Name: Wstrzyknięcie komory mózgu danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Naucz się techniki wstrzyknięcia komory mózgu u embrionów Danio rerio, aby wizualizować przestrzenie wypełnione płynem i badać dynamikę neuroepitelialną. Ta metoda umożliwia obrazowanie żywych embrionów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Laurze Anne Lowery, która opracowała tę technikę w laboratorium. HS jest wspierany przez grant NIHMH70926. Jennifer Gutzman otrzymała wsparcie w ramach stypendium podoktorskiego CSBi/Merck.

Protokół
Część 1: Przygotowanie do mikroiniekcji
<ol>
	<li>Przygotuj się do wstrzyknięcia, wyciągając igły kapilarne za pomocą wyciągacza igieł firmy Sutter Instruments.</li>
	<li>Napełnij igłę barwnikiem fluorescencyjnym (np. Texas-Red Dextran).</li>
	<li>Zamocuj igłę w mikromanipulatorze i aparaturze do mikroiniekcji.</li>
	<li>Odetnij igłę pod kątem do odpowiedniej wielkości, aby utworzyć ściętą końcówkę.</li>
	<li>Zmierz wielkość kropli i upewnij się, że wynosi ona od 1-2nl na jedno wstrzyknięcie w oleju.</li>
</ol>
Część 2: Przygotowanie zarodków
<ol>
	<li>Wykonaj wstrzyknięcia do zarodków na 30 minut przed osiągnięciem interesującego etapu rozwojowego. Na przykład, aby badać komory mózgu w 24 godzinach po zapłodnieniu (hpf), wykonaj wstrzyknięcia w 23,5 hpf. Etap rozwoju zarodków określ zgodnie z metodą Kimmel i wsp. (4).</li>
	<li>Pod stereomikroskopem ostrożnie usuń chorion z zarodków, używając pęsety.</li>
	<li>W plastikowej płytce pokrytej 1% agarozą wykonaj otwory za pomocą plastikowego końcowki do pipety 1-200 μl. Ostrożnie usuń korki z agarozy z wykonanych otworów pęsetą.</li>
	<li>Przenieś zarodki w medium dla zarodków do płytki z agarozą z otworami.</li>
	<li>Dodaj do medium tricainę (przygotowaną zgodnie z metodą Westerfield (5)), aby znieczulić zarodki i zapobiec ich ruchom podczas eksperymentu.</li>
	<li>Delikatnie umieść zarodek ogonem w dół w otworze, orientując go tak, aby aparat do wstrzykiwania znajdował się po stronie tylnej zarodka.</li>
</ol>
Część 3: Iniekcja do komory mózgu
<ol>
	<li>Aby wstrzyknąć barwnik do komór mózgu, odpowiednio ustaw zestaw do mikromanipulacji, tak aby końcówka igły znajdowała się w tym samym polu widzenia co embrion przy dużym powiększeniu.</li>
	<li>Ostrożnie wprowadź igłę przez cienką płytkę dachową (roofplate) rombencephalonu, tuż za punktem przegięcia r0/r1, unikając uszkodzenia tkanki mózgowej znajdującej się poniżej.</li>
	<li>Wstrzyknij niewielką ilość barwnika, wystarczającą do całkowitego wypełnienia komór. W zależności od stadium rozwoju embrionu, wypełnienie przestrzeni komorowej może wymagać kilku kolejnych wstrzyknięć.</li>
</ol>
Część 4: Obrazowanie
<ol>
	<li>Używając czystej szalki powlekanej 1% agarozy, wykonaj w niej nowe otwory, usuń korki i dodaj trikainę, aby znieczulić zarodki i zapobiec ich poruszaniu się.</li>
	<li>Wprowadź ogon zarodka z zastrzykiem do komory do otworu i ustaw go w pozycji do wykonania obrazu grzbietowego.</li>
	<li>Wykonaj obraz przy użyciu światła przechodzącego.</li>
	<li>Kluczowe jest, aby NIE PORUSZAĆ ZARODKA ANI MIKROSKOPU.</li>
	<li>Zmień ustawienia mikroskopu i wykonaj obraz w świetle fluorescencyjnym.</li>
	<li>Przestaw zarodek, aby wykonać obrazy boczne zarówno w świetle przechodzącym, jak i fluorescencyjnym.</li>
	<li>Zapisz obrazy jako pliki TIFF w celu ich późniejszego przetwarzania w programie Photoshop.</li>
</ol>
Część 5: Przetwarzanie obrazów
<ol>
	<li>Aby przetworzyć obrazy w programie Photoshop, otwórz obrazy w świetle przechodzącym i fluorescencyjnym tego samego zarodka, wykonane w tej samej pozycji. Upewnij się, że wszystkie ustawienia są identyczne dla każdego obrazu.</li>
	<li>Przeciągnij obraz fluorescencyjny na obraz w świetle przechodzącym i dokładnie je wyrównaj.</li>
	<li>Przy zaznaczonym obrazie fluorescencyjnym wybierz „Obraz”, „Korekty”, a następnie „Zastąp kolor” i zmień czarne tło na białe.</li>
	<li>W oknie „Zastąp kolor” dostosuj parametr „rozmycie” (fuzziness), przesuwając suwak w prawo, aż obrazy fluorescencyjne będą miały jednolity kolor.</li>
	<li>W oknie „Warstwy” wybierz tryb „Mnożenie”, aby wyświetlić nałożone obrazy. Obraz przestrzeni komór powinien dokładnie pokrywać się z obrazem w świetle przechodzącym.</li>
	<li>Zapisz ten plik i powtórz czynność dla pozostałych obrazów.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki/efekty
Prawidłowe obrazy wstrzyknięcia do komory pokazano na rysunku 1, panele A-D, natomiast przykład nieprawidłowych obrazów wstrzyknięcia przedstawiono w panelach E-H. Prawidłowe wstrzyknięcia charakteryzują się ostrymi krawędziami i brakiem dyfuzji barwnika. Nieprawidłowe wstrzyknięcie, do którego dochodzi, gdy igła zostanie wprowadzona zbyt głęboko do komory i uszkodzi tkankę mózgową poniżej, może skutkować widocznością barwnika poza przestrzenią komory oraz w żółtku.
<img alt="Prawidłowa i nieprawidłowa iniekcja: obrazy w polu jasnym i fluorescencyjne, embrion rybki danio, analiza mikroskopowa." height="742" src="/files/ftp_upload/1218/1218fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1">
Rycina 1. Iniekcje do komór mózgu embrionów typu dzikiego w 25 hpf. (A-D) Przedstawiono przykład prawidłowej metody iniekcji oraz (E-H) przykład nieprawidłowej metody iniekcji. (A,E) Grzbietowe obrazy w polu jasnym z odpowiadającymi im obrazami fluorescencyjnymi (B,F) oraz nałożeniem obrazów fluorescencyjnych i w polu jasnym (C,G) dla obu pokazanych metod iniekcji (prawidłowej i nieprawidłowej). Strzałki wskazują obszary, w których barwnik przedostał się poza przestrzeń komór mózgu z powodu nieprawidłowej iniekcji (patrz „Rozwiązywanie problemów”). Na wszystkich obrazach strona przednia znajduje się po lewej stronie.
Rozwiązywanie problemów:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr style="font-weight:bold; font-size:16px;">
			<td>Problem</td>
			<td>Przyczyna</td>
			<td>Lekarstwo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zgniatają Państwo zarodek igłą.</td>
			<td>Igła jest zbyt tępa lub jej końcówka jest zbyt duża.</td>
			<td>Zacznij od użycia nowej igły i nie odłamaj jej zbyt daleko od nasady. Zaostrź końcówkę igły, aby uzyskać skos podobny do igły strzykawki.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barwnik znajduje się w całym embrionie oraz żółtku (patrz Rys. 1E-H).</td>
			<td>Igła przeszła przez tkankę i nie pozostała w przestrzeni komory.</td>
			<td>Igła może być niewystarczająco ostra, co uniemożliwia kontrolowanie prędkości nakłucia.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barwnik jest zbyt słaby lub nie znajduje się w przedmózgowiu.</td>
			<td>Zastosowano zbyt niskie ciśnienie podczas wstrzykiwania lub igła nie została przesunięta wystarczająco daleko w kierunku przednim, aby dotrzeć do przedmózgowia podczas podawania barwnika.</td>
			<td>Zwiększ ciśnienie wtrysku lub podczas wstrzykiwania wprowadź igłę nieco bardziej przednio. Jeśli wymagany jest większy poziom szczegółowości w przedmózgowiu, igłę można wprowadzić przez granicę między śródmózgowiem a rdzeniem przedłużonym. Można również po prostu odczekać chwilę, aż barwnik bardziej dyfunduje, przed przystąpieniem do obrazowania.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Obrazy fluorescencyjne są ciemne na krawędziach po wykonaniu zamiany kolorów w programie Photoshop.</td>
			<td>Zapomniano zmienić ustawienie „rozmycia” (fuzziness) w oknie zamiany kolorów.</td>
			<td>Przesuń suwak „rozmycia” (fuzziness) maksymalnie w prawo w oknie zastępowania kolorów.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igła nie przebije płytki dachowej mózgu tylnego.</td>
			<td>Igła nie została prawidłowo przycięta.</td>
			<td>Przygotuj nową igłę. W przypadku wykonywania wielu iniekcji może być konieczne użycie kilku igieł, ponieważ mogą one stępić się podczas pracy.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

<ol><li>Gutzman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+zebrafish+midbrain-hindbrain+boundary+constriction+requires+laminin-dependent+basal+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction.</a> Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).</li>
<li>Lowery, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+Classification+of+Zebrafish+Brain+Morphology+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec.+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Characterization and Classification of Zebrafish Brain Morphology Mutants.</a> Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).</li>
<li>Lowery, L. A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+formation+of+zebrafish+brain+ventricles+occurs+independently+of+circulation+and+requires+the+nagie+oko+and+snakehead%2Fatp1a1a.1+gene+products%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products.</a> Development. 132, 2057-2067 (2005).</li>
<li>Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish. , University of Oregon Press. (1995).</li>
</ol>

W tym filmie demonstrujemy, jak wstrzyknąć barwnik fluorescencyjny (dekstran Texas-Red) do rozwijających się komór mózgu rybki danio. Metoda ta jest wykorzystywana do wizualizacji przestrzeni komór mózgu w kontraście do otaczającego neuroepitelium i jest niezwykle użyteczna przy określaniu kształtu przestrzeni komorowej, jak również kształtu otaczającej tkanki mózgowej. Pozwala ona na lepsze zrozumienie procesu formowania się komór mózgu oraz morfogenezy mózgu w czasie w żywym embrionie. Technika ta stanowi doskonałe nar...

<table><tbody><tr><td>Pinceta</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Rurki kapilarne (igły)</td><td>Narzędzia</td><td>Frederick Haer and Co.</td><td>30-30-1</td><td></td></tr><tr><td>Szalki powlekane agarozą</td><td>Narzędzia</td><td>Agaroza (Seakem GTG; Lonza) Szalki (Corning)</td><td>Agaroza (50027) Szalki (430166)</td><td>Przygotować warstwę agarozy o głębokości około 2-3 mm w szalce, w zależności od stadium zarodka, w który wykonuje się wstrzyknięcie</td></tr><tr><td>Mikroskop sekcyjny</td><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera mikroskopowa z możliwością fluorescencji i oprogramowaniem do przechwytywania obrazu</td><td>Narzędzia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipety 1-200 &amp;mu;</td><td>Narzędzia</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-0806</td><td>Mają one idealny rozmiar do wykonywania otworów w agarozie, w których zarodki mieszczą się idealnie.</td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Analiza obrazu</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pętla do zarodków</td><td>Narzędzia</td><td></td><td></td><td>Wykonane samodzielnie z pipety szklanej i włosa lub żyłki wędkarskiej, uszczelnione woskiem pszczelim.</td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz</td><td>Narzędzia</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PL1-100</td><td></td></tr><tr><td>Wytciągacz igieł</td><td>Narzędzia</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>Ustawienia (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70).</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narzędzia</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barwnik fluorescencyjny Texas-Red Dextran 70,000MW</td><td>Odczynnik</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D1830</td><td>W razie potrzeby dostępne są inne masy cząsteczkowe.</td></tr><tr><td>Trykaina (estry etylowe kwasu 3-aminobenzoesowego)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Poziomka do zarodków</td><td>Odczynnik</td><td></td><td></td><td>Zgodnie z Westerfield (5)</td></tr></tbody></table>

iniekcja do komór mózgowych danio pręgowanego

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Prawidłowe formowanie się komór mózgu podczas embrionalnego rozwoju mózgu jest niezbędne dla jego prawidłowego funkcjonowania. Komory mózgu to wysoce konserwatywne jamie w obrębie mózgu, wypełnione płynem mózgowo-rdzeniowym. U danio pręgowanego, po formowaniu się cewy nerwowej, neuroepithelium przechodzi szereg zwężeń i fałdowań w miarę wypełniania się płynem, co prowadzi do powstania komór mózgu. Aby zrozumieć proces formowania się komór oraz towarzyszące mu zmiany kształtu neuroepithelium, opracowaliśmy metodę wizualizacji przestrzeni komorowej w porównaniu z tkanką mózgową. Jednak ze względu na przezroczystość embrionów danio pręgowanego, rozróżnienie tkanki od przestrzeni komorowej jest utrudnione. Opracowaliśmy zatem technikę wstrzykiwania do komór mózgu, w której przestrzeń komorowa jest wypełniana barwnikiem fluorescencyjnym, a następnie obrazowana za pomocą mikroskopii jasnopolowej i fluorescencyjnej. Obrazy jasnopolowe i fluorescencyjne są następnie przetwarzane i nakładane na siebie w programie Photoshop. Technika ta umożliwia wizualizację przestrzeni komorowej za pomocą barwnika fluorescencyjnego w odniesieniu do kształtu neuroepithelium widocznego na obrazie jasnopolowym. Wstrzykiwanie do komór mózgu u danio pręgowanego można stosować od 18 godziny po zapłodnieniu aż do wczesnych etapów larwalnych. Metoda ta była przez nas szeroko wykorzystywana w badaniach nad formowaniem się i morfogenezą komór mózgu, a także w charakterystyce mutantów morfogenezy mózgu (1-3).

Po uformowaniu się rurki neuralnej neuroepithelium ulega zwężeniu i fałdowaniu, podczas gdy rurka wypełnia się embrionalnym płynem mózgowo-rdzeniowym (eCSF), tworząc embrionalne komory mózgu. Opracowaliśmy tę technikę wstrzykiwania do komór, aby lepiej wizualizować wypełnioną płynem przestrzeń w kontraście do kształtu neuroepithelium w żywym embrionie.

Iniekcja do komór mózgowych danio pręgowanego

Prawidłowe formowanie się komór mózgu podczas embrionalnego rozwoju mózgu jest niezbędne dla jego prawidłowego funkcjonowania. Komory mózgu są wysoce konserwownymi...

Procedura ta rozpoczyna się od wyznaczenia stadium rozwoju embrionów rybek danio. Po osiągnięciu przez embriony interesującego nas stadium należy je usunąć z chorionu. Następnie za pomocą końcówki pipety w naczyniu pokrytym aros tworzy się otwory do montażu embrionów, a następnie delikatnie umieszcza się w nich embriony ogonami w dół.Po zamocowaniu embrionów, do przestrzeni komorowej embrionu wstrzykuje się ostrożnie barwnik fluorescencyjny poprzez tylny mózg. Po wstrzyknięciu do komory embriony są obrazowane, a dane przetwarzane przy użyciu programu Photoshop. Cześć, jestem Jennifer Gutman z laboratorium dr Hazel Sieve w Whitehead Institute for Biomedical Research w MIT w Cambridge, Massachusetts.Dzisiaj przedstawimy procedurę iniekcji do komór mózgu rybki danio. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu badania formowania się komór mózgu oraz morfogenezy neuroepithelialnej u żywych osobników zebrafish. Ze względu na przezroczystość embrionów rybki danio, charakteryzacja kształtu komór mózgu może być trudna.Technika ta jest użytecznym i prostym sposobem na odróżnienie przestrzeni wypełnionej płynem od otaczających tkanek oraz na charakterystykę embrionów mutantów, które mogą wykazywać defekty w tworzeniu komór mózgu. Zatem zacznijmy. Aby przygotować się do wstrzykiwania do komory mózgu danio pręgowanego, rozpoczynamy od wykonania igieł do iniekcji.Do wyciągania igieł kapilarnych wykorzystuje się wyciągarkę do kapilar Sutter. Następnie igłę kapilarną wypełnia się barwnikiem fluorescencyjnym, takim jak Texas red dextrin. W kolejnym kroku wypełnioną igłę montuje się w mikromanipulatorze w aparaturze do mikroiniekcji.Odetnij igłę pod kątem do odpowiedniej wielkości. Aby stworzyć ścięty czubek, zmierz wielkość kropli z igły i sprawdź, czy wynosi ona od 1 do 2 nanolitrów na wtrysk w oleju. Aby rozpocząć ten etap procedury, zarodki, zgodnie z klasyfikacją Kimmela, powinny zostać wstrzyknięte na 30 minut przed stadium, które jest przedmiotem zainteresowania.Na przykład, aby badać komory mózgu w 24. godzinie po zapłodnieniu, należy wstrzyknąć preparaty do embrionów w 23,5 godzinie po zapłodnieniu. Embrion w interesującym nas stadium umieszcza się pod stereomikroskopem, a chorion ostrożnie usuwa z embrionu za pomocą pęsety. Następnie przygotowuje się naczynie z agarozą dla embrionów, używając plastikowego naczynia pokrytego 1% agarozy; w agarozie wykonuje się otwory za pomocą plastikowego końcówki pipety o pojemności 1 do 200 µL.Ostrożnie usuń korki aros z otworów za pomocą pęsety. Przenieś embrion i pożywkę dla embrionów do szalki aros z otworami. Do pożywki dodaj trica, aby znieczulić embrion i zapobiec jego poruszaniu się.W trakcie eksperymentu ostrożnie umieść zarodek w otworze ogonem do dołu i zorientuj go tak, aby aparat do iniekcji znajdował się po stronie tylnej zarodka. Po prawidłowym umieszczeniu i zorientowaniu zarodka w naczyniu agarowym można przystąpić do iniekcji do komór mózgowych. Najpierw ustaw zestaw do mikromanipulacji w taki sposób, aby końcówka igły znajdowała się w tym samym polu widzenia co zarodek przy dużym powiększeniu.Ostrożnie wprowadź igłę przez cienką płytkę dachową tylnego mózgowia, tuż za punktem zawiasowym R0-R1, uważając, aby nie uszkodzić tkanki mózgowej znajdującej się poniżej, a następnie wstrzyknij taką ilość barwnika, aby całkowicie wypełnić komory. W zależności od stadium rozwoju zarodka wypełnienie przestrzeni komorowej może wymagać kilku wstrzyknięć. Po wstrzyknięciu barwnika i przygotowaniu zarodka do obrazowania należy przygotować nową szalkę Agarose dla zarodka.Używając czystej szalki powlekanej 1%aros, wykonaj w niej otwory i usuń wypychaczki. Przenieś zarodek do szalki i dodaj trica, aby znieczulić zarodek i zapobiec jego ruchom. Umieść ogon zarodka z wstrzykniętym do komory roztworem w otworze w pozycji umożliwiającej wykonanie obrazu grzbietowego.Zarodek jest teraz gotowy do obrazowania. Wykonaj zdjęcie w świetle przechodzącym. Bardzo ważne jest, aby nie poruszać zarodkiem ani mikroskopem.Następnie zmień ustawienia mikroskopu i wykonaj obraz w świetle fluorescencyjnym. Zmień położenie zarodka, aby wykonać obrazy boczne zarówno w świetle przechodzącym, jak i fluorescencyjnym. Zapisz wszystkie obrazy w plikach przeznaczonych do obróbki w programie Photoshop.Aby przetworzyć obrazy w programie Photoshop, otwórz obrazy tego samego embrionu wykonane w tej samej pozycji w świetle przechodzącym i fluorescencyjnym. Upewnij się, że wszystkie ustawienia są identyczne. W przypadku każdego obrazu przeciągnij obraz fluorescencyjny na obraz w świetle przechodzącym i precyzyjnie je wyrównaj, mając zaznaczony obraz fluorescencyjny. Wybierz korekcję obrazu, a następnie zastąp kolor i zmień czarne tło na białe.W oknie zastępowania koloru (replace color) przesuń suwak współczynnika rozmycia (fuzziness) w prawo, aż obraz fluorescencyjny będzie miał jednolity kolor. W oknie warstw (layers) wybierz tryb mnożenia (multiply). Aby wyświetlić obrazy nałożone, obraz przestrzeni komór bocznych powinien dokładnie pokrywać się z obrazem w świetle przechodzącym.Zapisz ten plik i powtórz czynność dla pozostałych obrazów. Jeśli iniekcja do komory została wykonana prawidłowo, obrazy powinny mieć ostre krawędzie w obszarach bez rozproszonego barwnika, co pokazano tutaj na obrazach z 25 godzin po zapłodnieniu. Panel A przedstawia obraz w świetle przechodzącym, panel B obraz fluorescencyjny, a panel C obraz nałożony.Widok boczny obrazu nałożonego przedstawiono na panelu D. Z drugiej strony, jeśli podczas wstrzykiwania do komory igła zostanie wprowadzona zbyt głęboko, wejdzie ona w tkankę mózgową poniżej przestrzeni komorowej, co doprowadzi do błędnego wstrzyknięcia. Skutkuje to widocznością barwnika poza przestrzenią komorową oraz w żółtku, jak pokazano tutaj. Panel E przedstawia obraz w jasnym polu.Panel F przedstawia obraz fluorescencyjny, a panel G przedstawia obraz nałożony. Widok boczny obrazu nałożonego pokazano na panelu H. Strzałki wskazują obszary, w których barwnik przedostał się poza przestrzeń komór mózgu. W tym filmie zademonstrowaliśmy, jak wstrzyknąć barwnik fluorescencyjny do rozwijających się komór mózgu rybek zebrafish.Metoda ta jest wykorzystywana do wizualizacji przestrzeni komór mózgu w kontraście do otaczającego je neuroepitelium i jest niezwykle użyteczna przy określaniu kształtu przestrzeni komorowej, jak również kształtu otaczającej tkanki mózgowej. Technika ta pozwala lepiej zrozumieć proces formowania się komór mózgu oraz morfogenezę mózgu w czasie w żywym embrionie. Stanowi doskonałe narzędzie do badania wad formowania się komór mózgu oraz do wstępnej charakterystyki mutantów morfogenezy mózgu.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wstrzyknięcie do komory mózgowej rybki zebrafish

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Przedstawiamy metodę pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) oraz tworzenia układu pozbawionego CSF w obrębie układu komorowego embrionalnego mózgu rybki zebrafish. Pozwala to na dalsze badanie składu CSF oraz jego roli w rozwoju embrionalnego mózgu.

Ręczny drenaż komór mózgu zarodka danio pręgowanego

Ten film opisuje elektroporację in vivo, która jest techniką dostarczania DNA do komórek ependymoglialnych u dorosłych ryb pręgowanych.

In vivo (in vivo) Elektroporacja: specyficzna dla danego miejsca metoda transfekcji danio pręgowanego

Ten film opisuje technikę mikrodysekcji mózgu dorosłego danio pręgowanego. Metoda ta pomaga w uzyskaniu neuorosfer pochodzących z całego mózgu, które można dalej badać.

Sekcja mózgu danio pręgowanego: technika neurobiologii ryb

Film demonstruje mikrowstrzykiwanie lipopolisacharydów (LPS) do mózgów larw danio pręgowanego w celu wywołania zapalenia nerwów. Larwy umieszcza się na naczyniu wyłożonym agarozą, igłę wprowadza się do komór mózgu i wstrzykuje się LPS. Wstrzyknięty LPS wywołuje odpowiedź immunologiczną, która prowadzi do zapalenia nerwów.

Wywoływanie zapalenia nerwów u larw danio pręgowanego za pomocą wstrzyknięcia lipopolisacharydu

Ten film demonstruje procedurę wstrzykiwania monomerycznych peptydów amyloidowych do przodomózgowia dorosłego danio pręgowanego w celu wytworzenia toksyczności amyloidu, naśladując uszkodzenia neuronów obserwowane w chorobie Alzheimera.

Ustalenie modelu choroby Alzheimera w mózgu danio pręgowanego poprzez wstrzyknięcie peptydu amyloidowego

W tym artykule demonstrujemy metodę manipulowania ekspresją genów w komórkach komorowych dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego za pomocą antysensownych oligonukleotydów morfolino. Przedstawiamy tę metodę jako skuteczny i szybki protokół, który można wykorzystać do badań funkcjonalnych w mózgu dorosłego kręgowca.

Mikromanipulacja ekspresją genów w mózgu dorosłego danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji oligonukleotydów morfolino do komory mózgowej

Opisano obrazowanie rozwoju naczyń mózgowych u larw danio pręgowanego. Dostępne są również techniki ułatwiające obrazowanie 3D i modyfikujące rozwój naczyń mózgowych za pomocą zabiegów chemicznych.

Obrazowanie i rekonstrukcja 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego

Ta metoda polega na wstrzyknięciu 0,5−3 μL roztworu do klatki piersiowej dorosłego danio pręgowanego. Procedura skutecznie dostarcza białka i związki chemiczne w pobliże serca danio pręgowanego, nie uszkadzając przy tym narządu. Podejście to nadaje się do badania wpływu czynników egzogennych na różne tkanki serca.

Wstrzyknięcie do klatki piersiowej w celu zbadania serca dorosłego danio pręgowanego

Niniejszy protokół opisuje wstrzykiwanie domózgowo-komorowe (ICV) dorosłej danio pręgowanej neurotoksycznej 6-hydroksydopaminy (6-OHDA) w brzuszne międzymózgowie (Dn) oraz ocenę upośledzenia i późniejszej regeneracji zachowania podczas pływania po zmianie za pomocą testu otwartego zbiornika, któremu towarzyszy analiza za pomocą oprogramowania do śledzenia wideo.

Ocena lokomotoryczna indukowanego przez 6-hydroksydopaminę modelu choroby Parkinsona u dorosłych ryb danio pręgowanego

Ten protokół demonstruje mikroiniekcję lipopolisacharydu do obszaru komorowego mózgu w modelu larwalnym danio pręgowanego w celu zbadania wynikowej reakcji neurozapalnej i neurotoksyczności.

Mikroiniekcje lipopolisacharydu do komór mózgowych larwom danio pręgowanego w celu oceny zapalenia nerwów i neurotoksyczności

Naucz się techniki wstrzyknięcia komory mózgu u embrionów Danio rerio, aby wizualizować przestrzenie wypełnione płynem i badać dynamikę neuroepitelialną. Ta metoda umożliwia obrazowanie żywych embrionów w czasie rzeczywistym.

Iniekcja do komór mózgowych danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów