Een efficiënt protocol om ERK-activiteitsmodulatie te beoordelen in vroege zebravismodellen van het Noonan-syndroom via live FRET-microscopie en immunofluorescentie

We ontwikkelen een zebravismodel van complexe ontwikkelingsziekten, waarbij patiëntsequencing wordt gekoppeld aan functionele genomica, ter ondersteuning van variantinterpretatie en ook preklinische geneesmiddelentests. Ondanks verbeterde FRET-sensoren ontbreken robuuste in vivo assays die subtiele pathogene veranderingen van Ras-MAPK-signalering met voldoende ruimtelijke gevoeligheid detecteren. Om te beginnen plaats je de aangepaste microinjectieplaat met gegoten 2%agarose in E3-medium op een werkplatform.

Rangschik en lijn bevruchte tienerzebravis-eieren in de plaat op geschikte banen om de eierbeweging tijdens micro-injectie te beperken. Laad de naald terug met twee microliter injectiemateriaal met een microloaderpipet. Pas de druk- en tijdsinstellingen aan om elke injectie te kalibreren op basis van de naald en embryokwaliteit op het micro-injectieapparaat.

Injecteer de oplossing in het eencelstadium van tienerzebravisembryo's. Kweek gemicroïnjecteerde tienerembryo's onder gecontroleerde verzorgingsomstandigheden. Maak binnen drie uur na afzetting alle eieren schoon die troebel of degenereerd lijken.

Ongeveer vier uur na bevruchting, met een standaard fluorescentie-stereomicroscoop, ingesteld op een golflengtebereik van 465 tot 500 nanometer. Screen de embryo's op fluorescentie-rapportageexpressie. Selecteer tiener-positieve vissen voor FRET-beeldvorming en reserveer negatieve broers en zussen voor immunohistochemische beoordelingen.

Plaats embryopools van gelijke aantallen in verschillende putten van een zes-put plaat. Om de behandeling te starten, dompel je de embryo's onder in drie milliliter E3-medium met voertuigcontrole als DMSO of verdund MEK bij de gewenste concentratie. Om te beginnen smelt je de 1,5% tot 2% laagsmeltende agarose aliquot in een ThermoMixer bij 50 graden Celsius.

Na opgeloste temperatuur verlaag je de temperatuur tot ongeveer 30 graden Celsius. Plaats een enkel geïnjecteerd tiener-positief embryo in het midden van een 35-millimeter glazen bodemschaal voor live beeldvorming. Verwijder overtollig E3-medium en voeg een druppel laagsmeltende agarose toe om het embryo te immobiliseren.

Laat de agarose polymeriseren bij kamertemperatuur. Zet de incubatorcontroller minstens één uur voor de verwerving aan en stel de temperatuur in op 28 graden Celsius om de gezondheid van het embryo te behouden. Zodra de broedmachine gestabiliseerd is, plaats je de beeldvormingsschotel met het embryo op de monsterhouder en gebruik je een 10x droge objectief om het monster te visualiseren.

Zet de argonionlaser aan en stel het laservermogen in op 50%. In Hardware-instellingen kies je een acht-bits diepteresolutie om beelden te maken. Selecteer vervolgens in het Acquisitiepaneel de spectrale detectiemodus xy, gamma, lambda, z en stel het formaat beeld in op 512 bij 512 pixels, scansnelheid van 400 hertz en optische zoom van 0,75. Activeer de 458-nanometer laserlijn van de argonionenlaser en stel de intensiteitswaarde in op 8,5%. Selecteer vervolgens een hybride detector en stel de gevoeligheid in op een versterkingswaarde van 500.

Open het dropdownmenu in de detectorbalk om het cyaanfluorescentie-eiwit of ECFP-emissiecurve te selecteren. Om de YPET-emissiecurve weer te geven, activeer je een tweede detector. Selecteer vervolgens de gele fluorescentieproteïne YFP-emissiecurve.

Om live opnames te starten, plaats je de detectiecursor in het bereik van het meest intense YFP-signaal om het monster te visualiseren. Stel de begin- en eindposities van de monsterdikte in in het Z-Stack LASX-venster. Stel de gammascan-bereik in om te beginnen bij 460 nanometer en te eindigen bij 570 nanometer van het detectiebereik.

Definieer de detectiebandbreedte als vijf nanometer en de scan-stapgrootte als vijf nanometer. Begin met z-stack acquisitie. Voeg twee aangepaste referentieemissiespectra voor CFP en YFP in en sla deze op in de kleurstofdatabase die beschikbaar is in het configuratievenster om spectrale doorbloeding uit te sluiten.

Selecteer het resulterende spectrale beeldbestand uit de beeldsessie en open het procesvenster. Selecteer vervolgens in het kleurstofscheidingsgereedschap Spectral Dye Separation en configureer de instellingen voor de kleurstofscheiding. Selecteer in de dropdownlijsten aan de linkerkant van de dialoog het nieuwe CFP-emissiespectrum op de eerste plaats en het nieuwe YFP-emissiespectrum uit de spectrumdatabase.

In de gamma-scan van de beelden identificeer je het beeld met de hoogste signaalintensiteit. Vervolgens beweeg je langs de z-scan om het optische gedeelte te selecteren dat het interessegebied op de margezone markeert. Activeer de ROI-selectiemodus op de randzone van de dierenpaal om het gebied met het beste spectrum te definiëren.

Klik op het ROI-kruisvizier in het displayvenster en stel de grootte van de referentie-ROI aan op 40 voxels in het meetgebied. Open het nieuw gegenereerde bestand met de twee gescheiden kanalen. Maak een tweedimensionaal projectiebeeld uit de driedimensionale beeldreeks met behulp van de maximale intensiteitsprojectie.

Selecteer in het Procesvenster 'bijsnijden' om kanalen te scheiden in twee aparte bestanden, het kanaal één en kanaal twee kanalen. Selecteer in het Procesvenster Afbeeldingen combineren, selecteer vervolgens het kanaal twee-bestand en voeg het in de eerste optie in. Selecteer vervolgens het channel one-bestand en voeg het in in de tweede optie.

Stel een herschaling in met factor vijf en kies de ratio-operatie. Klik op Apply om het nieuwe bestand te genereren met de ratio metric afbeelding. Sla het bestand op voor data-analyse.

Importeer de spectrale beeldvormings- en kleurstofseparatiebestanden in de open-source Fiji-software voor analyse. Configureer parameters voor uitleesmetingen in Fiji met behulp van Analyze and Set Measurements. Selecteer gebied, geïntegreerde dichtheid en gemiddelde grijswaarde als de parameters van interesse.

Met behulp van het polygonselectiegereedschap uit de werkbalk selecteer je het interessegebied dat overeenkomt met de marge van de gastrula. Klik achtereenvolgens op Analyze, Tools en ROI Manager om de ROI xy-specificaties op te slaan. Om metingen uit te voeren in een geselecteerde ROI, klik je op Analyseren en Meten.

Organiseer de FRET-per-CFP-ratiowaarden voor elke ROI in een werkblad met experimentele groepen in kolommen en ruwe waarden in rijen. Voor een enkele biologische replica maakt u een kolomtabel met één groepsvariabele, waarbij elke groep wordt gedefinieerd door een kolom. Aan het einde van de gastrulatie fixeer je de embryo's door onderdompeling in 4%-paraldehyde, bereid in PBS gedurende 20 minuten op kamertemperatuur.

Na de fixatie was je de embryo's meerdere keren met PBS. Met een pastorpipette oriënteren we de embryo's lateraal in een enkele put van een plaat met 12 putten vol verse PBS. Met een stereomicroscoop met een 2,7x vergroting objectief, 0,63x scanobjectief en 8,6 zoomfactor maakt u de beelden in een brightfield-modus om de aanwezigheid van een ovale vorm te evalueren.

Importeer de vastgelegde embryo-afbeelding in Fiji-software. Om de lengte van de assen van het embryo te meten, selecteer je het rechte gereedschap in de werkbalk en klik je op Analyseren, gevolgd door Meten. Na het uitvoeren van geselecteerde metingen voeg je deze toe aan de ROI-managerlijst en sla je het ROI-bestand op.

Exporteer de gegevens naar een werkblad. Bereken de assenverhouding door de lengte van de hoofdas te delen door de lengte van de kleine as. Bereken het gemiddelde, de standaardafwijking van het gemiddelde, of de standaardfout van het gemiddelde van verschillende replicatieën.

Onze live FRET-pijplijn in zebravissen maakt vroeggevoelige detectie van pathogene ERK-signaalactivatie mogelijk, ondersteunt variantinterpretatie en test van de efficiëntie van MEK-remmers.