Celsubtype-specifieke analyse van neuronaal membraanproteasoom in somatosensorische neuronen

We onderzoeken de mechanismen van hoe somatosensorische neuronen communiceren via het recent ontdekte neuronale membraanproteasoom of NNP om te moduleren hoe we aanraking, jeuk en pijn voelen. We hebben onlangs het neuronale membraanproteasoom ontdekt, een gespecialiseerd eiwitafbraakcomplex dat in sommige sensorische neuronen wordt aangetroffen en dat de gevoeligheid voor aanraking, jeuk en pijn moduleert. Met dit protocol zullen we in staat zijn om de expressie- en modulatiedynamiek van de NMP op een celtypespecifieke manier te onderzoeken in gezondheids- en ziektetoestanden.

Ons protocol maakt het mogelijk om neuronen die NMP tot expressie brengen te isoleren van de neuronen die geen NMP tot expressie brengen, om hun functie te kunnen bestuderen met celtypespecificiteit. Belangrijk is dat deze geïsoleerde neuronale populaties levensvatbaar blijven voor stroomafwaartse analyses. Met deze protocollen zullen we beginnen te onderzoeken hoe verschillende neuropathische aandoeningen de expressie en functie van de NMP beïnvloeden, en hoe dit bijdraagt aan veranderde aanraking, jeuk en pijnsensatie.

Breng om te beginnen de geoogste achterwortelganglia over in een conische buis van 15 milliliter. Voeg met behulp van een pipet zeven milliliter weefseldissociatie enzymmengsel werkoplossing toe aan de buis en incubeer bij 37 graden Celsius met zacht roeren gedurende 20 minuten. Plaats de buis in een centrifuge en draai gedurende twee minuten langs de ganglia bij 120 G.

Zuig het bovenstaande voorzichtig op zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer de ganglia in zeven milliliter weefseldissociatie-enzymmengsel met lage trituratie en papaïne. Nadat u de buis opnieuw hebt gecentrifugeerd, zuigt u de supernatant op en gooit u deze weg.

Suspendeer vervolgens de ganglia opnieuw in 500 microliter BSA-, TI- en DMEM-oplossing. Gebruik een 12 tot 16 keer geplugde vuurgepolijste glazen weidepipet van één milliliter en tritureer de ganglia. Haal de celsuspensie door een celzeef van 40 micrometer om cellulair vuil eruit te filteren.

Was de zeef met een milliliter BSA-, TI- en DMEM-oplossing om de resterende neuronen van de dorsale ganglia te verzamelen. Breng de gefilterde celsuspensie over in een conische buis van 15 milliliter. Bereid een immunofluorescentiekleuringsbakje voor door het te bekleden met een groot stuk parafilm.

Breng met een steriele 5-45 tang de dekglaasjes van de weefselkweekschaal over op de parafilm en zorg ervoor dat de kant met de neuronen van de dorsale ganglia-neuronen naar boven wijst. Piket langzaam 100 microliter dorsale ganglia-media op elk dekglaasje om te voorkomen dat de cellen uitdrogen. Verdun vervolgens het go anti PSM alpha two primaire antilichaam in warme dorsale wortelganglia-media om een verdunning van één tot 20 te bereiken.

Gebruik een aspirator die is uitgerust met een ongefilterde P10-punt om het medium langzaam van de rand van elk dekglaasje te verwijderen. Voeg 100 microliter van de go anti PSM alpha two antilichaamoplossing toe aan elk dekglaasje en incubeer gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur. Zuig daarna voorzichtig de primaire antilichaamoplossing van elk dekglaasje op.

Voeg 100 microliter PBS op kamertemperatuur toe aan de cellen en incubeer gedurende drie minuten bij kamertemperatuur om te wassen. Om nu het secundaire anti-go-antilichaam te bereiden, verdunt u het in warme dorsale wortelganglia-media in een verdunning van één tot 250. Voeg na het voltooien van de derde wasbeurt 100 microliter van de verdunde secundaire antilichaamoplossing toe aan elk dekglaasje.

Incubeer de dekglaasjes 40 minuten bij kamertemperatuur terwijl u de cellen tegen licht beschermt. Zuig vervolgens de secundaire antilichaamoplossing op van de dekglaasjes en was de cellen driemaal, met PBS zoals eerder beschreven. Voeg na de laatste PBS-wasbeurt 100 microliter fixeeroplossing toe die 4% paraformaldehyde en 4% sucrose in PBS bevat.

Zodra de cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur zijn geïncubeerd, zuigt u het fixeermiddel van elk dekglaasje op. Was de cellen vervolgens drie keer met PBS zoals eerder beschreven. Om de cellen te permeaboliseren, voegt u 100 microliter 0,1% niet-ionisch wasmiddel toe aan PBS.

Incubeer de dekglaasjes vijf minuten bij kamertemperatuur. Zuig vervolgens de doorlatende oplossing van de dekglaasjes op en was de cellen drie keer, met PBS zoals eerder beschreven. Voeg 100 microliter blokkeeroplossing bestaande uit 5% foetaal runderserum en 5% ezelserum in PBS toe aan elk dekglaasje.

Verdun vervolgens konijn anti-CGRP, A selectine B vier biotineconjugaat en kippenanti-NFH in de blokkerende oplossing om het dorsale wortelganglion-neuronceltypespecifieke primaire antilichaammengsel te bereiden. Zuig de blokkeeroplossing op van de dekglaasjes en voeg vervolgens 100 microliter van het bereide primaire antilichaammengsel toe aan elk dekglaasje. Incubeer de dekglaasjes 45 minuten bij kamertemperatuur terwijl u ze tegen licht beschermt.

Verwijder daarna de primaire antilichaamoplossing van de dekglaasjes en was de cellen drie keer, met PBS zoals eerder beschreven. Bereid nu het secundaire antilichaammengsel voor door streptavidine, ezel anti konijn en ezel anti kip te verdunnen tot één tot 500 elk in blokkerende oplossing. Zuig de laatste PBS-spoeling van elk dekglaasje op en voeg vervolgens 100 microliter van de bereide secundaire antilichaamoplossing toe.

Incubeer de dekglaasjes 45 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Zuig de laatste was van het dekglaasje. Til met een fijne pincet elk dekglaasje van de parafilm en dep voorzichtig overtollig vocht af door de rand van het dekglaasje aan te raken met een pluisvrij doekje.

Plaats een druppel van zeven microliter montagemedium op een microscoopglaasje. Laat de afdekplaat voorzichtig op het montagemedium zakken met de celzijde naar beneden en zorg ervoor dat hij volledig contact maakt met het medium. Plaats de voorbereide dia's in een donkere, droge lade of doos om minimaal een uur te drogen.

Sluit de rand van het dekglaasje af met sneldrogende nagellak en wacht 10 tot 15 minuten voordat u het beeldmateriaal aanbrengt. Antilichamen die zich voedden met levende, dorsale wortelganglionneuronen onthulden een subpopulatie van neuronen met oppervlakte-toegankelijke proteasomen, terwijl controlemonsters zonder primair antilichaam geen oppervlakte-labeling vertoonden. Flowcytometrie identificeerde twee verschillende populaties van dorsale wortelganglionneuronen, gebaseerd op fluorescentie-intensiteit, waarbij NMP-positieve van NMP-negatieve cellen werden gescheiden met duidelijke poortgebieden die waren vastgesteld, met behulp van controles.

Kwantificering van flow-gesorteerde populaties toonde aan dat ongeveer 4% van de dorsale wortelganglionneuronen NMP-positief was, terwijl de resterende meerderheid NMP-negatief was. Gesorteerde NMP-positieve en NMP-negatieve neuronen behielden levensvatbaarheid en brachten celtypespecifieke markers NFH, IB vier en CGRP tot expressie, wat de geschiktheid van de workflow voor stroomafwaartse moleculaire analyse bevestigt.