Wstrzyknięcie komory mózgu danio pręgowanego

Procedura ta rozpoczyna się od oceny stopnia zarodków danio pręgowanego. Gdy zarodki osiągną etap zainteresowania, usuń je z korionu. Następnie tworzy się otwory w naczyniu pokrytym aros z końcówką pipety do mocowania zarodków, a zarodki są delikatnie umieszczane w otworach ogonami do dołu.

Po zamontowaniu zarodków fluorescencyjna matryca jest ostrożnie wstrzykiwana do przestrzeni komorowej zarodka przez tylną część mózgu. Po iniekcji komory zarodki są obrazowane, a dane są przetwarzane za pomocą Photoshopa. Cześć, nazywam się Jennifer Gutman i pracuję w laboratorium dr Hazel Sieve w Instytucie Badań Biomedycznych Whitehead w MIT w Cambridge w stanie Massachusetts.

Dzisiaj pokażemy Ci procedurę wstrzykiwania komory mózgu danio pręgowanego. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania tworzenia się komór mózgowych i morfogenezy nabłonka nerwowego u żywych danio pręgowanych. Ze względu na charakter przezroczystych zarodków danio pręgowanego scharakteryzowanie kształtu komory mózgu może być trudne.

Technika ta jest użytecznym i prostym sposobem na odróżnienie przestrzeni wypełnionej płynem od otaczającej tkanki i scharakteryzowanie zmutowanych zarodków, które mogą mieć wady tworzenia komór mózgowych. Więc zacznijmy. Aby przygotować się do wstrzyknięcia komory mózgowej danio pręgowanego, zaczynamy od wykonania igieł do wstrzykiwań.

Biegunowa igła instrumentu Sutter służy do ciągnięcia igieł kapilarnych. Igła kapilarna jest następnie wypełniana barwnikiem fluorescencyjnym, takim jak dekstryna czerwona teksana. Następnie napełniona igła jest montowana w mikromanipulatorze w aparacie do mikroiniekcji.

Przytnij igłę do odpowiedniego rozmiaru pod kątem. Aby utworzyć skośną końcówkę, zmierz wielkość kropli igły i sprawdź, czy wynosi od jednego do dwóch nanolitrów na wstrzyknięcie w oleju. Aby rozpocząć ten etap procedury, zarodki, według Kimmela we wszystkich zarodkach, powinny zostać wstrzyknięte 30 minut wcześniej niż etap zainteresowania.

Na przykład, aby zbadać komory po 24 godzinach od zapłodnienia, wstrzyknij zarodki po 23 i pół godzinie po zapłodnieniu. Zarodek na etapie zainteresowania umieszcza się pod mikroskopem stereoskopowym, a korion ostrożnie usuwa się z zarodka za pomocą kleszczy. Następnie przygotowuje się miskę aros dla zarodków za pomocą plastikowego naczynia pokrytego 1% otworami do wbijania aros w aros z plastikową końcówką pipety o pojemności od jednego do 200 mikrolitrów.

Ostrożnie wyjmij zatyczki aros z otworów za pomocą kleszczy. Przenieś zarodek i pożywkę zarodkową do naczynia aros z otworami. Dodaj trica do podłoża, aby znieczulić zarodek i zapobiec ruchom.

Podczas eksperymentu delikatnie umieść ogon zarodka w dół do otworu i ustaw go tak, aby aparat do wstrzykiwań znajdował się po tylnej stronie zarodka. Teraz, gdy zarodek jest prawidłowo umieszczony i zorientowany w naczyniu do powstawania, jesteśmy gotowi do wstrzyknięcia do komory mózgowej. Najpierw ustaw konfigurację mikromanipulacji tak, aby końcówka igły znajdowała się w tym samym polu widzenia, co zarodek o dużej mocy.

Ostrożnie przełóż igłę przez cienką płytkę dachową tylnej części mózgu tuż za punktem zawiasu R zero R, nie uderzając w tkankę mózgową poniżej, wstrzyknij tylko tyle barwnika, aby całkowicie wypełnić komory. Wypełnienie przestrzeni komory może wymagać kilku wstrzyknięć, w zależności od stadium zarodka. Gdy zarodek zostanie wstrzyknięty i jest gotowy do obrazowania, przygotowuje się nową miskę aros dla zarodka.

Używając czystego naczynia pokrytego 1%aros, zrób w naczyniu i wyjmij korki. Przenieś zarodek do naczynia i dodaj trica, aby znieczulić zarodek i zapobiec ruchowi. Umieść ogon zarodka, któremu wstrzyknięto komorę, w otwór w miejscu do uzyskania obrazu grzbietowego.

Zarodek jest teraz gotowy do obrazowania. Zrób zdjęcie w świetle przechodzącym. Bardzo ważne jest, aby nie ruszać zarodka ani mikroskopu.

Następnie zmień ustawienia mikroskopu i zrób zdjęcie w świetle fluorescencyjnym. Zmień położenie zarodka, aby wykonać zdjęcia boczne zarówno w świetle przechodzącym, jak i fluorescencyjnym. Zapisz wszystkie obrazy jako pliki do przetwarzania obrazu w programie Photoshop.

Aby przetworzyć obrazy w Photoshopie, otwórz obrazy w świetle przechodzącym i fluorescencyjnym tego samego zarodka wykonane w tej samej pozycji. Upewnij się, że wszystkie ustawienia są takie same Dla każdego obrazu przeciągnij obraz fluorescencyjny na obraz w świetle przechodzącym i wyrównaj je dokładnie z wybranym obrazem fluorescencyjnym. Wybierz dopasowania obrazu, a następnie zamień kolor i zmień czarne tło na białe.

W oknie zamiany koloru dostosuj współczynnik rozmycia w prawo, aż obraz fluorescencyjny będzie wyglądał na jednolity pod względem kolorów. W oknie warstw wybierz opcję pomnóż. Aby wyświetlić obrazy nakładki, obraz przestrzeni komór powinien być zgodny z obrazem w świetle przechodzącym. Dokładnie.

Zapisz ten plik i powtórz tę czynność dla wszystkich innych obrazów. Jeśli wstrzyknięcie do komory zostanie wykonane prawidłowo, obrazy powinny mieć ostre krawędzie w niedyfuzyjnym barwniku, jak pokazano na tych obrazach z 25 godzin. Po zapłodnieniu, podczas gdy typ zarodków panel A pokazuje obraz jasnego pola, panel B pokazuje obraz fluorescencyjny, a panel C pokazuje obraz nakładki.

Widok boczny obrazu nakładki jest pokazany w Panelu D. Z drugiej strony, jeśli podczas wstrzyknięcia do komory igła zostanie wprowadzona zbyt głęboko, dostanie się do tkanki mózgowej poniżej przestrzeni komory i doprowadzi do nieprawidłowego wstrzyknięcia. W ten sposób powstaje barwnik, który jest widoczny na zewnątrz przestrzeni komory i w żółtku, jak pokazano tutaj. Panel E pokazuje obraz w jasnym polu.

Panel F pokazuje obraz fluorescencyjny, a panel G pokazuje nałożony obraz. Widok boczny nałożonego obrazu jest pokazany w panelu H. Strzałki wskazują obszary, w których barwnik wyszedł poza przestrzeń komory mózgu. W tym filmie pokazaliśmy, jak wstrzyknąć barwnik fluorescencyjny do rozwijających się komór mózgowych danio pręgowanego.

Metoda ta służy do wizualizacji przestrzeni komory mózgu w przeciwieństwie do otaczającego nabłonka nerwowego i jest niezwykle przydatna do określania kształtu przestrzeni komory, a także kształtu otaczającej tkanki mózgowej. Technika ta pozwala nam lepiej zrozumieć proces tworzenia się komór mózgowych i morfogenezy mózgu w czasie u żywego zarodka. Jest to doskonałe narzędzie do badania wad tworzenia komór mózgowych oraz do wstępnej charakterystyki mutantów morfogenezy mózgu.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.