Analyse van de expressie en complexassemblage van de mitochondriale respiratoire keteneiwitten in de splijtingsgist Schizosaccharomyces pombe
2 mei 2025
De splijtingsgist Schizosaccharomyces pombe is in opkomst als een aantrekkelijk model voor het bestuderen van mitochondriën. Hier beschrijven we een protocol voor het analyseren van de overvloed en assemblage van de mitochondriale ademhalingscomplexen in S. pombe. Dit maakt de karakterisering mogelijk van de nieuwe functies van geconserveerde genen in de mitochondriale ademhalingsketen.
De reikwijdte van ons onderzoek is mitochondriale eiwittranslatie en we proberen de mechanismen op te helderen die van invloed zijn op de translatie en assemblage van het mitochondriale ademhalingsketencomplex. Uit ons onderzoek bleek dat shy1 een rol speelt in de duurzaamheid van de regelmatige functie van mitochondriën door deel te nemen aan de assemblage van vier complexe infusies. Ons laboratorium zal het mechanisme van M=methotrexaatinfusie onderzoeken.
[Verteller] Meet om te beginnen het natte gewicht van een celpellet van Schizosaccharomyces pombe. Suspentie van de cellen in acht milliliter S-buffer. Voeg dithiothreitol toe aan een eindconcentratie van 10 millimolair en fenylmethylsulfonylfluoride aan één millimolair en zorg ervoor dat beide reagentia vers worden bereid. Voeg lytische enzymen toe aan de celsuspensie om de celwand van Schizosaccharomyces pombe te verteren. Draai de buis op een shaker op 30 graden Celsius voor de duur die wordt aanbevolen voor het specifieke lytische enzym. Gebruik een microscoop om de vorming van sferoplasten te observeren. Centrifugeer het monster vervolgens gedurende 10 minuten bij 1.000 G, bij 4 graden Celsius om de sferoplasten te pelleteren. Resuspendeer de pellet in acht milliliter ijskoude S-buffer. Na twee wasbeurten suspendeer je de sferoplasten opnieuw in acht milliliter ijskoude homogenisatiebuffer met proteaseremmers. Breng het mengsel over in een voorgekoelde glazen donshomogenisator met een stamper en een reageerbuis. Homogeniseer de cellen mechanisch door ongeveer 15 bewegingen op en neer uit te voeren met de nauwsluitende stamper. Onderzoek vervolgens de sferoplasten onder een microscoop om te controleren of ze zijn gebroken. Breng nu de gehomogeniseerde suspensie over in centrifugebuisjes. Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1.000 G bij 4 graden Celsius om ongebroken cellen en vuil te pelleteren. Centrifugeer het resulterende supernatans gedurende vijf minuten bij 3.000 G bij 4 graden Celsius om de kernen te pelleteren. Breng het bovenstaande vervolgens over in verse centrifugebuisjes. Centrifugeer bij 12.000 G gedurende 15 minuten bij 4 graden Celsius om de mitochondriën en andere organellen te pelleteren, suspendeer de pellet opnieuw in een milliliter ijskoude sorbitol EDTA-dweilbuffer na het decanteren van de supernatant. Centrifugeer vervolgens opnieuw gedurende 15 minuten bij 12.000 G bij 4 graden Celsius om de mitochondriën te wassen. Resuspendeer de laatste pellet in een milliliter ijskoude sorbitol EDTA dweilbuffer. Vervolgens worden de gezuiverde mitochondriën in opslagbuizen gegoten voor toekomstige experimenten. Bij SDS-pagina wordt de buffer in 40 microliter mitochondriaal totaal eiwit geladen. Denatureer de eiwitten door het mengsel gedurende de aangegeven tijd bij de juiste temperatuur te incuberen. Laad ongeveer 20 microgram of vier microliter mitochondriale eiwitten in een gel van 12% SDS-pagina's vóór immunoblotting. Om het monster voor te bereiden op BN-pagina, worden eerst pelletmitochondriën van eerdere aliquots gecentrifugeerd. Resuspendeer de mitochondriën in 200 microliter gelbuffer van drie XBN-pagina's. Piket vervolgens twee microliter 100 X fenylmethylsulfonylfluoride en één microliter 1 molaire magnesiumchloride. Centrifugeer opnieuw gedurende 15 minuten bij 12.000 G bij 4 graden Celsius. Resuspendeer de mitochondriale pellet in 160 microliter van 5% gewicht per volume digitorum. Incubeer 30 minuten op ijs en meng voorzichtig om de 10 minuten. Centrifugeer de suspensie gedurende vijf minuten bij 20.000 G bij 4 graden Celsius. Breng vervolgens het bovenstaande over in een nieuw buisje. Voeg 80 microliter monsterbuffer van drie XBN-pagina's toe aan het met digitorum behandelde monster. Of 32 microliter tot het met DDM behandelde monster. Zet nu de geprefabriceerde native Bis-Tris gels in elkaar met een hellingspercentage van 3 tot 12%. Laad de behandelde eiwitmonsters samen met eiwitmarkers met een hoog moleculair gewicht voor natuurlijke polyacrylamidegelelektroforese. Laat de gel gedurende 30 minuten draaien op een constante spanning van 80 volt en een stroom van zes milliampère met behulp van een kathodebuffer die 0,02% Kumasi G250 bevat. Vervang de buffer door kathodebuffer zonder Kumasi en blijf drie uur lang op 10 milliampère draaien totdat het verffront de gelbodem bereikt. Knip de gelbaan met de eiwitmarker af. Kleur de marker gedurende 15 minuten in met Kumasi R250-buffer. Verwijder vervolgens de vlekken totdat de banden zichtbaar worden. Dompel het resterende deel van de gel 30 minuten onder in de BN-paginaoverdrachtsbuffer om in evenwicht te komen. Spoel het PVDF-vlekmembraan van 0,45 micrometer af met methanol en breng gedurende 10 minuten in evenwicht in de overdrachtsbuffer. Breng eiwitten van de gel over op het PVDF-membraan met behulp van een constante stroom van 300 milliampère gedurende twee uur. Spoel het PVDF-membraan af met methanol om de Kumasi-kleurstof te verwijderen. Incubeer vervolgens het membraan in TBS-blokkeerbuffer met 5% magere melk gedurende een uur bij 25 graden Celsius. Incubeer het PVDF-membraan met de gespecificeerde primaire antilichamen tegen Schizosaccharomyces pombe mitochondriale ademhalingsketencomplexen. Na een nacht incubatie bij vier graden Celsius wast u het membraan met behulp van TBST-buffer. Incubeer vervolgens het membraan in het secundaire antilichaam bij een verdunning van één tot 10.000 gedurende een uur bij 25 graden Celsius. Na het wassen van het membraan met TBST-buffer, belicht en scan het PVDF-membraan om de resultaten van immunoblot te visualiseren. Deletie van het shy1-gen leidde tot een duidelijke verlaging van de steady-state niveaus van mitochondriaal DNA-gecodeerde respiratoire keteneiwitten, Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 en Atp6. Analyse van blauwe native pagina's toonde aan dat de overvloed aan DG Solubilized respiratoire keten supercomplexen 3242 en 324 was verminderd in Delta shy1-cellen. Terwijl de niveaus van supercomplexen 32.= en 55N onaangetast bleven. Het niveau van DDM opgelost diametraal complex 3 was onveranderd in de Delta shy1-stam.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op de splijtende gist Schizosaccharomyces pombe als modelorganisme voor mitochondriaal onderzoek. Er wordt een protocol beschreven voor het analyseren van mitochondriale respiratoire complexen, waarbij de nadruk ligt op de rol van het shy1-gen in de mitochondriale functie.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Mitochondriaal onderzoek
Achtergrond
- Schizosaccharomyces pombe is een waardevol model voor het bestuderen van mitochondriën.
- Mitochondriële respiratoire complexen zijn essentieel voor de cellulaire energieproductie.
- Inzicht in genfuncties bij de mitochondriële assemblage kan nieuwe inzichten verschaffen in metabole processen.
- Het shy1-gen is betrokken bij de assemblage van complexen van de ademhalingsketen.
Doel van de studie
- Om de abundantie en assemblage van mitochondriale respiratoire complexen in S. pombe te analyseren.
- Om de rol van het shy1-gen in de mitochondriale functie te onderzoeken.
- Om een protocol te ontwikkelen voor het bestuderen van de mitochondriale eiwittranslatie.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van het celpellet en vorming van sferoplasten.
- Centrifugatie voor het isoleren van mitochondriën en andere organellen.
- Proteïnedenaturatie en laden voor SDS-PAGE en BN-PAGE.
- Immunoblotting voor de analyse van mitochondriale ademhalingskettingeiwitten.
Belangrijkste resultaten
- Deletie van het shy1-gen verminderde de spiegels van mitochondriale DNA-gecodeerde eiwitten van de ademhalingsketen.
- Blue native PAGE-analyse toonde een verminderde overvloed aan specifieke supercomplexen van de ademhalingsketen aan in Delta shy1-cellen.
- De spiegels van complex 3 bleven ongewijzigd in de Delta shy1-stam.
- De studie biedt inzicht in de mechanismen van de assemblage van mitochondriale eiwitten.
Conclusies
- Shy1 is essentieel voor het behoud van de functie van de mitochondriale ademhalingsketen.
- Het ontwikkelde protocol kan worden gebruikt voor verdere studies naar mitochondriale dynamiek.
- Inzicht in de mitochondriale assemblage kan implicaties hebben voor metabolisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Kwantitatieve analyse van de expressie van mitochondriale respiratoire kettingeiwitten en de assemblage van complexen in Schizosaccharomyces pombe maakt mechanische risicoanalyse van hypothesen over de mitochondriale functie mogelijk in de vroege ontdekkingsfase. Deze workflow ondersteunt targetvalidatie en het onderzoeken van signaalpaden voor de mitochondriale biologie, wat bijdraagt aan risicogecorrigeerde portfoliobeslissingen in het onderzoek naar metabole en energiegerelateerde ziekten. De aanpak biedt een reproduceerbaar platform voor het ontleden van gen-specifieke rollen in de assemblage van de respiratoire ketting, waardoor het voorspellende vertrouwen bij de selectie van targets wordt verhoogd.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt het mogelijk om de genfunctie in de assemblage en het onderhoud van de mitochondriale ademhalingsketen te onderzoeken.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door de impact van genetische perturbaties op de vorming van proteïnecomplexen te verduidelijken.
- Vergemakkelijkt voorspellend vertrouwen bij de validatie van targets voor mitochondriale pathways.
Screening en assay-ontwikkeling
- Bereidt gevalideerde mitochondriale eiwitcomplexen voor voor downstream biochemische en genetische assays.
- Standaardiseert kwantitatieve immunoblot-outputs voor reproduceerbaarheid tussen experimenten.
- Maakt een betrouwbare beoordeling van eiwitabundantie en complexintegriteit mogelijk voor compoundscreening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt de analyse van mitochondriale eiwitcomplexen aan ziektespecifieke modelsystemen.
- Ondersteunt de continuïteit van genetische ontdekking naar preklinische validatie van mitochondriale targets.
- Biedt mechanistische inzichten die translationele biomarkerstrategieën informeren.
Integratie van Pijplijn en Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege genetische hypothesetoetsing tot lead-identificatie en preklinische modelvalidatie, specifiek voor mitochondriale targets.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing naar genspecifieke rollen bij de assemblage en functie van de ademhalingsketen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve read-outs van eiwitexpressie en complexvorming voor assayontwikkeling.
- Analytics: Biedt immunoblot-gebaseerde metingen om wildtype- en mutantcondities kwantitatief te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen genetische bevindingen in gist en ziekte-relevante modellen van mitochondriale dysfunctie.
- Bedrijfsbrede hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerde workflow die aanpasbaar is aan diverse mitochondriale gentargets en modelsystemen.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van mitochondriale targets.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare en reproduceerbare analyse van proteïnecomplexen.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en vermindert biologische risico's in een laat stadium binnen portefeuilles van mitochondriale targets.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van mitochondriale targets voor verdere ontwikkeling mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in mitochondriële isolatie, elektroforese en immunoblotting-technieken.
- Vereist toegang tot instrumentatie voor centrifugatie, PAGE en immunodetectie.
- Maakt standaardisatie van monsterbereiding en antilichaamvalidatie tussen teams noodzakelijk.
- Aanpasbaar aan andere gist- of eukaryote modelsystemen door optimalisatie van het protocol.
- Afhankelijk van de antilichaamspecificiteit en de kwantitatieve detectielimieten voor doeleiwitten.
