Unikanie osmotyczne w Caenorhabditis elegans: funkcja synaptyczna dwóch genów, ortologów ludzkiego NRXN1 i NLGN1, jako kandydatów na autyzm

Witam, nazywam się Manuel Ruiz Rubio na Wydziale Genetyki Uniwersytetu w Kordobie w Hiszpanii. Używamy elegancji jako narzędzia eksperymentalnego W badaniu autyzmu, korzystając z Świat charakteryzował układ nerwowy o trzech elegancji. Badamy mutację nicienia, skuteczną w genach zaangażowanych w synapsy nerwowe, która jest związana z autyzmem.

Rein Regans to cząsteczki adhezyjne błony obecne w synaptyce. Głowa elegancji C zawiera amfi, narząd czuciowy nicienia, który pośrednio reaguje na różne bodźce, w tym siłę osmotyczną. Amfi składa się z 12 czuciowych neuronów bipo o podobnej wysokości i jednym działaniu końcowym INAP.

Dwa z tych neuronów, o nazwie A, SH, po prawej i lewej stronie, są szczególnie ważne w osmotycznych funkcjach czuciowych. Wykrywanie rozpuszczalnego w wodzie rebalansu o wysokiej sile osmotycznej. Cześć, Wino z rzeki Nan z metodą nieba do pomiaru unikania osmotycznego w mutantach wad synaps przodków.

Aby ocenić implikacje unikania neuro i neuro wysokiej siły osmotycznej, opisaliśmy różną odpowiedź C na mutanty wadliwe w genach neuroneuronalnych przy użyciu metody opartej na roztworze fruktozy czteromolowej. Zadzwoń w dniu powiedzenia, przygotuj czteromolowy roztwór podstawowy fruktozy z 1% czerwieni Kongo i całkowicie rozpuszcza się w temperaturze pokojowej. Pierścień pierścieniowy o średnicy jednego centymetra na płycie NGM znajduje się na środku ośrodka stałego.

Używając 15 mikrolitrów czerwonego czteromolowego roztworu fruktozy. Pozwól, aby fruktoza wsiąknęła w akr przez około pięć minut, eksperyment należy przeprowadzić na ślepo. Płytka z każdym szczepem, który ma być S ósemką, powinna być oznaczona przez drugiego eksperymentatora.

SA jest wykonywany przy użyciu tych znaków, że nie są one pytane. Po zakończeniu eksperymentu na około 24 godziny przed przeprowadzeniem sprzedaży, konieczne jest pobranie L czterech larw z każdego genotypu i przeniesienie ich na płytkę AFL NGM zawierającą bakterie E. coli i utrzymanie jej w temperaturze 20 stopni Celsjusza następnego dnia. Eksperyment należy rozpocząć od młodych dorosłych.

Umieść pojedynczego robaka każdego szczepu w kręgu spoczynkowym i podążaj za każdym zwierzęciem do czasu, gdy jego reakcja na barierę tikową. 10 zwierząt z każdego szczepu i co najmniej trzy repliki eksperymentów, które powinniśmy przeprowadzić, aby uzyskać rozstrzygający wynik. Te, które unikają czerwonego pierścienia sześć razy z rzędu, są klasyfikowane jako normalne.

Te, które opuszczają pierścień w mniej niż sześciu próbach, są uważane za wadliwe w kontroli wrażliwości osmozy, szczep kontrolny musi być używany w każdym SA Bristol, a dwa zwierzęta są używane jako kontrole pozytywne, ponieważ należy ich unikać Bariera pierścieniowa. Szczepy kontrolne reagują wstecz, gdy znajdą barierę osmotyczną składającą się z czterech molowych fruktozy. Bomby mutantów z niedoborem neurologicznym zachowują się podobnie jak te pod względem siły jednego typu.

Jednak mutanty z niedoborem NEUR nie wykryły tej bariery osmotycznej. Samochód o podwójnej sile mutacji w różnych allelach atywnych i nout odzyskał fenotyp typu dzikiego reagujący na siłę osmotyczną w celu uzyskania robaków puchowych przez interferencję RNA żywienie izolowanych kolonii szczepu e coli HD 11 pięć, który został przekształcony wektorem L 44 40 zawierającym fragment odpowiadający genowi docelowemu. Następnego dnia bakterie izoluje się na LBA lub płytce z węglanem.

Wybierz kolonię bakterii i zaszczep płynną pożywkę LV. Kontynuuj dorastanie przez około siedem godzin, potrząsając w temperaturze 37 stopni. Zobacz kroplę tej kultury na płytkę NGM z sufitem węglowym i IPTG i wai przez noc w temperaturze pokojowej, umożliwiając rozwój bakterii i rozpoczynając indukcję ekspresji fragmentu docelowego genu.

Konieczne jest zastosowanie kontroli dodatniej i nieujemnej dla interferencji RNA. Eksperymenty żywieniowe. Kontrola ujemna jest równa.

I HT 11 pięć szczepów przekształconych za pomocą wektora TL 44 40. Kontrole pozytywne ELI HT 11 pięciokomórkowe przekształcone wektorem L 44 40 zawierającym sekwencję genu 22. Blokada tego genu wywodzi się z drżącego fenotypu, który można łatwo odróżnić pod sterylnym mikroskopem.

Pierwszy dzień. L czterostopniowe z NGM PLA z bakteriami przenoszone są na płytkę z bakteriami i Kuwejtem w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 12 godzin. Jest to okres postu.

Następnego dnia przenieś szybkiego młodego dorosłego na płytkę zaszczepioną bakteriami wykazującymi ekspresję specyficznego genu docelowego interferencji RNA. Pozostaw około 48 godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza na uzyskanie potomstwa F1. Następnie wybierz kilka dorosłych bomb F1 na inną płytkę zaszczepioną tymi samymi bakteriami przez następne dwa dni.

Wybierz i wyizoluj młodych dorosłych z F dwa potomstwo Punktacja dla fenotypów Bristol N dwa dzikie szczepy tłuszczu z bakteriami występującymi empatią. Wektor L 44 40 cofał się, gdy był w porządku. Bariera osmotyczna.

Bristol I prawdziwy biały szczep karmiony bakteriami wyrażającymi fragment genu neur z elegancji nie wykrył palców u nóg dla roztworów trzonowych. Jednak mutant z niedoborem neurów, niezdolny do wykrycia bariery osmotycznej, odzyskał tę zdolność, gdy był karmiony bakteriami wyrażającymi fragment genu nane Z morskiej elegancji. W tym filmie pokazujemy prostą metodę, która pozwala zbadać wpływ genów na reakcję unikania osmotycznego w elegancji morskiej.

Pierścień formalnego fruktozy formalnej z czerwienią Kongo służy do analizy reakcji bomby na siłę osmotyczną. Neurologia u mutantów z niedoborem jest wadliwa w tej odpowiedzi, jednak mutanty NU nie są upośledzone w wykrywaniu stresu tomo, wykazując reakcję podobną do szczepu typu dzikiego. Ten film pokazuje, że podwójnie zmutowane szczepy przenoszące różne allele nokautu w genach ing i uwalniających odzyskały fenotyp typu dzikiego reagując na siłę osmotyczną.

Obserwacje te zostały potwierdzone przy użyciu interferencji RNA, podejścia polegającego na blokadzie karmienia. W ten sposób szczep typu dzikiego został upośledzony w rozpoznawaniu bariery osmotycznej, gdy był karmiony bakteriami wykazującymi ekspresję zgodnie z sekwencją genu ING. Z drugiej strony, mutanty z wadami neuronów, które nie są w stanie wykryć czterech dodatkowych roztworów fruktozy, odzyskały to zachowanie, gdy były karmione bakteriami wykazującymi ekspresję zgodnie z sekwencją genu NNU.

Wyniki pokazane w tym eksperymencie wskazują, że widzenie i neur mogą być zaangażowane w połączenie synaptyczne neuronów czuciowych nicienia, a także, że oddziałują one ze sobą w sposób, który wpływa na funkcję synaptyczną. Dobra, do widzenia i powodzenia w eksperymentach.