Visualisatie en kwantificering van intermoleculaire RNA-basenparing in in vitro RNA-clusters met behulp van gesplitste broccoli RNA-reporters
29 mei 2026
Dit protocol beschrijft een visuele assay waarbij gesplitste broccoli-RNA-reporters worden gebruikt om intermoleculaire basenparingen in vitro te detecteren en te kwantificeren.
We passen de split broccoli RNA-reporter-assay toe om intermoleculaire basenparing in vitro in vitro te detecteren en te kwantificeren. Chemische onderzoeken en simulaties suggereren RNA-interacties, maar kunnen deze niet direct meten. Dit protocol maakt directe, nauwkeurige beoordeling binnen RNA-clusters mogelijk.
Na het voorbereiden van de DNA-sjablonen voor in vitro RNA-transcriptie, veeg je het werkoppervlak, buisrekken en pipetten af met ribonuclease-decontaminatieoplossing. Gebruik ribonucleasevrije gefilterde tips voor alle pipetstappen. Ontdooi de reactiebuffer en nucleotideoplossingen die met de transcriptiekit worden geleverd, samen met uridinetrifosfaat cyanine 5, of UTP-Cy5, op ijs.
Centrifugeer alle buizen op 2.000g gedurende twee seconden voor gebruik. Bereken vervolgens het aantal thyminebasen in het DNA. Bepaal de benodigde volumes UTP en UTP-Cy5 voor een transcriptiereactie van 20 microliter, terwijl de labeldichtheid over RNA-soorten wordt gehandhaafd.
Bereid vervolgens een transcriptiereactie van 20 microliter voor door de gepresenteerde reagentia te combineren. Meng grondig door op en neer te pipetteren en centrifugeer op 2.000g gedurende twee seconden. Na zes uur incuberen bij 37 graden Celsius, voeg je één microliter deoxyribonuclease toe die bij de kit wordt geleverd, meng je grondig door te pipetteren en centrifugeer je opnieuw.
Daarna broeden ze nog eens 15 minuten uit bij 37 graden Celsius. Breng de reactie over naar een buisje van 1,5 milliliter. Voeg 115 microliter nucleasevrij water en 15 microliter ammoniumacetaat stopoplossing toe die bij de kit wordt geleverd.
Na het mengen centrifugeer je de oplossing op 2.000g gedurende twee seconden. Voeg vervolgens 150 microliter fenolchloroform toe aan de buis en meng voorzichtig om de fasen te combineren. Centrifugeer op 16.000g gedurende 10 minuten op vier graden Celsius.
Vervolgens brengt je de bovenste waterige fase over in een nieuwe buis. Voeg een gelijke hoeveelheid chloroform toe aan de overgedragen oplossing en meng grondig om een goede fase-interactie te waarborgen. Centrifugeer nu op 16.000g gedurende twee minuten bij vier graden Celsius en herhaal het fase-scheidingsproces opnieuw.
Vervolgens breng je de waterige laag van ongeveer 100 tot 150 microliter over in een nieuwe buis. Voeg 900 microliter isopropanol toe en meng grondig. Na het aliquoteren van de oplossing in aparte buizen, bewaar je de monsters bij min 20 graden Celsius een nacht of tot een maand.
Centrifugeer het RNA-monster in isopropanol bij 16.000g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder de isopropanol voorzichtig zonder de RNA-pellet te verstoren. Voeg vervolgens één milliliter 70% ethanol, bereid in nucleasevrij water, toe aan de pellet.
Centrifugeer op 16.000g gedurende twee minuten op vier graden Celsius. Na het verwijderen van de ethanol voeg je één milliliter 70% ethanol bereid in nucleasevrij water toe aan de buis en herhaal je de centrifugatie. Tijdens de laatste ethanolwasbeurt verwijder je het grootste deel van de ethanol met een pipet van 1.000 microliter.
Centrifugeer kort op 2.000g gedurende twee seconden in een mini-centrifuge op een laboratorium en verwijder eventueel resterende ethanol met een pipet van 20 microliter. Zodra de RNA-pellet is gedroogd, wordt deze opnieuw opgehangen in 20 microliter nucleasevrij water. Bewaar het monster op ijs en bescherm het tegen licht.
Met behulp van een microvolumespectrofotometer meet men de RNA-concentratie en zuiverheid. Zorg ervoor dat de absorptieverhouding bij 260 over 280 nanometer ongeveer 2,0 is en de verhouding bij 260 over 230 nanometer groter is dan 2,0. Ontdooi een tube met 100 millimolaire spermineoplossing en 50% polyethyleenglycol 8.000 op ijs.
Bereid vers een 10X RNA-refold-buffer voor door de getoonde componenten te combineren. Na het grondig mengen van de componenten door pipetten, centrifugeer je op 2.000g gedurende twee seconden in een mini-centrifuge op een mini-centrifuge op een bank. Voor de co-folding conditie combineert u in vitro getranscribeerd RNA in een 200 microliter PCR-buis met ofwel de boven- of onderste sequentie, RNA-refoldingbuffer en nucleasevrij water.
Meng grondig door op en neer te pipetteren en centrifugeren zoals eerder gedemonstreerd. Verwarm het monster twee minuten op 90 graden Celsius. Breng het monster onmiddellijk over naar kamertemperatuur.
Bescherm tegen licht en broed een uur uit. Voor de aparte vouwconditie verhit je het RNA-monster in een 200 microliter PCR-buis en plaats je het vervolgens onmiddellijk minstens 15 minuten op ijs. In een 200 microliter PCR-buis combineer je in vitro getranscribeerd RNA met ofwel de boven- of onderste sequentie, een 10-voudige RNA-refoldingbuffer en nucleasevrij water.
Incubeer de reactie 30 minuten op kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Combineer nu de RNA-monsters met de bovenste en onderste sequenties in één enkele PCR-buis en meng grondig door op en neer te pipetten. Centrifugeer op 2.000g voor twee seconden in een mini-centrifuge op een werkbank.
Broed 30 minuten op kamertemperatuur. Voor beide aandoeningen voeg je zes microliter van een één- tot twee-premix van 100 millimolaire zaadcellen en 50% polyethyleenglycol 8.000 toe. Na het mengen van de inhoud, centrifugeer je op 2.000g gedurende twee seconden in een mini-centrifuge op een werkblad.
Meng nu twee microliter van één millimolaire DFHBI-1T aan de reactie en centrifugeer opnieuw. Laad de reactie in een glazen kamerafdekglas. Incubeer de kamer vier uur op kamertemperatuur in het donker met de deksel erop om verdamping te minimaliseren.
Laad het glazen afdekglas op het microscooppodium. Zet de laser aan en gebruik vervolgens de oculairs om het monster te lokaliseren en te focussen. Configureer de microscoop zodat elk regio van belang eerst wordt afgebeeld met cyanine 5-kanaal bij elk Z-vlak.
Maak vervolgens een foto van hetzelfde interessegebied met behulp van het groene fluorescerende eiwitkanaal. Stel de belichtingstijd in op 500 milliseconden voor alle kanalen. Stel vervolgens het laservermogen in op 80% voor het groene fluorescerende eiwitkanaal en 40% voor het cyanine 5-kanaal.
Met een Z-stapgrootte van 150 nanometer beeld je een bedekkingsglijgebied buiten de reactiedruppel bij kamertemperatuur af. Daarna kwantificeer je intermoleculaire basenparing met behulp van beeldanalysesoftware. Bij inductie van RNA-clustering vormden beide RNA's clusters, hetzij afzonderlijk of samen.
DFHBI-1T-fluorescentie binnen RNA-clusters was aanzienlijk lager voor alleen boven- of onderste RNA's vergeleken met de co-vouwconditie. In de aparte vouwconditie was het genormaliseerde DFHBI-1T-signaal 0,031, vergelijkbaar met de basisniveaus die alleen boven of onder werden waargenomen. Shu-top, shu-bottom, shu-anti-top en shu-anti-bottom vertoonden afzonderlijk minimale DFHBI-1T-fluorescentie.
Co-folding van shu-top met shu-bottom of shu-anti-top met shu-anti-bottom produceerde een hoger DFHBI-1T-signaal dan apart vouwen. Co-folding van shu-top en shu-bottom resulteerde in een 5,63-voudige toename van genormaliseerde DFHBI-1T-fluorescentie. Afzonderlijke vouwing van shu-top en shu-bottom liet slechts een toename van 1,04 keer zien, vergelijkbaar met de basisniveaus.
Shu-top gemengd met shu-anti-bottom en shu-anti-top gemengd met shu-bottom vertoonde een hogere DFHBI-1T fluorescentie dan paren met dezelfde oriëntatie onder beide vouwomstandigheden. Het co-vouwen van shu-top met shu-anti-bottom en shu-anti-top met shu-bottom resulteerde respectievelijk in 61,86 en 82,60 keer toename in DFHBI-1T fluorescentie. Afzonderlijke vouwing van deze gemengde paren leverde kleinere verhogingen op van respectievelijk 2,69 en 4,94 keer.
De belangrijkste overweging is dat robuuste signaalgeneratie mogelijk crowding-reagentia vereist, terwijl gevoeligheid afhankelijk is van efficiënte dimerisatie en vouwing van gespleten broccoli-RNA's. Deze assay vult RNA-pull down- en gelelektroforesemethoden aan voor het bestuderen van intermoleculaire basenparing in RNA-clusters. Deze assay kan de effecten van RNA-sequenties, helicases en ionen op intermoleculaire basenparing binnen RNA-clusters onderzoeken.
Overview
This article presents a protocol for directly detecting and quantifying intermolecular base pairing in RNA clusters in vitro using a split Broccoli RNA reporter assay. The method leverages fluorescently labeled RNAs and a split aptamer system to visualize and measure RNA–RNA interactions, providing a quantitative alternative to chemical probing and computational predictions.
Key Study Components
Area of Science
- Molecular biology
- RNA biochemistry
- Fluorescence microscopy
Background
- RNA clustering is driven by multivalent intermolecular RNA–RNA interactions.
- Traditional methods like chemical probing and computational simulations infer but do not directly measure these interactions.
- Direct assessment of intermolecular base pairing within RNA clusters has been limited.
- The split Broccoli RNA aptamer system enables fluorescence-based detection of RNA dimerization.
Purpose of Study
- To develop and demonstrate a visual assay for direct detection of intermolecular base pairing in RNA clusters.
- To quantify how in vitro clustering conditions affect RNA–RNA interactions.
- To provide a complementary approach to existing RNA interaction assays.
Methods Used
- Preparation of DNA templates and in vitro transcription of RNAs labeled with Cy5.
- Purification of transcribed RNAs using phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation.
- Folding of RNAs under co-folding and separate folding conditions with crowding reagents (spermine, PEG 8000).
- Assembly of split Broccoli RNA reporters and addition of DFHBI-1T fluorophore.
- Fluorescence imaging using confocal microscopy and quantitative image analysis.
Main Results
- DFHBI-1T fluorescence was substantially higher in co-folded RNA samples compared to separately folded or single RNA controls.
- Co-folding of complementary split Broccoli RNAs resulted in up to 82.6-fold increases in fluorescence, indicating robust intermolecular base pairing.
- Mixed orientation pairs (shu-top with shu-anti-bottom, etc.) showed the highest fluorescence increases upon co-folding.
- Robust signal generation depended on crowding reagents and efficient RNA dimerization.
Conclusions
- The split Broccoli RNA reporter assay enables direct, quantitative assessment of intermolecular base pairing in RNA clusters.
- This method complements traditional RNA interaction assays such as pull-downs and gel electrophoresis.
- The assay can be used to study the effects of RNA sequence, helicases, and ions on RNA–RNA interactions in vitro.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Direct quantification of intermolecular RNA base pairing in vitro addresses a critical gap in early discovery, enabling mechanistic de-risking of RNA-driven clustering phenomena. The split Broccoli RNA reporter assay provides a quantitative, fluorescence-based readout for RNA–RNA interactions, supporting predictive confidence in target validation and assay development. This capability enhances portfolio triage by clarifying the molecular basis of RNA clustering under defined conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of RNA–RNA interaction hypotheses within clustered assemblies.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing specific intermolecular base pairing from background association.
- Provides quantitative data to inform target validation and early-stage portfolio decisions.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated RNA cluster systems for downstream screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible fluorescence outputs for assay benchmarking.
- Enables reliable evaluation of sequence, helicase, or ionic effects on RNA–RNA interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant RNA clustering models when mechanistic continuity is required.
- Supports risk-adjusted advancement by providing quantitative, comparative readouts across experimental conditions.
- Offers predictive de-risking for RNA-targeted therapeutic strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery continuum from hypothesis-driven target validation through assay development and preclinical mechanistic studies.
- Discovery Biology: Quantifies direct intermolecular base pairing, clarifying RNA clustering mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative fluorescence outputs for comparative analysis.
- Analytics: Enables statistical comparison of folding conditions and sequence variants using normalized fluorescence measurements.
- Translational Research: Supports continuity by modeling RNA–RNA interactions relevant to disease or therapeutic context.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for diverse RNA interaction studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RNA clustering studies.
- Operational Value: Standardizes detection and quantification of RNA–RNA interactions for scalable workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk for RNA-targeted assets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on direct, quantitative mechanistic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA biochemistry and fluorescence microscopy.
- Needs access to confocal imaging and quantitative image analysis infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of RNA preparation and folding protocols.
- May require adaptation for different RNA sequences or clustering models.
- Sensitivity depends on efficient dimerization and folding of split Broccoli RNAs and use of crowding reagents.
