Gestandaardiseerde modulaire assemblage van polycistronische operons met modulair klonen (MoClo) met behulp van de In-Cloning toolkit

Ik ontwikkelde methoden die modulaire DNA-assemblage mogelijk maken van kleine individuele moleculaire delen tot chromosoomgrootte-constructen, en om cellen te herprogrammeren met deze kunstmatige chromosomen. Een belangrijke innovatie in het veld is de ontwikkeling van modulaire kloontoolkits die de modulaire assemblage van multi-genconstructies mogelijk maken uit een bibliotheek van gestandaardiseerde moleculaire onderdelen. Modulaire kloontoolkits zijn doorgaans ontworpen om monocistronische transcriptie-eenheden te klonen.

Dit protocol demonstreert een generaliseerbare manier voor de assemblage van polycistronische transcriptie-eenheden met de in-cloning toolkit. Deze strategie van het klonen van een polycistronische transcriptie-eenheid maakt het mogelijk om coderingssequenties flexibel te gebruiken in zowel een individuele transcriptie-eenheid als in polycistronische arrangementen. Om te beginnen selecteert u de Level 0-onderdelen die in een transcriptie-eenheid worden samengevoegd.

Deze moeten ten minste een RBS, een coderingsreeks en een terminator bevatten. Kies de positie waarin de transcriptie-eenheid in operon wordt samengesteld. Op basis van de gekozen positie selecteer je het bijbehorende acceptorplasmid en simuleer je de Golden Gate-assemblage in SnapGene.

In de Golden Gate-reactie gebruik je het enzym SAP1 om de ribosoombindingsplaats, coderingssequentie en terminator los te maken van hun respectievelijke plasmiden en snijd je het acceptorplasmide open. Assembleer de ribosoombindingsplaats, coderingssequentie en terminator in het cut acceptor plasmide. Vervolgens voor de Golden Gate-reactie gebruik je een pipet om 50 femtomolen van elke gewenste insert en 50 femtomolen van het acceptorplasmide toe te voegen.

Eén microliter elk van 10x T4 DNA-ligasebuffer, T4-ligase en SAP1 in een reactiebuis. Voeg vervolgens nucleasevrij water toe om het uiteindelijke volume op 10 microliter te brengen. Plaats de buis in een thermocycler.

Voer 25 cycli van 37 graden Celsius gedurende drie minuten uit, 16 graden Celsius gedurende vier minuten en 50 graden Celsius gedurende 20 minuten. Daarna inactiveren we de enzymen bij 80 graden Celsius gedurende 20 minuten. Optioneel pipetten 0,5 microliter SAP1 op de GG-reactie en incubeer je bij 37 graden Celsius gedurende een uur.

Pipetteer vijf microliter van de reactie tot 50 microliter chemisch competente E.coli-cellen. Voer een hitteschoktransformatie uit door de buis 30 seconden in een waterbad te dompelen bij 42 graden Celsius, en plaats de buis vervolgens twee minuten op ijs. Vervolgens incubeer je de cellen in één milliliter medium gedurende een uur om het herstel te bevorderen.

Plaat 100 microliter van de transformatie groeit uit op een LB-boorplaat met 100 microgram per milliliter ampicilline. Breng de plaat een nacht uit bij 37 graden Celsius. De volgende dag kies je twee witte kolonies met een inoculatielus of een pipetpunt.

Inoculeer elk in vijf milliliter LB-medium met 100 microgram ampicilline per milliliter. Broed 's nachts uit bij 37 graden Celsius in een schuddende broedmachine met 250 omwentelingen per minuut. Voer een geruite extractie uit volgens de instructies van de fabrikant.

Verteer één microgram geëxtraheerd plasma-DNA door één microliter 10x verteringsbuffer en één microliter BBS1 toe te voegen. Voeg nucleasevrij water toe om het totale volume op 10 microliter te brengen en incubeer. Laad nu het verteerde plasmide op een 1%agarosegel en laat elektroforese 35 minuten op 100 volt draaien.

Maak vervolgens een afbeelding van de gel en bevestig de juiste assemblage van het plasmide. Om een Level M-constructie samen te stellen, kies je de Level 1 transcriptie-eenheden die geassembleerd moeten worden. Simuleer de Golden Gate-assemblage door de eerste en tweede transcriptie-eenheid en de eindlinker los te laten met behulp van het enzym BBS1.

Tegelijkertijd snijd je het acceptorplasmide open en assembleer je vervolgens alle drie de delen tot het acceptorplasmide om de polycistronische transcriptie-eenheid te vormen. De negatieve controle voor Level 1 plasmide-assemblage, die geen terminator-onderdeel had, leverde geen kolonies op, terwijl de volledige reactie 292 witte kolonies en geen rode kolonies opleverde. De assemblage van het multi-gen-construct zonder de tweede cassette bij 37 graden Celsius leverde slechts twee witte kolonies op, terwijl de volledige assemblage negen grote kolonies en 435 kleine kolonies opleverde.

Bij 30 graden Celsius leverde de negatieve controle voor multi-genassemblage vier witte kolonies op, terwijl de volledige reactie meer dan 1.500 kolonies opleverde. De BSA1-digest van het acceptorplasmide PMA60 geeft de verwachte enkelbandige band van 5.500 basenparen. BSA1-vertering van plasmiden uit 24 kolonies toonde aan dat 23 van de 24 het juiste restrictiepatroon van twee banden vertoonden, ongeveer 4.300 basenparen en 1.700 basenparen.

Fluorescentiebeeldvorming toonde sterke groene en cyaan fluorescentie in kolonies van platen met de OC6-inducer, terwijl platen zonder inducer minimale of geen fluorescentie vertoonden.