Analyse van de expressie en complexassemblage van de mitochondriale respiratoire keteneiwitten in de splijtingsgist Schizosaccharomyces pombe

De reikwijdte van ons onderzoek is mitochondriale eiwittranslatie en we proberen de mechanismen op te helderen die van invloed zijn op de translatie en assemblage van het mitochondriale ademhalingsketencomplex. Uit ons onderzoek bleek dat shy1 een rol speelt in de duurzaamheid van de regelmatige functie van mitochondriën door deel te nemen aan de assemblage van vier complexe infusies. Ons laboratorium zal het mechanisme van M=methotrexaatinfusie onderzoeken.

[Verteller] Meet om te beginnen het natte gewicht van een celpellet van Schizosaccharomyces pombe. Suspentie van de cellen in acht milliliter S-buffer. Voeg dithiothreitol toe aan een eindconcentratie van 10 millimolair en fenylmethylsulfonylfluoride aan één millimolair en zorg ervoor dat beide reagentia vers worden bereid. Voeg lytische enzymen toe aan de celsuspensie om de celwand van Schizosaccharomyces pombe te verteren. Draai de buis op een shaker op 30 graden Celsius voor de duur die wordt aanbevolen voor het specifieke lytische enzym. Gebruik een microscoop om de vorming van sferoplasten te observeren. Centrifugeer het monster vervolgens gedurende 10 minuten bij 1.000 G, bij 4 graden Celsius om de sferoplasten te pelleteren. Resuspendeer de pellet in acht milliliter ijskoude S-buffer. Na twee wasbeurten suspendeer je de sferoplasten opnieuw in acht milliliter ijskoude homogenisatiebuffer met proteaseremmers. Breng het mengsel over in een voorgekoelde glazen donshomogenisator met een stamper en een reageerbuis. Homogeniseer de cellen mechanisch door ongeveer 15 bewegingen op en neer uit te voeren met de nauwsluitende stamper. Onderzoek vervolgens de sferoplasten onder een microscoop om te controleren of ze zijn gebroken. Breng nu de gehomogeniseerde suspensie over in centrifugebuisjes. Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1.000 G bij 4 graden Celsius om ongebroken cellen en vuil te pelleteren. Centrifugeer het resulterende supernatans gedurende vijf minuten bij 3.000 G bij 4 graden Celsius om de kernen te pelleteren. Breng het bovenstaande vervolgens over in verse centrifugebuisjes. Centrifugeer bij 12.000 G gedurende 15 minuten bij 4 graden Celsius om de mitochondriën en andere organellen te pelleteren, suspendeer de pellet opnieuw in een milliliter ijskoude sorbitol EDTA-dweilbuffer na het decanteren van de supernatant. Centrifugeer vervolgens opnieuw gedurende 15 minuten bij 12.000 G bij 4 graden Celsius om de mitochondriën te wassen. Resuspendeer de laatste pellet in een milliliter ijskoude sorbitol EDTA dweilbuffer. Vervolgens worden de gezuiverde mitochondriën in opslagbuizen gegoten voor toekomstige experimenten. Bij SDS-pagina wordt de buffer in 40 microliter mitochondriaal totaal eiwit geladen. Denatureer de eiwitten door het mengsel gedurende de aangegeven tijd bij de juiste temperatuur te incuberen. Laad ongeveer 20 microgram of vier microliter mitochondriale eiwitten in een gel van 12% SDS-pagina's vóór immunoblotting. Om het monster voor te bereiden op BN-pagina, worden eerst pelletmitochondriën van eerdere aliquots gecentrifugeerd. Resuspendeer de mitochondriën in 200 microliter gelbuffer van drie XBN-pagina's. Piket vervolgens twee microliter 100 X fenylmethylsulfonylfluoride en één microliter 1 molaire magnesiumchloride. Centrifugeer opnieuw gedurende 15 minuten bij 12.000 G bij 4 graden Celsius. Resuspendeer de mitochondriale pellet in 160 microliter van 5% gewicht per volume digitorum. Incubeer 30 minuten op ijs en meng voorzichtig om de 10 minuten. Centrifugeer de suspensie gedurende vijf minuten bij 20.000 G bij 4 graden Celsius. Breng vervolgens het bovenstaande over in een nieuw buisje. Voeg 80 microliter monsterbuffer van drie XBN-pagina's toe aan het met digitorum behandelde monster. Of 32 microliter tot het met DDM behandelde monster. Zet nu de geprefabriceerde native Bis-Tris gels in elkaar met een hellingspercentage van 3 tot 12%. Laad de behandelde eiwitmonsters samen met eiwitmarkers met een hoog moleculair gewicht voor natuurlijke polyacrylamidegelelektroforese. Laat de gel gedurende 30 minuten draaien op een constante spanning van 80 volt en een stroom van zes milliampère met behulp van een kathodebuffer die 0,02% Kumasi G250 bevat. Vervang de buffer door kathodebuffer zonder Kumasi en blijf drie uur lang op 10 milliampère draaien totdat het verffront de gelbodem bereikt. Knip de gelbaan met de eiwitmarker af. Kleur de marker gedurende 15 minuten in met Kumasi R250-buffer. Verwijder vervolgens de vlekken totdat de banden zichtbaar worden. Dompel het resterende deel van de gel 30 minuten onder in de BN-paginaoverdrachtsbuffer om in evenwicht te komen. Spoel het PVDF-vlekmembraan van 0,45 micrometer af met methanol en breng gedurende 10 minuten in evenwicht in de overdrachtsbuffer. Breng eiwitten van de gel over op het PVDF-membraan met behulp van een constante stroom van 300 milliampère gedurende twee uur. Spoel het PVDF-membraan af met methanol om de Kumasi-kleurstof te verwijderen. Incubeer vervolgens het membraan in TBS-blokkeerbuffer met 5% magere melk gedurende een uur bij 25 graden Celsius. Incubeer het PVDF-membraan met de gespecificeerde primaire antilichamen tegen Schizosaccharomyces pombe mitochondriale ademhalingsketencomplexen. Na een nacht incubatie bij vier graden Celsius wast u het membraan met behulp van TBST-buffer. Incubeer vervolgens het membraan in het secundaire antilichaam bij een verdunning van één tot 10.000 gedurende een uur bij 25 graden Celsius. Na het wassen van het membraan met TBST-buffer, belicht en scan het PVDF-membraan om de resultaten van immunoblot te visualiseren. Deletie van het shy1-gen leidde tot een duidelijke verlaging van de steady-state niveaus van mitochondriaal DNA-gecodeerde respiratoire keteneiwitten, Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 en Atp6. Analyse van blauwe native pagina's toonde aan dat de overvloed aan DG Solubilized respiratoire keten supercomplexen 3242 en 324 was verminderd in Delta shy1-cellen. Terwijl de niveaus van supercomplexen 32.= en 55N onaangetast bleven. Het niveau van DDM opgelost diametraal complex 3 was onveranderd in de Delta shy1-stam.