Name: Mycobacteriële DNA-extractie met behulp van kralen kloppen in aangepaste buffer gevolgd door NGS-workflow (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Leer een snelle DNA-extractiemethode voor Mycobacterium tuberculosis met kralenkloppen en DNA-capturebeads. Dit protocol is geoptimaliseerd voor next-generation sequencing en geschikt voor laboratoria met beperkte middelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Jouet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+amplicon+sequencing+for+culture-free+prediction+of+susceptibility+or+resistance+to+13+anti-tuberculous+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Deep amplicon sequencing for culture-free prediction of susceptibility or resistance to 13 anti-tuberculous drugs.</a> Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).</li>
<li>George, S., et al. DNA Thermo-Protection Facilitates Whole Genome Sequencing of Mycobacteria Direct from Clinical Samples by the Nanopore Platform. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGeorge%2C+S+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2020).</li>
<li>Doyle, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+whole-genome+sequencing+of+sputum+accurately+identifies+drug-resistant+mycobacterium+tuberculosis+faster+than+MGIT+culture+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct whole-genome sequencing of sputum accurately identifies drug-resistant mycobacterium tuberculosis faster than MGIT culture sequencing.</a> J Clin Microbiol. 56 (8), e00666-e00718 (2018).</li>
<li>Noordhoek, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+Specificity+of+PCR+for+Detection+of+Mycobacterium+Tuberculosis%3A+A+Blind+Comparison+Study+among+Seven+Laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and Specificity of PCR for Detection of Mycobacterium Tuberculosis: A Blind Comparison Study among Seven Laboratories.</a> J Clin Microbiol. 32, (1994).</li>
<li>Jaber, M., Rattan, A., Verma, A., Tyagi, J., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+DNA+extraction+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tubercle+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">A simple method of DNA extraction from Mycobacterium tuberculosis.</a> Tubercle Lung Dis. 76 (6), 578-581 (1995).</li>
<li>Käser, M., Ruf, M. T., Hauser, J., Marsollier, L., Pluschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+method+for+preparation+of+DNA+from+pathogenic+and+environmental+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimized method for preparation of DNA from pathogenic and environmental mycobacteria.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (2), 414-418 (2009).</li>
<li>De Almeida, I. N., Da Silva Carvalho, W., Rossetti, M. L., Costa, E. R. D., De Miranda, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Six+Different+DNA+Extraction+Methods+for+Detection+of+Mycobacterium+Tuberculosis+by+Means+of+PCR-IS6110%3A+Preliminary+Study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Six Different DNA Extraction Methods for Detection of Mycobacterium Tuberculosis by Means of PCR-IS6110: Preliminary Study.</a> BMC Res Notes. 6, 561(2013).</li>
<li>Pan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+DNA+extraction+methods+for+detecting+Mycobacterium+tuberculosis+by+real-time+PCR+and+its+clinical+application+in+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of four DNA extraction methods for detecting Mycobacterium tuberculosis by real-time PCR and its clinical application in pulmonary tuberculosis.</a> J Thorac Dis. 5 (3), 251-257 (2013).</li>
<li>Kelly-Cirino, C., Niles, J., Ray, B., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKelly-Cirino%2C+C+%22Maximizing+Mycobacterium+Tuberculosis+DNA+Yield+for+Molecular+Methods+with+PrepIT.MAX%22">Maximizing Mycobacterium Tuberculosis DNA Yield for Molecular Methods with PrepIT.MAX</a>. PD-WP-00045 (Issue 2/2015-11), Accessed January 27 (2020).</li>
<li>Votintseva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Same-day+diagnostic+and+surveillance+data+for+tuberculosis+via+whole-genome+sequencing+of+direct+respiratory+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Same-day diagnostic and surveillance data for tuberculosis via whole-genome sequencing of direct respiratory samples.</a> J Clin Microbiol. 55 (5), 1285-1298 (2017).</li>
<li>Odumeru, J., Gao, A., Chen, S., Raymond, M., Mutharia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Bead+Beater+for+Preparation+of+Mycobacterium+Paratuberculosis+Template+DNA+in+Milk%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Use of the Bead Beater for Preparation of Mycobacterium Paratuberculosis Template DNA in Milk.</a> Can J Vet Res. 65 (4), 201-205 (2001).</li>
<li>Oh, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Effective+Method+of+RNA+Extraction+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An Effective Method of RNA Extraction from Mycobacterium tuberculosis.</a> Ann Clin Microbiol. 19 (1), 20-23 (2016).</li>
<li>Miyata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+quality+of+dna+extracted+by+two+techniques+from+mycobacterium+tuberculosis+for+fast+molecular+identification+and+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of the quality of dna extracted by two techniques from mycobacterium tuberculosis for fast molecular identification and genotyping.</a> Braz J Microbiol. 42 (2), 774-777 (2011).</li>
<li>Votintseva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+DNA+extraction+for+whole-genome+sequencing+from+early+positive+liquid+%28MGIT%29+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial DNA extraction for whole-genome sequencing from early positive liquid (MGIT) cultures.</a> J Clin Microbiol. 53 (4), 1137-1143 (2015).</li>
<li>Kolia-Diafouka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Lysis-Extraction+Method+Combined+With+IS6110-Amplification+for+Detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+Paucibacillary+Sputum+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimized Lysis-Extraction Method Combined With IS6110-Amplification for Detection of Mycobacterium tuberculosis in Paucibacillary Sputum Specimens.</a> Front Microbiol. 9, 2224(2018).</li>
<li>Bonnet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Evaluation+of+GeneLEAD+VIII+DNA+Platform+Combined+to+Deeplex+Myc-TB+Assay+to+Detect+in+8+Days+Drug+Resistance+to+13+Antituberculous+Drugs+and+Transmission+of+Mycobacterium+tuberculosis+Complex+Directly+From+Clinical+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Evaluation of GeneLEAD VIII DNA Platform Combined to Deeplex Myc-TB Assay to Detect in 8 Days Drug Resistance to 13 Antituberculous Drugs and Transmission of Mycobacterium tuberculosis Complex Directly From Clinical Samples.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 707244(2021).</li>
<li>Mann, B. C., et al. Systematic review and meta-analysis of protocols and yield of direct from sputum sequencing of Mycobacterium tuberculosis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMann%2C+BC+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Schwab, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+evaluation+of+nanopore+targeted+next-generation+sequencing+to+predict+drug-resistant+tuberculosis+from+native+sputum+in+South+Africa+and+Zambia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Field evaluation of nanopore targeted next-generation sequencing to predict drug-resistant tuberculosis from native sputum in South Africa and Zambia.</a> J Clin Microbiol. 63 (3), e0139024(2025).</li>
<li>Colman, R. E., Seifert, M., De la Rossa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+culture-free+targeted+next-generation+sequencing+for+diagnosing+drug-resistant+tuberculosis%3A+a+multicentre+clinical+study+of+two+end-to-end+commercial+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluating culture-free targeted next-generation sequencing for diagnosing drug-resistant tuberculosis: a multicentre clinical study of two end-to-end commercial workflows.</a> Lancet Infect Dis. 25 (3), 325-334 (2025).</li>
<li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-On-Magnetic-Beads+%28BOMB%29%3A+Open+platform+for+high-throughput+nucleic+acid+extraction+and+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB): Open platform for high-throughput nucleic acid extraction and manipulation.</a> PLoS Biol. 17 (1), e3000107(2019).</li>
<li>Limberis, J. D., Metcalfe, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turbolysis%3A+A+low-cost%2C+small+footprint+alternative+to+commercial+bead+beaters+for+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22HardwareX%22%5BJournal%5D)">Turbolysis: A low-cost, small footprint alternative to commercial bead beaters for cell lysis.</a> HardwareX. 19, e00576(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.1 mm Zirconia-Silicate Beads</td><td>Biospec Products</td><td>11079101z</td><td>Kralen gebruikt voor de kralenklopstap om mycobacteriële cellen te lyseren</td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Magneetkralen voor DNA-opruiming na lysis</td></tr><tr><td>EDTA (0,5M, pH 8,0)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td>Aangepaste Triton/Low EDTA Buffer Componenten</td></tr><tr><td>Fastprep 24</td><td>MPbio, USA</td><td>116004500</td><td>Apparatuur voor kralenkloppen met 6,5 m/s</td></tr><tr><td>Forward Primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Aangepaste synthese</td><td>Primersequentie: AATTCCTGGTGTAGCGGTGG</td></tr><tr><td>H2O (Water, moleculaire biologie kwaliteit)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2819-1</td><td>Aangepaste Triton/Low EDTA Buffer Componenten</td></tr><tr><td>Luna Universal Probe</td><td>New England Biolabs</td><td>M3004</td><td>qPCR reagens voor Mycobacterium DNA enumeratie</td></tr><tr><td>MycoPrep Kit</td><td>BD</td><td>SKU/REF 240863</td><td>BD MycoPrep Specimen Digestion voor NALC-NaOH Sputum Verwerking</td></tr><tr><td>NaCl (Natriumchloride, 5M oplossing)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9759</td><td>Aangepaste Triton/Low EDTA Buffer Componenten</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Millipore Sigma</td><td>P2272</td><td>Sputum Verwerking</td></tr><tr><td>Reverse Primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Aangepaste synthese</td><td>Primersequentie: GTTTACGGCGTGGACTACCA</td></tr><tr><td>TaqMan Probe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Aangepaste synthese</td><td>Probe sequentie: AGGAGGAACACCGGTGGCGA</td></tr><tr><td>Tris-HCl (1M, pH 8,0)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td>Aangepaste Triton/Low EDTA Buffer Componenten</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28314</td><td>Aangepaste Triton/Low EDTA Buffer Componenten</td></tr></tbody></table>

mycobacteriële dna-extractie met behulp van kralen kloppen in aangepaste buffer gevolgd door ngs-workflow

Mycobacterial DNA Extraction using Bead Beating in Custom Buffer Followed by NGS Workflow

Mycobacteriële DNA-extractie met behulp van kralen kloppen in aangepaste buffer gevolgd door NGS-workflow

Tuberculosis is a deadly disease, and the emergence of antibiotic drug resistance in the causative agent bacterium, Mycobacterium tuberculosis, worsens ...

mycobacterial-dna-extraction-using-bead-beating-custom-buffer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De vergelijking en optimalisatie van twee organellaire DNA-verrijkingsmethoden worden voorgesteld: traditionele differentiële centrifugatie en fractionering van het totale gDNA op basis van methyleringsstatus. We beoordelen de resulterende DNA-hoeveelheid en kwaliteit, tonen de prestaties aan bij korte-leesvolgorde-sequencing, en bespreken het potentieel voor gebruik bij langlezen single-molecule sequencing.

Optimalisatie en Vergelijkende Analyse van Plant Organellaire DNA Verrijkingsmethoden Geschikt voor Volgend Sequencing

Nanopore technologie voor sequencing biomoleculen heeft brede toepassingen in de biowetenschappen, met inbegrip van de identificatie van ziekteverwekkers, voedsel veiligheid controle genomic analyse, metagenomic milieumonitoring en karakterisering van bacteriële resistentie tegen antibiotica. In dit artikel wordt de procedure voor het rangschikken van het DNA van de bodem van het metagenomic voor soorten identificatie met behulp van de technologie van het rangschikken nanopore aangetoond.

Nanopore DNA rangschikkend voor Metagenomic bodemanalyse

Hier beschrijven we een protocol om amplicon reeks gegevens van bodem, rhizosfeer en wortel endosphere microbiomes te verkrijgen. Deze informatie kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de samenstelling en de diversiteit van de plant-geassocieerde microbiële gemeenschappen, en is geschikt voor het gebruik met een breed scala van plantensoorten.

Verkennen van de wortel Microbiome: extraheren van gegevens van de bacteriële Gemeenschap uit de bodem, de rhizosfeer, en de wortel Endosphere

Lange-lezen sequenties vergemakkelijken aanzienlijk de assemblage van complexe genomen en karakterisering van structurele variatie. Beschrijven we een methode voor het genereren van ultra lange reeksen door sequentiebepaling nanopore gebaseerde platformen. De benadering neemt een geoptimaliseerde DNA-extractie, gevolgd door de gewijzigde bibliotheek preparaten voor het genereren van honderden kilobase leest met gematigde dekking van menselijke cellen.

Ultra lange lezen Sequencing voor hele Genomic DNA-analyse

Hier beschreven is een vereenvoudigde standaard werkings procedure voor microbiome profilering met behulp van 16S rRNA metagenomic sequencing en analyse met behulp van vrij beschikbare instrumenten. Dit protocol zal onderzoekers die nieuw zijn in het microbiome veld en degenen die updates vereisen over methoden om bacteriële profilering bij een hogere resolutie te bereiken helpen.

Microbiota-analyse met behulp van twee-stap PCR en de volgende generatie 16S rRNA Gensequencing

Hier wordt een DNA-extractieprotocol beschreven met behulp van magnetische kralen om DNA-extracties van hoge kwaliteit van muggen te produceren. Deze extracties zijn geschikt voor een downstream next-generation sequencing benadering.

Een op magnetische kraal gebaseerd mosquito-DNA-extractieprotocol voor sequencing van de volgende generatie

Genexpressie wordt gereguleerd door interacties van genpromotors met distale regulerende elementen. Hier beschrijven we hoe low input Capture Hi-C (liCHi-C) de identificatie van deze interacties in zeldzame celtypen mogelijk maakt, die voorheen niet meetbaar waren.

Een geïntegreerde workflow om de promotor-centrische spatio-temporele genoomarchitectuur in schaarse celpopulaties te bestuderen

We presenteren een geoptimaliseerde methode voor DNA-extractie uit ontsmet sputum met behulp van een matrix-gebaseerde extractiemethode in combinatie met een magnetische parelzuivering voor downstream gerichte next-generation sequencing van Mycobacterium tuberculosis.

Matrix-gebaseerde DNA-extractie voor gerichte sequencing van de volgende generatie op ontsmette sputummonsters

Dit protocol beschrijft de CTAB-methode om hoogwaardige DNA uit mycobacteriën te extraheren, waarbij de uitdagingen van hun harde, mycolinezuurrijke celwanden worden overwonnen. Het proces omvat enzymatische vertering, cellysie met CTAB en DNA-zuivering door organische extractie en ethanolprecipitatie. Deze methode produceert DNA dat geschikt is voor moleculaire studies en is betrouwbaar voor mycobacterieel onderzoek.

Extractie van het volledige genoom van deoxyribonucleïnezuur uit Mycobacterium-soorten via de Cetyltrimethylammoniumbromide-techniek

Hier presenteren we een protocol om sequencing van het hele genoom van bacteriële seksueel overdraagbare aandoeningen uit klinische monsters mogelijk te maken met behulp van doelverrijking. Deze nieuwe, syndromale panelgebaseerde methode overwint de uitdagingen van overvloedig menselijk DNA en lage bacteriële belasting, waardoor genomische surveillance voor Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum en Mycoplasma genitalium wordt vergemakkelijkt.

Genereren van hele bacteriële genomen uit klinische monsters met behulp van een workflow voor doelverrijking

De huidige studie beschrijft een workflow voor nanoporesequencing van plasmiden wanneer de chromosomale sequentie al bekend is of niet van belang is. Een initiële plasmide-DNA-verrijkingsstap zorgt voor een optimale plasmidesequentiediepte en maximaliseert het aantal monsters dat per flowcel kan worden gesequenced.

Long-read plasmidvolgordebepaling en assemblage met behulp van op nanopore sequencing gebaseerde workflows

Leer een snelle DNA-extractiemethode voor Mycobacterium tuberculosis met kralenkloppen en DNA-capturebeads. Dit protocol is geoptimaliseerd voor next-generation sequencing en geschikt voor laboratoria met beperkte middelen.

Mycobacteriële DNA-extractie met behulp van kralen kloppen in aangepaste buffer gevolgd door NGS-workflow

Meer video's verkennen