Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu danio pręgowanego za pomocą mikroskopii konfokalnej

Procedura ta rozpoczyna się od wstrzyknięcia jednokomórkowego zarodka rybki danio, umieszczonego w formie wtryskowej tak, aby komórka była skierowana tyłem do aparatu wtryskowego. Następnie zarodki są wstrzykiwane MRNA, a igła przechodzi przez żółtko do komórki. Następnego dnia.

Plastikowy zamek montażowy wypełniony jest aros. Następnie znieczulony zarodek umieszcza się odwrócony w otworze w aros, który jest obrazowany mikroskopią konfokalną. Cześć, nazywam się Grabham z laboratorium dr Hazel Sieve w Instytucie Whiteheada ds. Badań Biomedycznych oraz z wydziału biologii na MIT.

Dziś pokażemy procedurę wstrzyknięcia zarodków danio pręgowanego na etapie pojedynczej komórki oraz późniejsze obrazowanie mózgu na żywo za pomocą mikroskopii konfokalnej. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania morfogenezy mózgu kręgowców z rozdzielczością pojedynczych komórek. Więc zaczynajmy.

mRNA używane w tej procedurze jest transkrybowane z plazmidu kodującego C-A-X-E-G-F-P-R-N-A-A błonowego GFP (GFP). Najpierw liniaryzuję plazmid przez trawienie bez jednego, a następnie transkrybuję membranowe mRNA GFP z zlinearyzowanego plazmidu za pomocą komunikatu M i zestawu maszynowego po transkrypcji mRNA, ilościowo rozcieńczając powstałe mRNA i wodę do jednego mikrogramu na jeden mikrolitr, Eloqua i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu potrzeby. Dzień przed wstrzykiem ustawiano klatki godowe, oddzielając samce od samic w dniu wstrzyknięcia. Użyj instrumentu nastawiającego Micropipet Polar, aby wyciągać igły kapilarne do wstrzykiwania.

Przygotuj formę do wtrysków o stężeniu 1% AGA z pasami o szerokości zarodków na etapie jednej komórki w dniu wstrzyknięcia, rozmroz aliquot membranowego mRNA GFP w stężeniu jednego mikrograma na mikrolitr na lodzie. Rozcieńcz mRNA od jednego do pięciu w wodzie do końcowego stężenia 200 nanogramów na mikrolitr i trzymaj na lodzie. Załaduj igłę kapilarną jednym mikrolitrem przygotowanej błony GFP mRNA w dawce 200 nanogramów na mikrolitr.

Tutaj dodajemy 0,05% fenolu czerwonego do mRNA, aby było widoczne do zastrzyków. Włóż załadowaną igłę do mikromanipulatora podłączonego do mikrowtryskiwacza zasilanego gazem. Dostosuj objętość wtrysku do jednego nanolitra.

Następnie zdejmij przegrody z dzikich ryb ustawionych w klatkach godowych z poprzedniego dnia. Zbieraj zarodki zaraz po złożeniu. Napełnij formę do wtrysku róż AGA medium do zarodków i ułóż zarodki w formie, ustawiając pojedynczą komórkę z boku od mikromanipulatora.

Wstrzyknij przez korion i żółtka tak, aby mRNA zostało zdeponowane bezpośrednio do pojedynczej komórki. Wstrzyknąć około 50 zarodków na eksperyment. Jednak jeśli komórka się podzieliła, nie wstrzykuj po wstrzyknięciu zarodków, inkubuj je przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza w pożywce zarodkowym.

Po inkubacji nocnej zarodki są gotowe do montażu i obrazowania. Aby rozpocząć zabieg, usuń corion z embrionów kleszczami pod mikroskopem stereo na godzinę przed punktem docelowym, przygotuj szkiełko do montażu do czterech zarodków. Następnie wypełnij slajd 0,7% aros tylko do górnej części i poczekaj około 20 minut lub aż aros się zastygnie.

Gdy aros się zastygnie, wykonaj mały otwór w aerosie za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby utworzyć cylindryczne otwory do zamontowania każdego zarodka. Usuń korki aros kleszczami przed montażem. Umieść zarodki na szkiełku wypełnionym aeros pod mikroskopem rozcinającym.

Dodaj 50 mikrolitrów trica do znieczulenia. Zarodki. Użyj kleszczy, aby ukierunkować zarodki odwrócone w cylindrycznych otworach w aros z mózgiem lub obszarem zainteresowania przy podłożu pokrywy.

Zarodki w AGA wyrosły z kolejnym osłoną i zabezpieczone silikonowym smarem próżniowym. Zarodki są już gotowe do obrazowania. Obraz zarodka wykonaj za pomocą odwróconego fluorescencyjnego mikroskopu konfokalnego laserowego, jak pokazano tutaj, lub obrazowania w obracającym się dysku konfokalnym z prędkością 63 razy lub wyższą, aby zebrać obrazy pojedynczych komórek w nabłonku nerwowym o wysokiej rozdzielczości.

Obrazy są eksportowane jako pliki TIF z oprogramowania LSM i analizowane w Photoshopie. Jest to reprezentatywne zdjęcie konfokalne zarodka danio pręgowanego 24-godzinnego, nabłonka nerwowego pomiędzy śródmózgiem a tylną częścią mózgu. M oznacza śródmózgowień, komorę, a H komorę tylną mózgu.

Każda komórka jest oznakowana membraną GFPE. Właśnie zademonstrowaliśmy technikę, która pozwala analizować rozwijający się mózg danio pręgowanego jako rozdzielczość pojedynczych komórek. Ta technika pozwoliła nam badać nowy typ zmiany kształtu komórki zwanej zwężeniem bazalnym BA.

Może być również wykorzystywany do analizy innych zjawisk oraz do znaczącego poszerzenia naszej wiedzy o organogenezie kręgów oraz ich podstawowej biologii komórkowej. I to wszystko. Dzięki za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.