Een geïntegreerde workflow van identificatie en kwantificering op FDR Control-Based Untargeted Metabolome

Dit protocol maakt kwalitatieve en kwantitatieve analyse van ongericht metaboloom mogelijk op basis van FDR-kwaliteitscontrole die de valse positieven van metabolietidentificatie effectief vermindert. Deze workflow integreert XY-Meta die de target-decoy-strategie gebruikt om FDR nauwkeuriger te evalueren voor metaboloomidentificatie in de kwalitatieve analysemodule. Deze maatregel kan vals-positieve resultaten van ongerichte metaboloomidentificatie effectief filteren, wat de robuustheid van het ontdekken van biomarkers of sleutelmoleculen verbetert.

We verwachten dat onderzoekers de target-decoy-strategie voor FDR-controle kunnen begrijpen en beheersen en moeten proberen deze pijplijn meerdere keren strikt uit te voeren met de standaardparameters van het protocol. Begin door naar de GNPS-databasepagina te gaan en klik op browse datasets. Zoek het trefwoord in de titelkolom en klik vervolgens op het id-nummer van de gegevensset.

Download de dataset via FTP en sla de onbewerkte gegevens op in de betreffende map. Om het formaat van onbewerkte gegevens te converteren, installeert u eerst de ProteoWizard-software. Typ msconvert onder het installatiepad van ProteoWizard.

exe, gevolgd door de specifieke parameters om het onbewerkte gegevensformaat naar mzXML-indeling te converteren. Nogmaals, met behulp van msconvert. exe converteert deze gegevens naar MGF-indeling en slaat ze op in de mgf-map.

Om de referentiespectraalbibliotheek voor de metabolieten voor te bereiden, gaat u naar de GNPS-webpagina. Zoek op het trefwoord NIST, klik op bekijken voor de details en download de bibliotheek. Sla de bibliotheek op in de databasemap.

Download het XY-Meta programma. Zoek het parameterconfiguratiebestand onder de configuratiemap en wijzig de inhoud ervan zoals beschreven in het tekstprotocol. Stel het type adducten in als een lijst in de adductmap.

Voer de metabolietidentificatie en false discovery rate control uit met het commando XY-Meta.exe. Download en installeer het metaX-softwarepakket. Bewerk vervolgens de voorbeeldlijst.

txt-bestand om het voorbeeld en de bijbehorende massaspectrometriegegevens op te geven zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik het R-bestand dat bij het tekstprotocol is geleverd om het script uit te voeren voor kwantificering van Mock- en wild-typegroepen met behulp van de metaX-software. Controleer de uitvoermap waarin de resultaten van de kwantitatieve analyse zijn opgeslagen, zoals de PCA-plot.

Wijzig vervolgens de parameters in het R-script om de pieken in kwalitatieve en kwantitatieve analyse te annoteren met behulp van metabolietidentificaties om zowel de resultaten te integreren als het R-script uit te voeren. Boxplots van gekwantificeerde metabolieten toonden aan dat de algemene verdeling van gezonde en ziektemonsters vergelijkbaar was met een lage fluctuatie van de gemiddelde waarden. Slechts 3,39% van de metabolieten had meer dan 30% van de ontbrekende waarden.

De analyse van de hoofdcomponenten van de monsters van beide groepen toonde aan dat metaX het aandeel van de metabolieten met CV opmerkelijk verhoogde tot minder dan 0,3. Een Venn-diagram van differentieel gedetecteerde metabolieten uit drie statistische testmethoden onthulde 119 veel voorkomende metabolieten. De retentietijd en massa per ladingsverdeling van alle geannoteerde metabolieten werden uitgezet met een valse ontdekkingssnelheid van minder dan 0,01, met zes significante en differentieel gedetecteerde metabolieten.

Het is belangrijk om de tijd voor workflowtests te beperken. Vergeet niet om niet te veel monsters te selecteren voor analyse en ten minste twee monsters in elke groep te bewaren. Deze techniek maakt kwaliteitscontrole mogelijk van gemetaboliseerde identificatie op basis van gegevensonafhankelijke acquisitiegegevens die een robuustere spectrale bibliotheek van het referentiespectrum construeren met behulp van de spectrummatchingresultaten op basis van FDR-controle.