Name: Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu danio pręgowanego za pomocą mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Poznaj metodę obrazowania na żywo rozwijającego się mózgu embrionów Danio rerio z rozdzielczością pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia szczegółowe badanie neurogenezy kręgowców.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Serdeczne podziękowania kierujemy do dr Jennifer Gutzman, która jako pierwsza opracowała tę technikę w laboratorium Sive. Dziękujemy również J. B. Greenowi z Dana-Farber Cancer Institute w Bostonie, MA, za uprzejme udostępnienie plazmidu kodującego mRNA CAAX-GFP. Obrazowanie konfokalne zostało przeprowadzone w W. M. Keck Foundation Biological Imaging Facility w Whitehead. HS jest wspierany przez NIHMH70926. EG jest wspierany przez stypendium przeddoktorskie NSF.

1. Przygotowanie mRNA do iniekcji
<ol>
	<li>mRNA użyte w tej procedurze jest transkrybowane z plazmidu kodującego mRNA CAAX-eGFP (memGFP). Najpierw należy zlinearyzować plazmid zgodnie z metodą Gutzman et al, 2008.</li>
	<li>Następnie przeprowadzić transkrypcję mRNA memGFP przy użyciu zestawu mMessage mMachine.</li>
	<li>Otrzymane mRNA rozcieńczyć do stężenia 1μg/μl, podzielić na alykwoaty i przechowywać w temperaturze -80°C.</li>
	<li>Przygotować formę do iniekcji z 1% agarozy z kanałami o szerokości odpowiadającej rozmiarowi embrionów w stadium jednej komórki.</li>
	<li>W dniu poprzedzającym iniekcję przygotować klatki do kojarzenia, oddzielając samca od samic.</li>
	<li>W dniu iniekcji wyciągnąć igły kapilarne za pomocą wyciągacza do mikropipet w celu przygotowania do iniekcji.</li>
</ol>
2. Wstrzykiwanie mRNA
<ol>
	<li>W dniu iniekcji rozmrozić na lodzie alikwot mRNA memGFP o stężeniu 1μg/μl.</li>
	<li>Rozcieńczyć mRNA w wodzie w stosunku 1:5 do końcowego stężenia 200ng/μl i przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Napełnić igłę kapilarną 1μl przygotowanego mRNA memGFP o stężeniu 200ng/μl.</li>
	<li>Umieścić napełnioną igłę w mikromanipulatorze podłączonym do mikroinjektora pneumatycznego.</li>
	<li>Ustawić objętość iniekcji na 1nl.</li>
	<li>Usunąć przegrody z klatek do rozrodu, w których od poprzedniego dnia znajdowały się ryby typu dzikiego.</li>
	<li>Zebrać embriony natychmiast po ich złożeniu. Umieścić je w agarowej formie do iniekcji, przykrytej medium dla embrionów (Westerfield, 1995), tak aby jednokomórkowy embrion był skierowany stroną od mikromanipulatora.</li>
	<li>Wykonać iniekcję przez chorion i żółtko w taki sposób, aby mRNA zostało wprowadzone bezpośrednio do jednej komórki. W każdym doświadczeniu zainiekować około 50 embrionów. Nie przeprowadzać iniekcji, jeśli komórka uległa już podziałowi.</li>
	<li>Inkubować embriony przez noc w temperaturze 28°C w medium dla embrionów.</li>
</ol>
3. Montowanie i obrazowanie embrionów
<ol>
	<li>Aby zamontować i zobrazować zarodki, należy usunąć chorion z zarodków za pomocą pęsety pod stereomikroskopem na godzinę przed interesowanym punktem czasowym.</li>
	<li>Przygotować preparat do zamontowania do 4 zarodków.
	<ul>
		<li>Użyć silikonowego smaru próżniowego do uszczelnienia szkiełka nakrywki na spodzie specjalnie zaprojektowanego plastikowego preparatu o grubości 2mm z otworem o średnicy około 1cm.</li>
		<li>Wypełnić otwór w preparacie 0,7% agarozą i odstawić na około 20 minut lub do czasu stwardnienia.</li>
		<li>Po zestaleniu się agarozy usunąć mały korek za pomocą końcówek pipety 200μl, aby utworzyć cylindryczne otwory, w których zostaną zamontowane poszczególne zarodki.</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Umieścić zarodki na wypełnionym agarozą preparacie pod mikroskopem sekcyjnym. Dodać 50μl tricainy (Westerfield, 1995), aby znieczulić zarodki.</li>
	<li>Za pomocą pęsety ustawić zarodki w cylindrycznych otworach w agarozie tak, aby mózg lub interesujący region przylegały do znajdującego się poniżej szkiełka nakrywki.</li>
	<li>Przykryć zarodki w agarozie kolejną szklaną nakrywką zabezpieczoną silikonowym smarem próżniowym.</li>
	<li>Wyonać obrazowanie zarodka przy użyciu odwróconego, fluorescencyjnego mikroskopu konfokalnego z laserowym skanowaniem lub dyskiem wirującym. Obrazować przy powiększeniu 63x lub wyższym, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości pojedynczych komórek w obrębie neuroepitelium.</li>
	<li>Obrazy są eksportowane jako pliki TIFF z oprogramowania LSM i analizowane za pomocą programu Photoshop.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki/rezultaty
Na Rysunku 1 przedstawiono reprezentatywny obraz konfokalny neuroepithelium zarodka rybki danio w 24 hpf, w obszarze pomiędzy komorami mózgu środkowego i tylnego. Każda komórka została oznakowana GFP związanym z błoną.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, struktura komórkowa, powiększenie 63x, lokalizacja białek, analiza biologiczna." height="449" src="/files/ftp_upload/1217/1217fig1.jpg" width="450" data-altupdatedat="1773047343000"> 
Rycina 1. Obrazowanie konfokalne na żywo zarodka danio pręgowanego w 24 hpf po wstrzyknięciu memGFP. 
(A) Neuroepithelium zarodka w 24 hpf, w którym każda komórka jest obrysowana przez GFP. Obrazowany obszar oddziela komory śródmózgowia i ruda mózgu (odpowiednio M i H), tworząc granicę między śródmózgiem a ruda mózgu.

<ol><li>Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+zebrafish+midbrain-hindbrain+boundary+constriction+requires+laminin-dependent+basal+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction.</a> Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+a+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish%22">The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish</a>. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).</li>
</ol>

W tym filmie prezentujemy metodę wstrzykiwania mRNA do pojedynczych komórek embrionów ryby danio-ostrobramy. Wykorzystujemy tutaj mRNA kodujące GFP skierowane do błony komórkowej w celu oznakowania każdej komórki. Następnie demonstrujemy, jak zamocować i obrazować rozwijający się mózg z rozdzielczością pojedynczej komórki. Technika ta pozwoliła nam zbadać nowy rodzaj zmiany kształtu komórek – konstrikcję podstawną, która jest niezbędna do utworzenia granicy śródmózgowia i rąbka mózgu (Gutzman et al, 2008). Podobna analiz...

<table><tbody><tr><td>Agaroza SeaKem GTG</td><td >Odczynnik</td><td>Lonza Inc.</td><td>50027</td><td></td></tr><tr><td>Ester etylowy kwasu 3-aminobenzoowego (Trykaina)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Rurka kapilarna</td><td>Narzędzie</td><td>Frederick Haer and Co.</td><td>30-30-1</td><td>Borosil 1,0mmOD x 0,5mm ID/włókno 100mm</td></tr><tr><td>Silikonowy smar próżniowy</td><td>Odczynnik</td><td>VWR international</td><td>W0S717</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>11232-20</td><td>Dumont #5 Bio Inox</td></tr><tr><td> końcówki do pipety 1-200 &amp;mu;l</td><td>Narzędzie</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>111-0806</td><td>Są one odpowiedniej wielkości dla zarodków w wieku 24 hpf.</td></tr><tr><td>zestaw do transkrypcji mMessage mMachine</td><td>Odczynnik</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>Polimeraza RNA SP6</td></tr><tr><td>Skanujący konfokalny mikroskop Zeiss LSM 510</td><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narzędzie</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrowstrzykiwacz</td><td>Narzędzie</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>Wytwornik mikropipet</td><td>Narzędzie</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

W tym filmie prezentujemy metodę opracowaną w naszym laboratorium w celu analizy zmian kształtu komórek oraz przemieszczeń niezbędnych do zgięcia i sfałdowania rozwijającego się mózgu danio pręgowanego (Gutzman et al, 2008). Taka analiza pozwala na nowe zrozumienie podstaw biologii komórki niezbędnej do rozwoju trójwymiarowej struktury mózgu kręgowców i znacząco zwiększa nasze możliwości badania morfogenezy rurki neuralnej. Kształtowanie się zarodkowego mózgu danio pręgowanego rozpoczyna się w 18. godzinie po zapłodnieniu (hpf), gdy pompują się komory wewnątrz neuroepitelium. Do 24. godziny hpf pierwsze etapy morfogenezy rurki neuralnej są zakończone. Stosując opisaną tutaj metodę, do zarodków w stadium jednej komórki wstrzykuje się mRNA kodujące skierowane do błony białko fluorescencyjne GFP (memGFP). Po wstrzyknięciu i inkubacji zarodek (obecnie między 18. a 24. godziną hpf) zostaje unieruchomiony w pozycji odwróconej w agarozie i poddany obrazowaniu za pomocą mikroskopii konfokalnej. Warto zauważyć, że zarodek danio pręgowanego jest przezroczysty, co czyni go idealnym systemem do obrazowania fluorescencyjnego. Choć nasze analizy koncentrowały się na granicy śródmózgowia i rombencephalonu oraz na samym rombencephalonie, metodę tę można rozszerzyć na analizę dowolnego regionu danio pręgowanego do głębokości 80–100 $\mu$m.

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

W tym filmie prezentujemy opracowaną przez nasz zespół metodę analizy zmian kształtu komórek oraz przebudów niezbędnych do wygięcia i sfałdowania ...

Procedura rozpoczyna się od iniekcji do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, który jest umieszczony w formie do iniekcji w taki sposób, aby komórka była skierowana w stronę przeciwną do aparatu do iniekcji. Następnie do embrionów wstrzykuje się mRNA, przesuwając igłę przez żółtko do wnętrza komórki. Następnego dnia.Plastikowe szkiełko montażowe wypełnia się agarem. Następnie znieczulony embrion umieszcza się odwrócony w otworze w agarze i obrazuje za pomocą mikroskopii konfokalnej. Cześć, jestem Grabham z laboratorium dr Hazel Sieve w Whitehead Institute for Biomedical Research oraz z wydziału biologii na MIT.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę mikroiniekcji embrionów danio prążkowanego na etapie jednej komórki oraz następujące po niej obrazowanie żywego mózgu za pomocą mikroskopii konfokalnej. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania morfogenezy mózgu kręgowców z rozdzielczością pojedynczych komórek. Zaczynajmy.mRNA użyty w tej procedurze jest transkrybowany z plazmidu kodującego GFP związaną z błoną C-A-X-E-G-F-P-R-N-A-A. Najpierw należy zlinearyzować plazmid poprzez trawienie enzymatyczne, a następnie przeprowadzić transkrypcję mRNA dla GFP błonowego z zlinearyzowanego plazmidu, używając zestawu do transkrypcji mRNA. Po zakończeniu transkrypcji mRNA należy określić jego stężenie, a następnie rozcieńczyć otrzymany mRNA w wodzie do stężenia 1 µg/µL, eluegojąc i przechowując w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Dzień przed iniekcją należy przygotować klatki do kojarzenia, oddzielając samce od samic w dniu iniekcji. Do wyciągnięcia igieł kapilarnych do iniekcji należy użyć odciągacza mikrokapilar.Przygotuj formę wtryskową 1%AGA rose z kanałami o szerokości odpowiadającej embrionom w stadium jednej komórki w dniu iniekcji, rozmroź na lodzie alikwot mRNA membrane GFP o stężeniu 1 µg/µL. Rozcieńcz mRNA w wodzie w stosunku 1:5 do stężenia końcowego 200 ng/µL i przechowuj na lodzie. Napełnij igłę kapilarną 1 µL przygotowanego mRNA membrane GFP o stężeniu 200 ng/µL.W tym kroku dodajemy 0,05% czerwieni fenolowej do mRNA, aby uczynić je widocznym podczas iniekcji. Umieść napełnioną igłę w mikromanipulatorze połączonym z mikrowstrzykiwaczem pneumatycznym. Ustaw objętość iniekcji na jeden nanolitr.Następnie wyjmij przegrody z klatek kopulacyjnych, w których od poprzedniego dnia znajdowały się ryby typu dzikiego. Zbierz zarodki niezwłocznie po ich złożeniu. Napełnij formę do mikroiniekcji AGA rose medium do zarodków, a następnie ułóż zarodki w formie tak, aby stadium jednej komórki było skierowane w stronę przeciwną do mikromanipulatora.Wstrzyknij przez chorion i żółtko w taki sposób, aby mRNA zostało zdeponowane bezpośrednio w pojedynczej komórce. Wstrzyknij do około 50 embrionów na eksperyment. Jeśli jednak komórka uległa podziałowi, nie wykonuj wstrzykiwania; po zakończeniu procedury wstrzykiwania embrionów inkubuj je przez noc w temperaturze 28°C w pożywce dla embrionów.Po inkubacji całonocnej wstrzyknięte embriony są gotowe do montowania i obrazowania. Aby rozpocząć tę procedurę, na godzinę przed interesującym punktem czasowym usuń pęcherzyk żółtkowy z embrionów za pomocą pęsety pod mikroskopem stereoskopowym, a następnie przygotuj szkiełko do montowania do czterech embrionów. Następnie wypełnij szkiełko 0,7% aros aż do górnej krawędzi i odczekaj około 20 minut lub do momentu stężenia się aros.Po zestaleniu się agarosu, za pomocą końcówki pipety 200 µL wykonaj w agarosie mały otwór, tworząc otwory cylindryczne, w których zostaną zamocowane poszczególne embriony. Przed montażem usuń korki z agarosu za pomocą pincety. Umieść embriony na szkiełku wypełnionym agarosem pod mikroskopem stereoskopowym.Dodaj 50 µL trica w celu znieczulenia embrionów. Za pomocą pęsety umieść embriony w pozycji odwróconej w cylindrycznych otworach w agarze, tak aby mózg lub obszar zainteresowania przylegał do znajdującego się poniżej szkiełka podstawowego.Zarodki w AGA przykryto kolejnym szkiełkiem podstawnym i zabezpieczono silikonowym smarem próżniowym. Zarodki są teraz gotowe do obrazowania. Należy obrazować zarodek za pomocą odwróconego fluorescencyjnego skaningowego mikroskopu konfokalnego, tak jak pokazano tutaj, lub mikroskopu konfokalnego z dyskiem wirującym przy powiększeniu 63 x lub wyższym, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości pojedynczych komórek w obrębie neuroepithelium.Obrazy są eksportowane z oprogramowania LSM w formacie plików TIF, a następnie analizowane w programie Photoshop. Jest to reprezentacyjny obraz konfokalny 24-godzinnego zarodka rybki danio, przedstawiający neuroepitel pomiędzy komorami mózgu przedniego i tylnego. M oznacza komorę mózgu przedniego, a H oznacza komorę mózgu tylnego.Każda komórka jest oznakowana związanym z błoną GFPE. Przedstawiliśmy właśnie technikę, która pozwala na analizę rozwijającego się mózgu rybki danio na poziomie pojedynczych komórek. Technika ta umożliwiła nam zbadanie nowego rodzaju zmiany kształtu komórek, nazywanej przykurczem podstawnym (basal constriction) BA.Można go również wykorzystać do analizy innych rodzajów zjawisk oraz do znacznego poszerzenia naszej wiedzy na temat organogenezy kręgów, a także leżącej u jej podstaw biologii komórki. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

live-imaging-of-the-zebrafish-embryonic-brain-by-confocal-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu danio pręgowanego za pomocą mikroskopii konfokalnej

Niniejszy protokół opisuje obrazowanie poszczególnych neuronów lub komórek grzebienia neuronalnego w żywych embrionach danio pruzebrzuchego. Metoda ta jest wykorzystywana do badania zachowań komórkowych oraz lokalizacji aktyny przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse.

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

Kluczem do zrozumienia procesów morfogenetycznych kształtujących wczesny embrion jest możliwość obrazowania komórek w wysokiej rozdzielczości. Opisujemy tutaj technikę znakowania pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek w całych embrionach ryby danio pręgowanej za pomocą białka GFP skierowanego do błony komórkowej.

Znakowanie i obrazowanie komórek w rdzeniu przedłużonym rybki danio

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Opisano obrazowanie rozwoju naczyń mózgowych u larw danio pręgowanego. Dostępne są również techniki ułatwiające obrazowanie 3D i modyfikujące rozwój naczyń mózgowych za pomocą zabiegów chemicznych.

Obrazowanie i rekonstrukcja 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy uniwersalną metodę montażu, która pozwala na długoterminowe obrazowanie poklatkowe rozwoju tylnej części ciała żywych zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnego rozwoju.

Uniwersalna metoda montażu do długoterminowego obrazowania rozwoju danio pręgowanego

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem, które może być użyte do zbadania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego. W tym miejscu opisujemy technikę wykorzystania poklatkowej mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dużej liczby wielokolorowych komórek znakowanych Brainbow w czasie rzeczywistym w rozwijającym się układzie nerwowym danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwijającego się mózgu u żyjących danio pręgowanych za pomocą Brainbow i poklatkowego obrazowania konfokalnego

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania in vivo całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej. Procedura eksperymentalna obejmuje przygotowanie próbki, akwizycję obrazu i wizualizację.

In vivo (in vivo) Obrazowanie całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej

Pokazujemy metodę, która wykorzystuje szybką skaningową mikroskopię konfokalną do wykonywania na żywo obrazowania komórek mikrogleju w rozwijającym się tektum wzrokowym danio pręgowanego, umożliwiając analizę dynamiki tych komórek in vivo.

Obrazowanie na żywo i charakterystyka dynamiki mikrogleju w zarodku danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania aktywności neuronalnej w obszarach mózgu transgenicznego danio pręgowanego, które wyrażają wskaźniki wapnia GCaMP za pomocą mikroskopii konfokalnej.

In vivo (in vivo) Konfokalne obrazowanie fluorescencyjne aktywności neuronalnej wywołanej stymulacją sensoryczną u częściowo unieruchomionych larw danio pręgowanego

Poznaj metodę obrazowania na żywo rozwijającego się mózgu embrionów Danio rerio z rozdzielczością pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia szczegółowe badanie neurogenezy kręgowców.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Przeglądaj więcej filmów