nieuwe wetenschappelijke vragen, zoals: Hoe beïnvloeden specifieke metabolieten die in verschillende stadia van ARDS zijn geïdentificeerd de ziekteprogressie? Kunnen deze ontregelde routes worden gericht op vroege therapeutische interventies?

Bovendien, hoe variëren deze metabole veranderingen tussen andere aandoeningen van de luchtwegen of ontstekingen? Verzamel om te beginnen met een steriele naald twee milliliter bloed uit de slagaders van een patiënt bij wie de diagnose mild of matig acuut respiratoir distress syndroom of ARDS is vastgesteld. Breng het bloed over in een steriele injectieflacon en laat het 30 minuten stollen bij kamertemperatuur.

Centrifugeer het gestold bloed op 3.100 G gedurende 15 minuten om het serum te scheiden. Breng het serum over in steriele microcentrifugebuisjes, waardoor aliquots van 400 tot 500 microliter worden gemaakt. Label de buisjes met de gegevens van de patiënt en bewaar ze bij 80 graden Celsius.

Meng voor NMR-experimenten 250 microliter van het serumaliquot met 250 microliter zoute fosfaatbuffer om pH-variatie te minimaliseren. Draai het mengsel gedurende ongeveer 15 seconden om een homogene menging te garanderen. Breng het voorbereide monster over in een schone NMR-buis met een coaxiaal inzetstuk dat TSP bevat in een concentratie van 0,05 millimolair.

Plaats vervolgens de NMR-buis in de magneet. Typ WRPA en selecteer het juiste experimentnummer om een protonexperiment op te zetten met het CPMG-pulsprogramma. Klik op de optie Titel om de naam van de patiënt en andere noodzakelijke gegevens in te voeren.

Typ vergrendeling en druk op Enter om het magnetische veld te vergrendelen. Selecteer vervolgens de opties 90%water en 10%deuteriumoxide. Typ vervolgens ATMM en druk op Enter om het afstemmen en matchen van de sonde uit te voeren.

Selecteer vervolgens in de optie Acquisitieparameters de parameters als 64.000 punten over 128 scans om optimalisatiegegevens te verzamelen. Stel de ontspanningsvertraging in van vijf seconden, een spectrale sweep-breedte van 12 ppm en een echotijd van 200 microseconden, 300 keer herhaald. Pas een lijnverbreding van 0,3 hertz toe met behulp van een exponentiële vensterfunctie.

Verkrijg vervolgens met behulp van de NMR-verwerkings- en analysetools de NMR-spectra. Zodra de definitieve spectra zijn verkregen, typt u APK en ABSN om respectievelijk fasecorrectie en basislijncorrectie uit te voeren. Klik vervolgens op de optie As kalibreren in het bovenpaneel en kalibreer de TSP-piek op 0 PPM, automatisch of handmatig.

Breng ten slotte de verkregen gegevens van het NMR-systeem over naar het werkstation voor verdere analyse. Na het verkrijgen van NMR-spectra van patiënten met de diagnose milde of matige ARDS, opent u NMR-metabolietkwantificeringssoftware voor gegevensverwerking. Om handmatige basislijncorrectie uit te voeren met behulp van de Whitaker-methode, opent u het spectrale bestand in de processormodule van de NMR-metabolietkwantificeringssoftware.

Selecteer basislijncorrectie en kies vervolgens de Whitaker-methode. Plaats stippen aan de basis van pieken in het hele spectrum. Als u klaar bent, slaat u de baseline-gecorrigeerde spectrale bestanden op in een enkele map.

Als u vervolgens spectrale binning wilt uitvoeren met behulp van de Profiler-module, selecteert u de Tools, vervolgens Batchproces, gevolgd door Spectral Binning. Als u het definitieve binningblad voor statistische analyse wilt genereren, selecteert u de map met alle voor de basislijn gecorrigeerde spectrale bestanden. Verdeel de spectra in bakken van gelijke grootte met een gedefinieerde spectrale breedte variërend van 0,01 tot 0,04 delen per miljoen.

Geef de grootte van de bucket en de begin- en eind-PPM-waarden op. Kies een map om de uitvoerbinningsvellen op te slaan. Sluit de chemische verschuivingsgebieden die overeenkomen met water en de TSP van het oplosmiddel uit om spectrale interferentie te voorkomen.

In het uiteindelijke werkblad worden voorbeeldnamen in de ene rij weergegeven en in de andere rijen bin-waarden met bijbehorende PPM. Voordat u statistische analyse uitvoert, normaliseert u de gegevens met behulp van enige normalisatie, logboektransformatie en Pareto-schaling. Voor multivariate analyse voert u Principal Component Analysis, Partial Least Squares Discriminant Analysis en Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis uit om discriminatie tussen de groepen te observeren, wat een variabel belang van projectiescores oplevert voor elke metaboliet die verantwoordelijk is voor het verschil in het metabole profiel.

Voer de t-test van de student uit om significante metabolieten te identificeren met een p-waarde van minder dan 0,05. T-testen produceren box whisker-plots die verschillen in metabolietconcentraties vertonen. Voer vervolgens een biomarkeranalyse uit om een gebied te genereren onder de grafiek van de operationele karakteristiekcurve van de ontvanger.

Selecteer de definitieve lijst van significante metabolieten op basis van een variabel belang van een projectiescore groter dan één, een Bonferroni-gecorrigeerde p-waarde van minder dan 0,05 en een gebied onder de curve groter dan 0,8. Identificeer met behulp van de Human Metabolome Database de metabolieten die overeenkomen met specifieke PPM-waarden. Voordat u met de kwantificering begint, moet u met behulp van de processormodule de referentieverbinding kalibreren die voor het onderzoek is geselecteerd.

Klik op de optie Calibrate Chemical Shift Indicator en voer de concentratie van de referentieverbinding in. Sleep de softwarepiek naar de spectrale referentiepiek en pas de hoogte en breedte aan. Zodra de spectrale referentiepieken zijn uitgelijnd met de piek van de software, klikt u op Accepteren.

Open vervolgens de gewenste spectra in de Profiler-module en selecteer de juiste samengestelde bibliotheek voor onderzoek. Onderaan het scherm wordt een lijst met metabolieten weergegeven. Selecteer de metaboliet die u interesseert uit de lijst.

Klik op de PPM-waarde in de bovenhoek van het scherm. Zoom in op de spectra tot de specifieke PPM-schaal van de metaboliet. Op dit punt verschijnen er twee pieken op het scherm, één die de geregistreerde gegevens vertegenwoordigt en de andere, weergegeven als een stippellijn, die de softwarepiek voorstelt.

Sleep de softwarepiek om deze uit te lijnen met de geregistreerde piek en pas de hoogte en positie aan. Zodra de pieken goed zijn uitgelijnd, leest u de concentratie van de metaboliet af van de waarde die wordt weergegeven onder het kopje Concentratie in millimolair. Om het uitvoerbestand te genereren, klikt u onder het menu Extra op de optie Batchbewerkingen en geeft u de gewenste map op voor het opslaan van het uitvoerbestand.

Principal Component Analysis toonde een duidelijke clustering tussen milde en matige ARDS-patiëntengroepen. Orthogonale gedeeltelijke kleinste kwadraten discriminantanalyse onthulde een duidelijke scheiding tussen de milde en matige ARDS-groepen, met de nadruk op metabole verschillen. De t-test en biomarkeranalyse van de student onthulden belangrijke ontregelde metabolieten tussen milde en matige ARDS.

Lactaat en isoleucine werden geïdentificeerd als significant ontregelde metabolieten die correleren met de ernst van ARDS.