Iniekcja do komór mózgowych danio pręgowanego

Procedura rozpoczyna się od określenia stadium rozwoju zarodków danio pręgowanego. Po osiągnięciu przez zarodki interesującego nas stadium należy usunąć je z osłonki jajowej. Następnie za pomocą końcówki pipety wykonuje się otwory w szalku powlekanym Aros w celu zamontowania zarodków, a następnie delikatnie umieszcza się zarodki w otworach ogonami do dołu.

Po zamontowaniu embrionów, do przestrzeni komorowej embrionu wstrzykuje się ostrożnie barwnik fluorescencyjny poprzez tylny mózg. Po wstrzyknięciu do komór wykonuje się obrazowanie embrionów, a następnie przetwarza dane w programie Photoshop. Cześć, nazywam się Jennifer Gutman i pracuję w laboratorium dr Hazel Sieve w Whitehead Institute for Biomedical Research przy MIT w Cambridge w stanie Massachusetts.

Dzisiaj przedstawimy procedurę wstrzyknięcia substancji do komór mózgu rybki danio. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu badania tworzenia się komór mózgu oraz morfogenezy neuroepithelium u żywych osobników zebrafish. Ze względu na przezroczystość zarodków rybki danio, charakterystyka kształtu komór mózgu może być utrudniona.

Technika ta jest przydatnym i prostym sposobem na odróżnienie wypełnionej płynem przestrzeni od otaczających tkanek oraz na charakterystykę embrionów mutantów, które mogą wykazywać wady w formowaniu się komór mózgu. Zacznijmy zatem. Aby przygotować się do iniekcji do komory mózgu ryby danio-zebry, rozpoczynamy od wykonania igieł do iniekcji.

Do wyciągania igieł kapilarnych wykorzystuje się polaryzator igieł instrumentu Sutter. Następnie igłę kapilarną wypełnia się barwnikiem fluorescencyjnym, takim jak Texas red dextrin. Wypełniona igła zostaje następnie zamocowana w mikromanipulatorze w aparaturze do mikroiniekcji.

Utnij igłę pod kątem do odpowiedniej wielkości. Aby utworzyć ściętą końcówkę, zmierz wielkość kropli z igły i sprawdź, czy wynosi ona od jednej do dwóch nanolitrów na iniekcję w oleju. Aby rozpocząć ten etap procedury, zarodki, zgodnie z klasyfikacją Kimmela, powinny zostać poddane iniekcji 30 minut wcześniej niż stadium, które jest przedmiotem zainteresowania.

Na przykład, aby badać komory mózgu w 24. godzinie po zapłodnieniu, należy wstrzyknąć preparat do embrionów w 23,5 godziny po zapłodnieniu. Embrion w interesującym nas stadium umieszcza się pod stereomikroskopem, a następnie za pomocą pęsety ostrożnie usuwa się błonę chorionową z embrionu. Następnie przygotowuje się naczynie z agarozą dla embrionów, wykorzystując plastikową płytkę pokrytą 1% agarozy; w agarozy wykonuje się otwory za pomocą plastikowego grotu pipety o pojemności od 1 do 200 µL.

Ostrożnie usuń za pomocą pęsety zatyczki aros z otworów. Przenieś embrion oraz pożywkę dla embrionów do naczynia aros z otworami. Do pożywki dodaj trica, aby znieczulić embrion i zapobiec jego ruchom.

W trakcie eksperymentu ostrożnie umieść embrion ogonem do dołu w otworze i zorientuj go tak, aby aparat do iniekcji znajdował się po stronie tylnej embrionu. Gdy embrion zostanie prawidłowo umieszczony i zorientowany w zagłębieniu naczynia, można przystąpić do iniekcji do komory mózgu. Najpierw ustaw układ mikromanipulacyjny w taki sposób, aby końcówka igły znajdowała się w tym samym polu widzenia co embrion przy dużym powiększeniu.

Ostrożnie wprowadź igłę przez cienką płytkę dachową tylnego mózgu, tuż za punktem przegięcia R0-R1, nie uszkadzając tkanki mózgowej poniżej, a następnie wstrzyknij taką ilość barwnika, aby całkowicie wypełnić komory. W zależności od stadium rozwoju embrionu wypełnienie przestrzeni komorowej może wymagać kilku zastrzyków. Po wstrzyknięciu preparatu i przygotowaniu embrionu do obrazowania, należy przygotować nową szalkę Agarose dla embrionu.

Używając czystej szalki powlekanej 1%aros, wykonaj w niej otwory i usuń korki. Przenieś zarodek do szalki i dodaj trica, aby znieczulić zarodek i zapobiec jego ruchom. Umieść ogon zarodka z wstrzykniętym materiałem do komory w otworze w pozycji umożliwiającej wykonanie obrazu grzbietowego.

Zarodek jest teraz gotowy do obrazowania. Wykonaj zdjęcie przy użyciu światła przechodzącego. Bardzo ważne jest, aby nie przesuwać zarodka ani mikroskopu.

Następnie zmień ustawienia mikroskopu i wykonaj zdjęcie w świetle fluorescencyjnym. Przepozycjonuj zarodek, aby wykonać zdjęcia boczne zarówno w świetle przechodzącym, jak i fluorescencyjnym. Zapisz wszystkie zdjęcia w plikach do późniejszej obróbki obrazu w programie Photoshop.

Aby przetworzyć obrazy w programie Photoshop, otwórz zdjęcia tego samego embrionu wykonane w tej samej pozycji w świetle przechodzącym oraz świetle fluorescencyjnym. Upewnij się, że wszystkie ustawienia są identyczne. W przypadku każdego obrazu przeciągnij zdjęcie fluorescencyjne na zdjęcie w świetle przechodzącym i dopasuj je dokładnie, mając zaznaczony obraz fluorescencyjny. Wybierz korekcję obrazu, a następnie zastąp kolor i zmień czarne tło na białe.

W oknie zastępowania kolorów (replace color) przesuń suwak czynnika rozmycia (fuzziness) w prawo, aż obraz fluorescencyjny będzie miał jednolity kolor. W oknie warstw wybierz opcję mnożenie (multiply). Aby wyświetlić obrazy nałożone, obraz przestrzeni komory powinien dokładnie pokrywać się z obrazem w świetle przechodzącym.

Zapisz ten plik i powtórz czynność dla pozostałych obrazów. Jeśli wstrzyknięcie do komory zostało wykonane prawidłowo, obrazy powinny mieć ostre krawędzie w obszarach, w których barwnik nie uległ rozproszeniu, co pokazano tutaj na obrazach z 25 godzin po zapłodnieniu. Panel A przedstawia obraz w polu jasnym, panel B obraz fluorescencyjny, a panel C obraz nałożony.

Widok boczny obrazu nałożonego przedstawiono w panelu D. Z drugiej strony, jeśli podczas wstrzykiwania do komory igła zostanie wprowadzona zbyt głęboko, przedostanie się ona w tkankę mózgową poniżej przestrzeni komorowej, co doprowadzi do błędnego wstrzyknięcia. Skutkuje to obecnością barwnika poza przestrzenią komorową oraz w żółtku, co pokazano tutaj. Panel E przedstawia obraz w jasnym polu.

Panel F przedstawia obraz fluorescencyjny, a panel G przedstawia obraz nałożony. Widok boczny obrazu nałożonego pokazano na panelu H. Strzałki wskazują obszary, w których barwnik przedostał się poza przestrzeń komór mózgowia. W tym filmie zademonstrowano sposób wstrzykiwania barwnika fluorescencyjnego do rozwijających się komór mózgowych danio przebrzanego.

Metoda ta jest wykorzystywana do wizualizacji przestrzeni komór mózgu w kontraście do otaczającego neuroepithelium i jest niezwykle przydatna do określania kształtu przestrzeni komorowej, jak również kształtu otaczającej tkanki mózgowej. Technika ta pozwala lepiej zrozumieć proces formowania się komór mózgu oraz morfogenezę mózgu w czasie w żywym embrionie. Stanowi ona doskonałe narzędzie do badania wad formowania się komór mózgu oraz do wstępnej charakterystyki mutantów morfogenezy mózgu.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.