Een eenvoudige en snelle methode voor gelijktijdige isolatie van primaire eilandjes en primaire alvleesklier-acinaire cellen van muizen

Deze studie ontwikkelde een vereenvoudigde methode om efficiënt functionele primaire eilandjes en acinaire cellen uit de alvleesklier van de muis te extraheren, en bood een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van intracellulaire communicatie in de pathogenese van acute door pancreatitis veroorzaakte diabetes (PPDMA). Huidige methoden om primaire eilandjes van muizen te isoleren zijn voornamelijk afhankelijk van galbuiscannulatie. Deze techniek vereist nauwkeurige lokalisatie en canulatie van de galgang, gevolgd door in vivo perfusie van de pancreasparenchyma-collagenase P-oplossing.

Het is vrij moeilijk om te presteren zonder gespecialiseerde training, het bereiken van een effectieve en efficiënte alvleesklierperfusie is een uitdaging. Deze video verhindert een eenvoudige en snelle methode om primaire bergeilandjes te isoleren die geschikt zijn voor onderzoekers zonder perfusie-ervaring. De methode maakt ook gelijktijdige verwerving van primaire alvleesklieracinaire cellen mogelijk, waardoor voldoende hoogwaardige eilandjes en acinaire cellen worden opgeleverd.

Het stelt onderzoekers in staat experimenten uit te voeren binnen dezelfde pathologische en fysiologische context, waardoor een diepgaande analyse van het interactiemechanisme tussen eilandjes en de acinaire cellen mogelijk wordt. Isolatie van alvleeskliereilandjes en pancreasacinaire cellen PACs. Voeg Hank's gebalanceerde zoutoplossing en collagenase P-oplossing toe aan de 12-wellplaat en voeg drie milliliter collagenase P-oplossing toe aan een 50 milliliter centrifugebuis voor de verdere vertering.

Verdoof de muis met 1,25% tribromoethanol vóór de operatie, gevolgd door euthanasie. Maak een V-vormige buikincisie om de buikholte van de muis te openen. Het donkerrode lymfoïde orgaan in het linker hypochondergebied is de milt, en het witte orgaan dat aan de milt vastzit is de alvleesklier.

Voer voorzichtig een stomp dissectie uit van de alvleesklier langs de onderkant van de maag en de pancreaticoduodenale overgang. Was het geïsoleerde alvleesklierweefsel in Hanks uitgebalanceerde zoutoplossing en verwijder resterende mesenterische hechtingen, de milt en het peripancreasvetweefsel. Verplaats de voorbewerkte alvleesklier naar een 12-put plaat die vooraf is toegevoegd met twee milliliter collagenase P-oplossing.

Houd de alvleesklier op zijn plaats met een pincet met de linkerhand en gebruik met de rechterhand een spuit van één milliliter om collagenase P-oplossing in het pancreasparenchym te injecteren totdat het alvleesklierweefsel doorschijnend en oematisch lijkt. Knip de alvleesklier snel in één tot twee millimeter en blokjes van weefsel gesneden met een chirurgische schaar. Snijd de distale tot 1,5 centimeter van een pipetpunt van één milliliter af om de opening te vergroten, en gebruik deze aangepaste tip om de stukken alvleesklierweefsel samen met twee milliliter collagenase P-oplossing over te brengen in een 50 milliliter centrifugebuis, vooraf geladen met drie milliliter collagenase P-oplossing.

Incubeer de centrifugebuis in een waterbad van 37 graden Celsius gedurende 12 minuten, waarbij je de buis elke vijf tot zes minuten zachtjes schudt gedurende deze periode. Voeg 10 milliliter RPMI 1640 complete medium toe om het spijsverteringseffect van collagenase P-oplossing te beëindigen. Pipetteer de pellet herhaaldelijk met een Pasteur-pipet van vijf milliliter, 15 tot 20 op-en-neer slagen, totdat er geen duidelijke grote weefselklonten meer overblijven.

Voeg 10 milliliter RPMI 1640 complete medium toe. Centrifugeer vervolgens op 180 keer G gedurende twee minuten bij vier graden Celsius. En gooi het supernatant weg en suspendeer de pellet opnieuw met 20 milliliter RPMI 1640 complete medium.

Filter de suspensie door een zeef van 40 maas. Centrifugeer vervolgens op 180 keer G gedurende twee minuten bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant voorzichtig weg.

Voeg 20 milliliter Ficoll-oplossing toe om de pellet opnieuw te laten ophangen. Voeg dan langzaam 15 milliliter RPMI 1640 complete medium toe. Op dit punt kan een grens van heldere vloeistof worden waargenomen.

Centrifugeer zachtjes op 640 keer G gedurende 20 minuten bij 25 graden Celsius. Verwijder voorzichtig de centrifugebuis en aspireer de bovenste rode medium laag met een Pasteur-pipet van vijf milliliter. Vervolgens aspireer je voorzichtig de vloeistofhoudende eilandjes aan het oppervlak van de vloeistoflaag en breng deze over in een nieuwe centrifugebuis van 50 milliliter.

Voeg 20 milliliter RPMI 1640 complete medium toe. Centrifugeer op 180 keer G gedurende twee minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Suss de pellet opnieuw met 20 milliliter RPMI 1640 complete medium.

Centrifugeer op 180 keer G gedurende twee minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Suspendeer de pellet opnieuw met 10 milliliter RPMI 1640 complete medium. En zet het over in een 60 millimeter celkweekschaal.

Onder een omgekeerde biologische microscoop met 100 keer vergroting kun je handmatig eilandjes plukken met een pipet van 20 microliter. Breng de geselecteerde eilandjes over naar een 24-put celkweekplaat die vooraf is geladen met 500 microliter RPMI 1640 complete medium per put. Gooi de Ficoll-oplossingslaag weg.

Sussie de pellet opnieuw met 10 milliliter DMEM complete medium. Filter door een 100 micrometer celfilter. Centrifugeer op 180 keer G gedurende twee minuten bij vier graden Celsius.

En gooi het supernatant weg. Sussie de pellet opnieuw met 10 milliliter DMEM complete medium. Centrifugeer op 180 keer G gedurende twee minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg.

Daarna wordt de pellet opnieuw opgehangen met vijf milliliter DMEM complete medium voor volgende experimenten. Na de centrifugatie van Ficoll-oplossingsdichtheidsgradiënt werden eilandjes waargenomen nabij het grensvlak tussen de transparante kleurloze vloeistoflaag en het medium, met pakketten als sediment aan de onderkant van de buis. De eilandjes waren meestal rond, ovaal, goudbruin, met een stabiele opbrengst van 120 plus of min vijf per muis, Figuur A en Figuur B. Pas geïsoleerde PAC's waren bolvormig en gegroepeerd.

Acinaire cellen hadden donkerdere apicale uiteinden met zichtbare zymogenkorrels en de opbrengst was 1,6 tot 1,95 keer 10 tot de zevende vermogenscellen per muis, Figuur C en Figuur D. Eilandje en acinaire cel clacein PI-kleuring tonen aan dat de meeste cellen groen calcein, levend en enkele rode PI zijn gekleurd, dood zijn, Figuur A. Afbeelding J-gebaseerde kwantitatieve analyse toont aan dat geïsoleerde eilandjes en acinaire cellen levensvatbaarheidspercentages hebben van 97,52 plus of min 0,16% en 96,55 plus min respectievelijk 0,95%, Figuur B. Geïsoleerde acinaire cellen van de pancreas, een basale amylasactiviteit van 0,79 plus of min 0,01 eenheden per milliliter. Na stimulatie met 10 nanomolaire, 20 nanomolaire en 50 nanomolaire caerulein, waren hun amylase-activiteit respectievelijk 1,45 plus of min 0,03 eenheden per milliliter, 1,65 plus of min 0,05 eenheden per milliliter en 1,39 plus of min 0,02 eenheden per milliliter. Eenrichtings-ANOVA toonde aan dat alle caeruleinegroepen significant verschillende amylase-activiteit hadden dan de controlegroep, allemaal met een P-waarde kleiner dan 0,001.

Daarnaast verschilde de 20 nanomolaire groep significant van de 10 nanomolaire groep, P-waarde minder dan 0,001, figuur A. Geïsoleerde eilandjes bij insulinesecretie van 0,27 plus of min 0,04 nanogram per milliliter per eilandje per uur wanneer gestimuleerd met 5,6 millimolaire glucose en 0,94 plus of min 0,04 nanogram per milliliter per eilandje per uur met 22 millimolaire glucose, GSI is gelijk aan 3,44, Figuur B. Deze studie heeft een methode vastgesteld voor gelijktijdige isolatie van primaire muizeneilandjes en acinaire cellen van de alvleesklier zonder complexe in vivo perfusie. Met een lange technische barrière is de methode eenvoudig te bedienen, met 120 plus of min 5 eilandjes en 1,6 tot 1,95 keer 10 tot de zevende macht acinaire cellen per muis, waarbij beide celtypen een levensvatbaarheidsgraad van meer dan 96% vertonen. De geïsoleerde eilandjes vertonen normale door glucose gestimuleerde insulinesecretie en de acinaire cellen zijn gevoelig voor caeruleïnestimulatie. Dit bevestigt dat de via deze methode verkregen cellen intacte functies hebben, waardoor ze geschikt zijn voor studies naar pancreas-exocriene en endocriene interacties.

Hoewel de methode beperkt is door de noodzaak van basiskennis van muisanatomie, de vereiste aanpassingen van de dosering van reagentia, beperkingen op het aantal muizen dat gelijktijdig verwerkt mag worden, en het risico op niet-gevalideerde toepassing. Het biedt nog steeds een betrouwbaar celisolatieprotocol voor onderzoekers zonder perfusie-ervaring.