Mycobacteriële DNA-extractie met behulp van kralen kloppen in aangepaste buffer gevolgd door NGS-workflow

Ons diagnostisch onderzoek richt zich op het verbeteren van de detectie van geneesmiddelresistentie bij tuberculose in omgevingen met beperkte middelen, met een focus op snelheid en pragmatisme. In de tbc-diagnostiek zijn er uitgebreidere genotypische tests en zelfs een aantal nieuwe snelle fenotypische tests, en er zijn consistente inspanningen om deze tests dichter bij het zorgpunt te krijgen. Maar er zijn nog steeds een aantal pragmatische barrières.

Uitdagingen op het gebied van hulpbronnen, van reagentia tot infrastructuur tot logistiek, blijven aanzienlijke barrières. Met alles wat verder gaat dan de technische verfijning van een Cepheïde Xpert-test, is protocolstandaardisatie moeilijk in verschillende omgevingen. Dus MTB-DNA-extractie, zoals beschreven in dit werk hier, is daar een goed voorbeeld van.

Er is een kritieke behoefte om op sequencing gebaseerde tbc-diagnostiek uit te breiden, maar veel laboratoria missen nog steeds een betrouwbare manier om DNA van hoge kwaliteit te extraheren. Ons doel is om een methode te delen die eenvoudig, praktisch en geschikt is voor point-of-care-omgevingen met weinig middelen. Hier presenteren we een eenvoudig, goedkoop protocol dat is ontworpen voor gebruik in omgevingen met beperkte middelen.

Het is gevalideerd voor NGS-toepassingen en is compatibel met geautomatiseerde vloeistofbehandelingssystemen. Combineer om te beginnen natriumchloride-oplossing Tris hydrochloridebuffer, Triton X 100 en EDTA om de Triton-buffer te maken. Meng al roerend en voeg ultrapuur water toe tot een eindvolume van 100 milliliter.

Filter steriliseer de buffer voor gebruik. Bereid vervolgens 100 milliliter Tris-EDTA-buffer met een laag EDTA-gehalte voor door een milliliter Tris-HCl met één molair en 20 microliter EDTA met 0,5 molair te combineren. Meng en vul met ultrapuur water om een eindvolume van 100 milliliter te bereiken.

Filter vervolgens de buffer steriliseren. Om de lysisbuizen voor te bereiden, gebruikt u een scalpelmes om voorzichtig de bodem van een buis met schroefdop van 1,5 milliliter af te snijden, net onder het buigpunt. Snijd de punt van een P1000 pipetpunt af en maak een V-vormige wig aan het uiteinde.

Klem de afgeknipte onderkant van de schroefdop in de V-vormige pipetpunt om een schep te vormen. Vul een steriele container met zirkoniumsilicaatkorrels van 0,1 millimeter. Breng met behulp van de voorbereide schep ongeveer 200 milligram kralen over in buisjes met schroefdop van 1.5 milliliter.

Breng voor de bereiding van de bacteriële celcultuur vijf milliliter mycobacterium tuberculosis-cultuur over in een conische centrifugebuis van 15 milliliter. Centrifugeer het gedurende 10 minuten op maximale snelheid. Gebruik nu een serologische pipet van 10 milliliter om voorzichtig alles behalve ongeveer 500 microliter van het bovenstaande te verwijderen zonder de pellet te verstoren.

Gebruik een P1000-pipet om het resterende supernatant te verwijderen. Resuspendeer de pellet in 350 microliter op maat gemaakte tritonbuffer en meng vervolgens goed door op en neer te pipetteren. Verwarm het monster in een droog warmtebad gedurende 30 minuten op 95 graden Celsius.

Om het sputum voor te bereiden, brengt u één tot vijf milliliter sputummonster over in een steriele centrifugebuis van 50 milliliter. Om Dithiothreitol liquefactie uit te voeren, voegt u vier volumes 10-millimolaire Dithiothreitol toe aan het sputummonster en vortex vervolgens grondig gedurende 30 seconden. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten op maximale snelheid.

Gebruik vervolgens een serologische pipet van 10 milliliter om alles behalve 500 microliter van het supernatant weg te gooien. Verwijder de rest van het bovenstaande met een P1000-pipet zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer de pellet in 350 microliter op maat gemaakte tritonbuffer.

Om de NALC-natriumhydroxidevloeibaarmaking uit te voeren, voegt u vier volumes van de NALC-natriumhydroxideoplossing toe aan het sputummonster. Draai het mengsel gedurende 30 seconden. Incubeer de buis vervolgens zeven minuten bij kamertemperatuur.

Voeg nu PBS toe tot de 50 milliliter. Draai de inhoud van de buis om goed te mengen en centrifugeer de buis vervolgens gedurende 10 minuten op maximale snelheid. Gooi na het centrifugeren met een serologische pipet van 50 milliliter het bovenstaande weg, zoals eerder aangetoond.

Resuspendeer de pellet vervolgens in 350 microliter aangepaste tritonbuffer. Breng eerst 350 microliter geïnactiveerd monster over in een geëtiketteerde buis met schroefdop van 1,5 milliliter met 250 microliter zirkoniumsilicaatkorrels van 0,1 millimeter. De kraal versloeg het lysaat met 6,5 meter per seconde gedurende 45 seconden met twee minuten rust tussen de cycli.

Centrifugeer het monster gedurende twee minuten op maximale snelheid en breng vervolgens 150 microliter van het bovenstaande over in een nieuw gelabelde buis. Vervolgens worden magnetische kralen opgeruimd die gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur zijn gelijkgesteld, om ze opnieuw te suspenderen. Breng 180 microliter magnetische kralen over op het DNA-monster.

Pipel 10 keer op en neer om te mengen. Na een incubatie van twee minuten bij kamertemperatuur plaatst u de buis op een magnetisch rek en wacht u twee minuten totdat de oplossing is verdwenen. Gebruik vervolgens een pipet van 200 microliter om het supernatant weg te gooien.

Terwijl de buis nog op het magnetische rek zit, voeg je 500 microliter vers bereide 70% ethanol toe langs de tegenoverliggende muur en wacht je 30 seconden. Verwijder aan het einde van de laatste wasbeurt de resterende ethanol met een pipet van 10 microliter en laat deze twee minuten aan de lucht drogen. Zodra de kralen ondoorzichtig worden, haal je de koker uit het magnetische rek.

Resuspendeer in 20 microliter lage EDTA Tris-buffer. Meng door pipetteren of vortexen om ervoor te zorgen dat alle parels in oplossing zijn voordat ze vijf minuten bij kamertemperatuur worden geïncubeerd. Plaats de buis vervolgens twee minuten op een magnetisch rek tot deze leeg is.

Breng vervolgens minder dan 20 microliter van het geëlueerde DNA over naar een nieuw gelabeld buisje om overdracht van kralen te voorkomen. Om mycobacterieel DNA te kwantificeren met behulp van een kwantitatieve PCR gericht op 99 nucleotiden van de mycobacteriële atpE, stelt u een QPCR-mastermix op ijs samen. Pas de mastermix aan op basis van het aantal samples en de standaarden, inclusief een overschrijding van 10% om rekening te houden met pipetteerverlies.

Laat de thermische cycler 60 seconden lang 95 graden Celsius draaien, gevolgd door 35 cycli van 95 graden Celsius gedurende 10 seconden en 60 graden Celsius gedurende 30 seconden met een hellingssnelheid van 2.11 graden Celsius per seconde. Voer alle samples, standaarden en besturingselementen in drievoud uit. Hier leverden mycobacterium tuberculosis-culturen de hoogste DNA-concentraties op van alle geteste aandoeningen.

Spiked sputummonsters vertoonden steeds lagere DNA-opbrengsten en verhoogde variatie met afnemende bacteriële input, vooral in de groep van 10.000 bacteriën.