Gestandaardiseerde modulaire assemblage van polycistronische operons met modulair klonen (MoClo) met behulp van de In-Cloning toolkit
2 september 2025
In dit artikel wordt een stapsgewijs protocol gepresenteerd dat laat zien hoe modulair klonen (MoClo) kan worden aangepast voor het klonen van polycistronische operonen.
Ik ontwikkelde methoden die modulaire DNA-assemblage mogelijk maken van kleine individuele moleculaire delen tot chromosoomgrootte-constructen, en om cellen te herprogrammeren met deze kunstmatige chromosomen. Een belangrijke innovatie in het veld is de ontwikkeling van modulaire kloontoolkits die de modulaire assemblage van multi-genconstructies mogelijk maken uit een bibliotheek van gestandaardiseerde moleculaire onderdelen. Modulaire kloontoolkits zijn doorgaans ontworpen om monocistronische transcriptie-eenheden te klonen.
Dit protocol demonstreert een generaliseerbare manier voor de assemblage van polycistronische transcriptie-eenheden met de in-cloning toolkit. Deze strategie van het klonen van een polycistronische transcriptie-eenheid maakt het mogelijk om coderingssequenties flexibel te gebruiken in zowel een individuele transcriptie-eenheid als in polycistronische arrangementen. Om te beginnen selecteert u de Level 0-onderdelen die in een transcriptie-eenheid worden samengevoegd.
Deze moeten ten minste een RBS, een coderingsreeks en een terminator bevatten. Kies de positie waarin de transcriptie-eenheid in operon wordt samengesteld. Op basis van de gekozen positie selecteer je het bijbehorende acceptorplasmid en simuleer je de Golden Gate-assemblage in SnapGene.
In de Golden Gate-reactie gebruik je het enzym SAP1 om de ribosoombindingsplaats, coderingssequentie en terminator los te maken van hun respectievelijke plasmiden en snijd je het acceptorplasmide open. Assembleer de ribosoombindingsplaats, coderingssequentie en terminator in het cut acceptor plasmide. Vervolgens voor de Golden Gate-reactie gebruik je een pipet om 50 femtomolen van elke gewenste insert en 50 femtomolen van het acceptorplasmide toe te voegen.
Eén microliter elk van 10x T4 DNA-ligasebuffer, T4-ligase en SAP1 in een reactiebuis. Voeg vervolgens nucleasevrij water toe om het uiteindelijke volume op 10 microliter te brengen. Plaats de buis in een thermocycler.
Voer 25 cycli van 37 graden Celsius gedurende drie minuten uit, 16 graden Celsius gedurende vier minuten en 50 graden Celsius gedurende 20 minuten. Daarna inactiveren we de enzymen bij 80 graden Celsius gedurende 20 minuten. Optioneel pipetten 0,5 microliter SAP1 op de GG-reactie en incubeer je bij 37 graden Celsius gedurende een uur.
Pipetteer vijf microliter van de reactie tot 50 microliter chemisch competente E.coli-cellen. Voer een hitteschoktransformatie uit door de buis 30 seconden in een waterbad te dompelen bij 42 graden Celsius, en plaats de buis vervolgens twee minuten op ijs. Vervolgens incubeer je de cellen in één milliliter medium gedurende een uur om het herstel te bevorderen.
Plaat 100 microliter van de transformatie groeit uit op een LB-boorplaat met 100 microgram per milliliter ampicilline. Breng de plaat een nacht uit bij 37 graden Celsius. De volgende dag kies je twee witte kolonies met een inoculatielus of een pipetpunt.
Inoculeer elk in vijf milliliter LB-medium met 100 microgram ampicilline per milliliter. Broed 's nachts uit bij 37 graden Celsius in een schuddende broedmachine met 250 omwentelingen per minuut. Voer een geruite extractie uit volgens de instructies van de fabrikant.
Verteer één microgram geëxtraheerd plasma-DNA door één microliter 10x verteringsbuffer en één microliter BBS1 toe te voegen. Voeg nucleasevrij water toe om het totale volume op 10 microliter te brengen en incubeer. Laad nu het verteerde plasmide op een 1%agarosegel en laat elektroforese 35 minuten op 100 volt draaien.
Maak vervolgens een afbeelding van de gel en bevestig de juiste assemblage van het plasmide. Om een Level M-constructie samen te stellen, kies je de Level 1 transcriptie-eenheden die geassembleerd moeten worden. Simuleer de Golden Gate-assemblage door de eerste en tweede transcriptie-eenheid en de eindlinker los te laten met behulp van het enzym BBS1.
Tegelijkertijd snijd je het acceptorplasmide open en assembleer je vervolgens alle drie de delen tot het acceptorplasmide om de polycistronische transcriptie-eenheid te vormen. De negatieve controle voor Level 1 plasmide-assemblage, die geen terminator-onderdeel had, leverde geen kolonies op, terwijl de volledige reactie 292 witte kolonies en geen rode kolonies opleverde. De assemblage van het multi-gen-construct zonder de tweede cassette bij 37 graden Celsius leverde slechts twee witte kolonies op, terwijl de volledige assemblage negen grote kolonies en 435 kleine kolonies opleverde.
Bij 30 graden Celsius leverde de negatieve controle voor multi-genassemblage vier witte kolonies op, terwijl de volledige reactie meer dan 1.500 kolonies opleverde. De BSA1-digest van het acceptorplasmide PMA60 geeft de verwachte enkelbandige band van 5.500 basenparen. BSA1-vertering van plasmiden uit 24 kolonies toonde aan dat 23 van de 24 het juiste restrictiepatroon van twee banden vertoonden, ongeveer 4.300 basenparen en 1.700 basenparen.
Fluorescentiebeeldvorming toonde sterke groene en cyaan fluorescentie in kolonies van platen met de OC6-inducer, terwijl platen zonder inducer minimale of geen fluorescentie vertoonden.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een stapsgewijs protocol waarin wordt gedemonstreerd hoe Modular Cloning (MoClo) kan worden aangepast voor het kloneren van polycistronische operons. Het protocol maakt de assemblage van multi-gen constructen mogelijk vanuit gestandaardiseerde moleculaire onderdelen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Modulaire klonering
- Genetische modificatie
- Moleculaire biologie
Achtergrond
- Modulaire cloning-toolkits maken de assemblage van transcriptie-eenheden mogelijk.
- Traditionele methoden richten zich op monocistronische transcriptie-eenheden.
- Dit protocol speelt in op de behoefte aan polycistronische arrangementen.
- Flexibiliteit in coderende sequenties verbetert toepassingen binnen de genetische manipulatie.
Doel van de studie
- Om een protocol te demonstreren voor het assembleren van polycistronische transcriptie-eenheden.
- Om een generaliseerbare methode te bieden voor het gebruik van modulaire kloon-toolkits.
- Om het gebruik van coderende sequenties in verschillende configuraties te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Selectie van Level 0-onderdelen voor de assemblage van de transcriptie-eenheid.
- Gebruik van een in-cloning toolkit voor assemblage.
- Stapsgewijs protocol voor kloningsprocessen.
- Demonstratie van flexibiliteit in de arrangementen van transcriptie-eenheden.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle assemblage van polycistronische transcriptie-eenheden.
- Aantoonbare flexibiliteit in de rangschikking van coderende sequenties.
- Het protocol kan worden aangepast voor diverse genetische constructen.
- Verbeterde mogelijkheden voor modulair kloneren voor onderzoekers.
Conclusies
- Het protocol biedt een waardevol instrument voor genetische manipulatie.
- Modulaire klonering kan effectief worden ingezet voor polycistronische constructen.
- Toekomstige toepassingen kunnen het gebruik van deze methode in het onderzoek uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
De gestandaardiseerde modulaire assemblage van polycistronische operons met behulp van MoClo en de In-Cloning toolkit pakt een belangrijk knelpunt in de synthetische biologie en microbiële engineering aan door de snelle, reproduceerbare constructie van multi-gen pathways mogelijk te maken. Deze functionaliteit vergroot het voorspellende vertrouwen bij pathway engineering en ondersteunt de schaalbare generatie van bibliotheken voor vroege ontdekking en targetvalidatie. Deze aanpak is direct relevant voor R&D-teams in de biofarmacie die de design-build-test-cycli willen versnellen en mechanistische ambiguïteit bij de assemblage van genetische constructen willen verminderen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & validatie van targets
- Maakt systematische analyse van multi-gen pathways mogelijk voor functionele validatie van targets.
- Ondersteunt biologische risicovermindering door een flexibele rangschikking van coderende sequenties in operons toe te staan.
- Vergemakkelijkt voorspellende betrouwbaarheid bij genetische interventies op pathway-niveau.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde polycistronische constructen voor voor downstream screening-workflows.
- Standaardiseert assemblageprocessen, waardoor de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van genetische bibliotheken worden verbeterd.
- Maakt kwantitatieve beoordeling van multi-gen expressie-outputs mogelijk voor assay-ontwikkeling.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt technisch gemodificeerde operons af met ziekterelevante microbiële modellen, indien van toepassing.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door het mogelijk maken van modulair hergebruik van constructen.
- Biedt mechanistische risicoreductie voor op pathways gebaseerde therapeutische strategieën.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze modulaire assemblagemethode past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek, waardoor snel prototypen mogelijk is, van vroege hypothesetoetsing tot de identificatie van leidende constructen.
- Discovery Biology: Ondersteunt de hypothesegedreven assemblage en testen van multi-gen pathways.
- Screening: Levert reproduceerbare, gestandaardiseerde constructen voor high-throughput evaluatie.
- Analytics: Biedt kwantitatieve output via restrictie-digest en fluorescentie-imaging voor verificatie van constructen.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert de aanpassing van constructen voor ziekterelevante microbiële systemen.
- Enterprise hergebruik: Vestigt een herbruikbare bibliotheek van gestandaardiseerde onderdelen en operon-assemblages voor toekomstige projecten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert ambiguïteit bij de assemblage van multi-genconstructen.
- Operationele waarde: Stroomlijnt workflows door standaardisatie en modulariteit, wat schaalbaarheid ondersteunt.
- Strategische waarde: Maakt beter geïnformeerde go/no-go-beslissingen en een efficiënte toewijzing van middelen mogelijk in genetische engineeringprogramma's.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering van engineered pathways en de verdere ontwikkeling van constructen.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in moleculaire klonering en workflows voor synthetische biologie.
- Toegang tot Type IIS restrictie-enzymen, thermocyclers en analytische instrumenten zoals gelelektroforese en fluorescentiebeeldvorming is noodzakelijk.
- Standaardisatie van onderdeelbibliotheken en assemblageprotocollen tussen teams is vereist.
- Aanpassing aan verschillende microbiële of eukaryote systemen kan maatwerk van de toolkit vereisen.
- Efficiëntie en getrouwheid hangen af van een nauwkeurige selectie van onderdelen en optimalisatie van de reactie, zoals gedemonstreerd in het protocol.
