Name: Unikanie osmotyczne w Caenorhabditis elegans: funkcja synaptyczna dwóch genów, ortologów ludzkiego NRXN1 i NLGN1, jako kandydatów na autyzm (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-11T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Poznaj metodę badania unikania osmotycznego w Caenorhabditis elegans w kontekście genów kandydujących na autyzm. Technika ta pozwala analizować funkcje synaptyczne neureksyn i neuroligin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr. Antonio Miranda-Vizuete za jego cenną pomoc. Pragniemy również wyrazić wdzięczność Salmie Boulayoune i Isabel Caballero za cenny wsparcie techniczne. Praca ta została sfinansowana z grantu Junta de Andalucıa (BIO-272). Niniejsze badania zostały przeprowadzone zgodnie z obowiązującymi przepisami prawa regulującymi eksperymenty genetyczne w Europie.

1: Test unikania osmotycznego.
<ol>
<li>Około 16-24 godziny przed analizą należy przenieść zwierzęta w stadium larwalnym L4 każdego genotypu na nową płytkę NGM zawierającą E. coli OP50 i inkubować je w temperaturze 20 °C. Następnego dnia eksperyment należy rozpocząć z młodymi osobnikami dorosłymi.</li>
<li>Zaleca się przeprowadzenie analizy metodą „ślepej próby”. Płytki z każdym badanym szczepem powinny zostać ponownie oznakowane przez drugiego eksperymentatora; analiza powinna być przeprowadzona przy użyciu tych ponownie oznakowanych płytek, a kod zostanie ujawniony po zakończeniu eksperymentu.</li>
<li>W dniu analizy należy przygotować 4M roztwór zapasowy fruktozy z 1% roztworem czerwieni kongowej i całkowicie rozpuścić go w temperaturze pokojowej. Zalecamy sprawdzenie roztworu przed każdą analizą, ponieważ barwnik z czasem może wytrącić się z roztworu.</li>
<li>Pierścień (o średnicy 1 cm) na płytce NGM wyznacza się w centrum stałego podłoża, nanosząc 15 μl czerwonego 4M roztworu fruktozy. Należy odczekać, aż roztwór fruktozy wniknie w agar, co zazwyczaj zajmuje od 2 do 5 minut.</li>
<li>Należy umieścić pojedyncze młode osobniki dorosłe każdego szczepu wewnątrz pierścienia i obserwować je przez kolejne 10 minut, aby określić reakcję na barierę osmotyczną. Zwierzęta, które unikają pierścienia więcej niż sześć razy z rzędu, klasyfikuje się jako normalne; te, które opuszczają pierścień w mniej niż sześciu próbach, są uznawane za wadliwe pod kątem wrażliwości osmotycznej. 
Uwaga: W każdej analizie należy użyć szczepu kontrolnego. Młode osobniki dorosłe N2 służą jako kontrole pozytywne, ponieważ zdecydowanie unikają bariery pierścienia. Nie należy używać zwierząt, które były wcześniej głodzone, przeszły przez stadium larwy Dauer lub pochodzą z płytek, które są zbyt suche. Na początku należy ocenić zwierzęta kontrolne w dwóch powtórzeniach, aby potwierdzić poprawność płytek analitycznych i roztworu.</li>
</ol>
2: Generowanie nicieni z wyciszonymi genami za pomocą karmienia RNAi.
<ol>
<li>Płytki RNAi: Płytki do karmienia RNAi NGM zawierają na litr: 17 g agaru, 2,5 g peptonu, 3,0 g NaCl, 1 ml cholesterolu (5 mg ml-1); napełnić kolbę wodą H2O do objętości 1 litra i autoklawować. Po ostygnięciu agaru do około 65 °C dodać 25 ml 1 M KPO4, pH 6,0, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, 0,5 ml karbenicyliny (50 mg ml-1) oraz 1 ml 1 M IPTG. W przypadku rozpoczęcia pracy z gotowym stałym podłożem NGM, należy stopić podłoże w mikrofalówce, a następnie pozostawić ciekłe NGM na blacie do ostygnięcia i dodać KPO4, pH 6,0, CaCl2, MgSO4, karbenicylynę oraz IPTG zgodnie z powyższymi instrukcjami. 
 Wlać 10 ml podłoża NGM do każdej 60 mm szalki Petriego. Pozostawić do ostygnięcia i odwrócić płytki, przechowując je w temperaturze pokojowej (RT) przez noc przed użyciem. Płytki można przechowywać w plastikowym worku w temperaturze 4 °C przez około 4-5 dni.</li>
<li>Przygotowanie i indukcja bakterii: Wyizolować kolonie szczepu E. coli HT15 (DE3), transformowanego wektorem L40 zawierającym fragment odpowiadający genowi docelowemu, na płytki z agarem Luria-Bertani (LB) (17 g agaru, 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu z drożdży i 10 g NaCl na litr) zawierające ampicylinę (50 μg/ml) i tetracyklinę (15 μg/ml). 
Nabrać pojedynczą kolonię bakterii i zaszczepić do LB z 50 μg/ml ampicyliny, a następnie hodować przez 6-8 h z wytrząsaniem w 37 °C; nanieść kroplę tej hodowli na przygotowane płytki NGM i dokładnie osuszyć płytki przed inkubacją przez noc (12-24 h) w temperaturze pokojowej, aby umożliwić wzrost bakterii i rozpoczęcie indukcji. Inkubację prowadzono w ciemności, ponieważ tetracyklina jest światłoczuła, co może wpływać na zmienność wyników testów RNAi między płytkami. 
W eksperymentach z karmieniem RNAi konieczne jest zastosowanie kontroli pozytywnej i negatywnej. Kontrolą pozytywną są komórki E. coli HT15 transformowane wektorem L40 zawierającym sekwencję genu unc-2. Wyciszenie genu unc-2 powoduje wystąpienie „fenotypu drgawek”. Kontrolą negatywną są komórki E. coli HT15 transformowane pustym wektorem L440.</li>
<li>Obsługa i ocena nicieni: Pierwszego dnia przenieść nicienie w stadium L4 z płytki NGM zaszczepionej OP50 na płytki NGM bez bakterii i inkubować w 20 °C przez 12 godzin (post). 
Następnego dnia przenieść młode, głodzone dorosłe hermafrodyty na płytkę zaszczepioną bakteriami wykazującymi RNAi specyficznego genu docelowego. Pozostawić na 40-48 godzin w 20 °C w celu uzyskania potomstwa F1. 
Następnie przenieść kilka dorosłych nicieni F1 na inną płytkę zaszczepioną tymi samymi bakteriami. Po 24-48 godzinach wyselekcjonować i wyizolować z potomstwa F2 młode osobniki dorosłe (całkowicie wykształcona, wystająca vulva z kilkoma jajami) i ocenić fenotypy. 
Uwaga: indukcja RNAi w neuronach posiada pewne ograniczenia ze względu na właściwości refrakcyjne układu nerwowego C. elegans na RNAi. Aby pokonać problemy związane z tą niewydajnością w neuronach, zaleca się stosowanie szczepu rrf-3, który wykazuje nadwrażliwość na efekty RNAi w neuronach 10. W naszych eksperymentach nie stwierdzono różnic między szczepami Bristol N2 i rrf-3 dla analizowanych genów i fenotypów.</li>
</ol>
3: Wykorzystane szczepy.
Szczepy C. elegans wykorzystane w tej pracy przedstawiono w Tabeli 1. Szczepy mutantów poddano krzyżowaniu zwrotnemu z typem dzikim N2-typu co najmniej cztery razy, aby usunąć niepożądane przypadkowe mutacje, które mogły powstać podczas protokołu mutagenezy.
OP50 E. coli szczep został dostarczony przez Caenorhabditis Centrum Genetyki, University of Minnesota, USA. E. coli Szczep HT15 (DE3) z plazmidem pL40 zawierającym fragmenty genów nrx-1 (JA:C29A12.5) oraz nlg-1 (JA:C40C9.5) został udostępniony przez dr. Petera Askjaera z Centro Andaluz de Biología del Desarrollo (CABD), CSIC Universidad Pablo Olavide w Sewilli w Hiszpanii.
4: Reprezentatywne wyniki.
Przykładowe wyniki przedstawiono na rysunkach 1 i 2. Badaniem objęto dziesięć zwierząt każdego szczepu, a eksperyment powtórzono co najmniej trzykrotnie.
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający frakcję osobników reagujących na barierę. Uwzględnia mutacje genetyczne, takie jak nrx-1 i nlg-1." src="/files/ftp_upload/1616/1616Fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Eksperymenty dotyczące zachowania unikania osmotycznego. 
Szczepy kontrolne i nrx-1 (ok1649 i tm1961)V robaki z mutacją deficytową reagują, cofając się, po napotkaniu bariery osmotycznej (4M fruktozy). nlg-1 (Należy pamiętać, że w przypadku braku tekstu źródowego do przetłumaczenia, nie mogę wygenerować tłumaczenia. Proszę o dostarczenie treści naukowej lub edukacyjnej z JoVE, którą należy przełożyć na język polski. i tm474) X mutanty nie wykrywają tej bariery. Podwójne mutanty z niedoborem nlg-1 i nrx-1, szczepy CRR21 (Podstawy techniki Western blot: oddzielanie białek w elektroforezie żelowej SDS-PAGE i detekcja przeciwciałami ; Niestety, dostarczony przez Ciebie tekst składa się jedynie z kodu „ok259”. Proszę o przesłanie pełnej treści źródłowej w języku angielskim, którą należy przetłumaczyć na język polski zgodnie z wytycznymi dla treści naukowych JoVE.)VX oraz CRR23 (tm1961; ok259)VX odzyskano fenotyp typu dzikiego. Gwiazdka (*) oznacza istotne różnice (P ≤ 0,01) w odpowiedzi każdego szczepu w stosunku do typu dzikiego Bristol N2, wykazane testem t-Studenta 
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający frakcję odpowiedzi na barierę w szczepach genetycznych: N2, nrx-1, nlg-1; analiza porównawcza." src="/files/ftp_upload/1616/1616Fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rysunek 2. Eksperymenty z użyciem nicieni z wyciszeniem genów metodą RNAi poprzez podawanie pokarmu. E. coli HT15 (DE3) przekształcone pustym wektorem pL40 lub wektorem zawierającym fragment odpowiadający genom docelowym nrx-1 lub nlg-1 wykorzystano do karmienia różnych szczepów nicieni. * oznacza istotne różnice (P ≤ 0,001) w teście t-Studenta w odpowiedzi szczepu N2 karmionego bakteriami niosącymi wektor pL40 z fragmentem celującym w nlg-1 gen w porównaniu z przeciągiem N2 zasilanym pustym wektorem pL40.

<ol><li>Sudhof, T. C. Nature. 455 (7215), 903-903 (2008).</li>
<li>Fabrichny, I. P., Leone, P., Sulzenbacher, G. Neuron. 56 (6), 979-979 (2007).</li>
<li>Garber, K. Science. 317 (5835), 190-190 (2007).</li>
<li>Wang, K., Zhang, H., Ma, D. Nature. 459 (7246), 528-528 (2009).</li>
<li>Ward, S., Thomson, N., White, J. G. The Journal of comparative neurology. 160 (3), 313-313 (1975).</li>
<li>Bargmann, C. I., Thomas, J. H., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+Spring+Harbor+symposia+on+quantitative+biology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology.</a> 55, 529-529 (1990).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomsom, J. N., Brenner, S. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 314, 1-1 (1986).</li>
<li>Culotti, J. G., Russell, R. L. Genetics. 90 (2), 243-243 (1978).</li>
<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K. Nature. 391 (6669), 806-806 (1998).</li>
<li>Timmons, L., Fire, A. Nature. 395 (6705), 854-854 (1998).</li>
<li>Simmer, F., Tijsterman, M., Parrish, S., Koushika, S. P., Nonet, M. L., Fire, A., Ahringer, J., Plasterk, R. H. Curr Biol. 12, 1317-1317 (2002).</li>
<li>Missler, M., Zhang, W., Rohlmann, A. Nature. 423 (6943), 939-939 (2003).</li>
<li>Varoqueaux, F., Aramuni, G., Rawson, R. L. Neuron. 51 (6), 741-741 (2006).</li>
<li>Graf, E. R., Zhang, X., Jin, S. X., Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J. Cell. 119 (7), 1013-1013 (2004).</li>
<li>Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J. Cell. 101 (6), 657-657 (2000).</li>
<li>Jamain, S., Quach, H., Betancur, C. Nature genetics. 34 (1), 27-27 (2003).</li>
<li>Szatmari, P., Paterson, A. D., Zwaigenbaum , L. Nature genetics. 39 (3), 319-319 (2007).</li>
</ol>

Neureksyny i neuroliginy pełnią kluczowe role w transmisji synaptycznej11 oraz różnicowaniu połączeń synaptycznych 12. Obie cząsteczki zostały zidentyfikowane jako geny kandydackie dla autyzmu 13,14.
W tym filmie przedstawiamy prostą metodę, która pozwala na badanie wpływu genów oddziałujących na reakcję unikania osmotycznego u C. elegans. Mutanty z niedoborem neuroliginy wykazują defekt w wykrywaniu siły osmotycznej; natomiast mutanty z niedoborem ne...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;tytuł_jove&quot;&gt;Tabela 1. &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; szczepy.&lt;/p&gt;&lt;tabela obramowanie=&quot;1&quot; cellpadding=&quot;0&quot; odstępy między komórkami=&quot;0&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Szczep&lt;/strong&gt; &lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Gen&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Allel&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Źródło&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Bristol N2&lt;/td&gt; &lt;td&gt;-&lt;/td&gt; &lt;td&gt;-&lt;/td&gt; &lt;td&gt;aCGC&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;VC228&lt;/td&gt; &lt;td&gt;nlg-1&lt;/td&gt; &lt;td&gt;ok259&lt;/td&gt; &lt;td&gt;CGC&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;FX00474&lt;/td&gt; &lt;td&gt;nlg-1&lt;/td&gt; &lt;td&gt;tm474&lt;/td&gt; &lt;td&gt;bNBP-JAPAN&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;VC1416&lt;/td&gt; &lt;td&gt;nrx-1&lt;/td&gt; &lt;td&gt;ok1649&lt;/td&gt; &lt;td&gt;CGC&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;FX1961&lt;/td&gt; &lt;td&gt;nrx-1&lt;/td&gt; &lt;td&gt;tm1961&lt;/td&gt; &lt;td&gt;NBP-JAPAN&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;NL2099&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rrf-3&lt;/td&gt; &lt;td&gt;pk1436&lt;/td&gt; &lt;td&gt;CGC&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;CRR21&lt;/td&gt; &lt;td&gt;nrx-1; nlg-1&lt;/td&gt; &lt;td&gt;ok1649; ok259&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Niniejsza praca&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;CRR22&lt;/td&gt; &lt;td&gt;nrx-1; nlg-1&lt;/td&gt; &lt;td&gt;tm1961;ok259&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Niniejsza praca&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;a.&lt;em&gt; Caenorhabditis&lt;/em&gt; Centrum Genetyki, University of Minnesota, USA.&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;b. Narodowy Projekt Biozasobów dla Zwierząt Doświadczalnych &quot;Nicień &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt;&quot;Tokyo Women&amp;rsquo;Uniwersytet Medyczny, &lt;em&gt;Japonia.&lt;/em&gt;&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

unikanie osmotyczne u caenorhabditis elegans: funkcja synaptyczna dwóch genów, ortologów ludzkich genów nrxn1 i nlgn1, jako kandydatów w badaniach nad autyzmem

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neureksyny i neuroliginy są cząsteczkami adhezyjnymi obecnymi w synapsach pobudzających i hamujących i są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania sieci neuronalnych1. Białka te znajdują się w błonach presynaptycznych i postsynaptycznych 2. Badania na myszach wskazują, że neureksyny i neuroliginy odgrywają kluczową rolę w przekazywaniu sygnałów synaptycznych 1. Niedawne doniesienia wykazały, że zaburzenia połączeń neuronalnych podczas rozwoju ludzkiego układu nerwowego mogą stanowić podstawę etiologii wielu przypadków zaburzeń ze spektrum autyzmu 3.
Caenorhabditis elegans może być wykorzystany jako narzędzie eksperymentalne ułatwiające badanie funkcjonowania komponentów synaptycznych ze względu na prostotę prowadzenia doświadczeń laboratoryjnych oraz fakt, że jego układ nerwowy i okablowanie synaptyczne zostały w pełni scharakteryzowane. W C. elegans nrx-1 i nlg-1 geny są ortologiczne do ludzkich NRXN1 i NLGN1 geny kodujące odpowiednio białka alfa-neureksynę-1 i neuroliginę-1. U ludzi i nicieni organizacja neureksyn i neuroligin jest podobna pod względem domen funkcjonalnych.
Głowa nicienia zawiera amfid, narząd zmysłowy nicienia, który pośredniczy w reakcjach na różne bodźce, w tym na siłę osmotyczną. Amfid składa się z 12 sensorycznych neuronów dwubiegunowych z rzęskowatymi dendrytami i jednego presynaptycznego aksonu terminalnego 4. Dwa z tych neuronów, nazwane ASHR i ASHL, są szczególnie istotne dla funkcji sensorycznej osmotycznej, wykrywając rozpuszczalne w wodzie repelenty o wysokiej sile osmotycznej 5. Dendryty tych dwóch neuronów sięgają koniuszka otworu gębowego, a aksony rozciągają się do pierścienia nerwowego, gdzie tworzą połączenia synaptyczne z innymi neuronami determinującymi odpowiedź behawioralną 6.
Aby ocenić rolę neureksyn i neuroligin w unikaniu wysokiego ciśnienia osmotycznego, przedstawiamy zróżnicowaną odpowiedź mutantów C. elegans z defektami w nrx-1 i nlg-1 genów, stosując metodę opartą na pierścieniu z 4M fruktozą 7Fenotypy behawioralne potwierdzono przy użyciu specyficznych klonów RNAi. 8W C. elegansdsRNA niezbędne do wywołania RNAi można podać drogą pokarmową 9Podanie dsRNA wraz z pożywieniem indukuje interferencję RNAi w obrębie interesującego nas genu, co umożliwia identyfikację komponentów genetycznych oraz ścieżek sieciowych.

Neureksyny i neuroliginy są białkami adhezyjnymi błony neuronów, które pełnią kluczowe role w różnicowaniu i transmisji synaptycznej. Mutanty C. elegans z niedoborem neuroliginy wykazują defekt w wykrywaniu siły osmotycznej, jednak gdy posiadają one również mutację w genie kodującym neureksynę, odzyskują fenotyp typu dzikiego.

Unikanie osmotyczne u Caenorhabditis elegans: funkcja synaptyczna dwóch genów, ortologów ludzkich genów NRXN1 i NLGN1, jako kandydatów w badaniach nad autyzmem

Neureksyny i neuroliginy to cząsteczki adhezyjne obecne w synapsach pobudzających i hamujących, niezbędne do prawidłowego funkcjonowania sieci neuronalnych1. Białka te znajdują się w błonach presynaptycznych i postsynaptycznych2. Badania na myszach wskazują, że neureksyny i neuroliginy pełnią istotną rolę w transmisji synaptycznej1. Niedawne doniesienia wykazały, że zaburzenia połączeń neuronalnych podczas rozwoju ludzkiego układu nerwowego mogą stanowić podstawę etiologii licznych przypadków zaburzeń spektrum autyzmu3. Caenorhabditis elegans może służyć jako narzędzie eksperymentalne ułatwiające badanie funkcjonowania komponentów synaptycznych ze względu na prostotę w eksperymentach laboratoryjnych oraz fakt, że jego układ nerwowy i okablowanie synaptyczne zostały w pełni scharakteryzowane. U C. elegans geny nrx-1 i nlg-1 są ortologiczne do ludzkich genów NRXN1 i NLGN1, które kodują odpowiednio białka alfa-neureksynę-1 i neuroliginę-1. U ludzi i nicieni organizacja neureksyn i neuroligin jest podobna pod względem domen funkcjonalnych. Głowa nicienia zawiera amfid, organ sensoryczny nicienia, który pośredniczy w odpowiedziach na różne bodźce, w tym na siłę osmotyczną. Amfid składa się z 12 sensorycznych neuronów dwubiegunowych z rzęskowatymi dendrytami i jednego aksonu z terminalem presynaptycznym4. Dwa z tych neuronów, nazwane ASHR i ASHL, są szczególnie ważne w funkcji sensorycznej osmotycznej, wykrywając rozpuszczalne w wodzie repelenty o wysokiej sile osmotycznej5. Dendryty tych dwóch neuronów wydłużają się do końcówki otworu gębowego, a aksony rozciągają się do pierścienia nerwowego, gdzie tworzą połączenia synaptyczne z innymi neuronami, determinując odpowiedź behawioralną6. Aby ocenić znaczenie neureksyny i neuroliginy w unikaniu wysokiej siły osmotycznej, przedstawiamy różnice w odpowiedzi mutantów C. elegans z defektami w genach nrx-1 i nlg-1, wykorzystując metodę opartą na pierścieniu 4M fruktozy7. Fenotypy behawioralne zostały potwierdzone przy użyciu specyficznych klonów RNAi8. U C. elegans dsRNA niezbędne do wywołania RNAi można podać drogą pokarmową9. Dostarczenie dsRNA wraz z pożywieniem indukuje interferencję RNAi w interesującym nas genie, co pozwala na identyfikację komponentów genetycznych i szlaków sieciowych.

Witajcie, nazywam się Manuel Ruiz Rubio i reprezentuję Katedrę Genetyki Uniwersytetu w Kordobie w Hiszpanii. Wykorzystujemy organizm C. elegans jako narzędzie eksperymentalne w badaniach nad autyzmem, korzystając z faktu, że jego układ nerwowy został w pełni scharakteryzowany. Badamy mutanty nicieni z defektami w genach zaangażowanych w synapsy neuronalne, które zostały powiązane z autyzmem.Neureksyny i neuroliginy są cząsteczkami adhezyjnymi błony obecnymi w synapsach. Głowa C. elegans zawiera amfid, narząd zmysłowy nicienia, który pośredniczy w odpowiedziach na różne bodźce, w tym na siłę osmotyczną. Amfid składa się z 12 sensorycznych neuronów bipolarnych z rzęskowatymi dendrytami i jednego aksonu z terminalem presynaptycznym.Dwa z tych neuronów, nazwane ASHR i ASHL, są szczególnie istotne dla funkcji sensorycznych związanych z osmolarnością, wykrywając rozpuszczalne w wodzie repelenty o wysokim potencjale osmotycznym. Przedstawiamy metodę opartą na pierścieniu fruktozy 4M do pomiaru unikania wysokiego stężenia osmotycznego u mutantów z defektami synaptycznymi u C. elegans.Aby ocenić wpływ neureksyn i neuroligin na unikanie wysokiego ciśnienia osmotycznego, opisaliśmy odmienną reakcję C. elegans przeciwko mutantom z defektami w genach nrx-1 i nlg-1, stosując metodę opartą na czteromolowym roztworze fruktozy. W dniu doświadczenia należy przygotować czteromolowy roztwór stokowy fruktozy z 1% czerwieni kongowego i całkowicie go rozpuścić w temperaturze pokojowej. Pierścień o średnicy jednego centymetra na płytce NGM należy narysować w centrum stałej pożywki.Należy użyć 15 µL czerwonego, czteromolarnego roztworu fruktozy. Pozostawić fruktozę do nasiąknięcia w agarze przez około pięć minut; eksperyment powinien być przeprowadzony w sposób ślepy. Płytka z każdym szczepem przeznaczonym do testowania powinna zostać oznakowana przez drugiego eksperymentatora.Analiza zachowania jest przeprowadzana z wykorzystaniem tych znaczników, które nie są wymagane. Po zakończeniu eksperymentu, około 24 godziny przed przeprowadzeniem testu, należy wybrać larwy w stadium L4 każdego genotypu i przenieść je na płytkę NGM z bakteriami e coli, utrzymując ją w temperaturze 20°C do następnego dnia. Eksperyment należy rozpocząć z młodymi osobnikami dorosłymi.Umieść pojedynczego nicienia z każdego szczepu wewnątrz kręgu spoczynkowego i obserwuj każde zwierzę, mierząc czas jego reakcji na barierę tikową. Aby uzyskać wiarygodny wynik, należy przeprowadzić test na 10 zwierzętach z każdego szczepu w minimum trzech powtórzeniach eksperymentalnych. Osobniki unikające czerwonego pierścienia sześć razy z rzędu są klasyfikowane jako normalne.Osobniki opuszczające pierścień w mniej niż sześciu próbach są uznawane za wykazujące defekt w kontroli wrażliwości osmotycznej; w każdym SA należy zastosować szczep kontrolny, a dwa zwierzęta służą jako kontrole pozytywne, ponieważ unikają one bariery pierścienia. Szczepy kontrolne reagują cofaniem się po napotkaniu bariery osmotycznej składającej się z 4M fruktozy. Mutanty z niedoborem neurologicznym wykazują podobne zachowanie w odniesieniu do tego typu stężenia.Jednakże mutanty z niedoborem NEUR nie były w stanie wykryć tej bariery osmotycznej. Podwójne mutanty z różnymi aktywnymi allelami neur i nout odzyskały fenotyp typu dzikiego, reagując na siłę osmotyczną. W celu uzyskania robaków z wyciszonymi genami poprzez karmienie indukujące interferencję RNA, izoluje się kolonie szczepu E. coli HD115, który został przekształcony wektorem L4440 zawierającym fragment odpowiadający genowi docelowemu. Bakterie izoluje się na płytkach LBA z antybiotykiem następnego dnia.Wybrać kolonię bakterii i zaszczepić ją w płynnej pożywce LV. Inkubować przez około siedem godzin z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C. Nanieść kroplę tej hodowli na płytkę NGM z pokryciem węglanowym i IPTG, a następnie pozostawić na noc w temperaturze pokojowej, aby umożliwić wzrost bakterii i rozpoczęcie indukcji ekspresji fragmentu genu docelowego.Konieczne jest zastosowanie kontroli pozytywnej i nie-negatywnej dla interferencji RNA. Eksperymenty z podawaniem pokarmu. Kontrola negatywna jest taka sama.Szczepy HT115 przekształcone wektorem pL4440. Kontrole pozytywne to komórki HT115 przekształcone wektorem pL4440 zawierającym sekwencję genu unc-22. Wyciszenie tego genu powoduje fenotyp drżenia, który jest łatwo rozróżnialny pod mikroskopem stereoskopowym.Pierwszy dzień. Cztery L4 stadium z NGM PLA z bakteriami są przenoszone na płytkę z bakteriami i inkubowane w 20 °C przez 12 godzin. Jest to okres głodzenia.Następnego dnia przenieś młode osobniki w fazie fast young adult na płytkę zaszczepioną bakteriami wykazującymi ekspresję specyficznego genu docelowego dla interferencji RNA. Pozostaw je na około 48 godzin w temperaturze 20 °C w celu uzyskania potomstwa F1. Następnie w ciągu kolejnych dwóch dni przenieś kilka dorosłych osobników F1 na inną płytkę zaszczepioną tymi samymi bakteriami.Wybierz i wyizoluj młode osobniki dorosłe z potomstwa F2. Ocena fenotypów szczepu dzikiego Bristol N2 karmionego bakteriami OP50. Wektor L4440 był wprowadzany wstecz w celu przebadania bariery osmotycznej.Szczep typu dzikiego Bristol i N2 karmiony bakteriami eksponującymi fragment genu nrx-1 z C. elegans nie wykazywał zdolności do wykrywania 4 M roztworów fruktozy. Jednak mutant deficientny w białku NRX-1, niezdolny do wykrywania bariery osmotycznej, odzyskał tę zdolność po podaniu bakterii eksponujących fragment genu nrx-1 z C. elegans. W tym filmie prezentujemy prostą metodę, która pozwala badać wpływ genów oddziałujących na reakcję unikania osmotycznego u C. elegans.Pierścień roztworu fruktozy z dodatkiem czerwieni Kongo jest wykorzystywany do analizy reakcji nicienia na siłę osmotyczną. Mutanty z niedoborem neureksyn wykazują zaburzenia w tej reakcji, natomiast mutanty nlg nie mają upośledzonej zdolności wykrywania stresu osmotycznego, wykazując odpowiedź podobną do szczepu typu dzikiego. Niniejszy film pokazuje, że szczepy podwójnych mutantów niosące różne allele knockout w genach nrx i nlg odzyskały fenotyp typu dzikiego, reagując na siłę osmotyczną.Obserwacje te potwierdzono za pomocą interferencji RNA z wykorzystaniem metody podawania przez pokarm. W ten sposób szczep typu dzikiego utracił zdolność rozpoznawania bariery osmotycznej po nakarmieniu bakteriami wykazującymi odpowiednią sekwencję genu ING. Z kolei mutanty z defektem neur, które nie były w stanie wykryć 4M roztworu fruktozy, odzyskały tę zdolność po nakarmieniu bakteriami wykazującymi odpowiednią sekwencję genu NNU.Wyniki przedstawione w tym eksperymencie wskazują, że nrx-1 i nlg-1 mogą być zaangażowane w połączenia synaptyczne neuronów sensorycznych nicieni, a także że oddziałują one na siebie w sposób wpływający na funkcję synaptyczną. Dziękujemy, do widzenia i powodzenia w Państwa eksperymentach.

osmotic-avoidance-caenorhabditis-elegans-synaptic-function-two-genes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Unikanie osmotyczne u Caenorhabditis elegans: Funkcja synaptyczna dwóch genów, ortologów ludzkiego NRXN1 i NLGN1, jako kandydatów do autyzmu

Niniejszy film demonstruje, w jaki sposób wykorzystać dwa stymulanty neuronalne, aldikarb i pentylenotetrazol (PTZ), w sposób komplementarny do badania funkcji synaptycznych u nicienia C. elegans. To komplementarne podejście może być również wykorzystane do wyjaśnienia ewolucyjnie konserwatywnych mechanizmów modulujących synchronizację neuronalną i ma znaczenie w badaniach nad epilepsją oraz napadami drgawkowymi.

Paradygmaty farmakologicznej charakterystyki mutantów transmisji synaptycznej u C. elegans

Przeprowadzono analizę mikromacierzy w celu określenia profili ekspresji genów u C. elegans, a w celu walidacji i kwantyfikacji danych z mikromacierzy zastosowano reakcję PCR w czasie rzeczywistym.

Wyznaczanie profili ekspresji genetycznej w C. elegans z wykorzystaniem mikromacierzy i PCR w czasie rzeczywistym

Ten film opisuje test unikania osmotycznego w celu zbadania zachowania chemounikania w modelu transgenicznego robaka. Zachowanie unikania jest testowane na płytce w obecności bariery o wysokiej zawartości osmotycznej i chemoatraktantu. Robaki z funkcjonalną utratą neuronów zostają przyciągnięte przez chemoatraktant, przekraczają barierę wysokoosmotyczną i zostają sparaliżowane w strefie pułapki z powodu roztworu znieczulającego.

Zbadaj zachowanie chemounikania u robaków transgenicznych za pomocą testu unikania osmotycznego

Podczas gdy karmienie dsRNA u C. elegans jest potężnym narzędziem do oceny funkcji genów, obecne protokoły dla dużych ekranów żywieniowych skutkują zmienną skutecznością eliminacji. Opisujemy ulepszony protokół wykonywania badań przesiewowych karmienia RNAi na dużą skalę, który skutkuje wysoce skutecznym i powtarzalnym obniżeniem ekspresji genów.

Wielkoskalowy knockdown genów u C. elegans przy użyciu bibliotek zasilających dsRNA do generowania odpornych fenotypów utraty funkcji

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia unikania osób zestresowanych. Ten paradygmat jest potężny, ale przyjazny dla użytkownika i może być wykorzystany do oceny wpływu genów i środowiska na jeden rodzaj interakcji społecznych u Drosophila melanogaster.

Prosty test do ilościowego oznaczania unikania społecznego u Drosophila melanogaster

Przedstawiamy tu specyficzny dla Caenorhabditis elegans test zaprojektowany w celu oceny zmian w zachowaniu unikania miedzi i zdolności do zlokalizowania wspólnego źródła pożywienia, w miarę jak organizm przechodzi ze stanu dobrze odżywionego do stanu głodnego.

A Caenorhabditis elegans test oparty na unikaniu miedzi w oparciu o status żywienia

Wcześniej opracowaliśmy protokoły dla Caenorhabditis elegans do tworzenia krótko- i długoterminowych wspomnień asocjacyjnych odpowiednio poprzez trening masowy i rozłożony w odstępach. Tutaj opisano szczegółowe protokoły warunkowania C. elegans poprzez parowanie 1-propanolu i kwasu solnego jako bodźców uwarunkowanych i bezwarunkowych, odpowiednio, w celu utworzenia awersyjnej pamięci asocjacyjnej.

Awersyjne uczenie się asocjacyjne i tworzenie pamięci poprzez połączenie dwóch substancji chemicznych w Caenorhabditis elegans

Zaburzenie ze spektrum autyzmu (ASD) wiąże się z zaburzeniami zachowań społecznych i komunikacyjnych oraz pojawieniem się powtarzających się zachowań. W celu zbadania wzajemnych relacji między genami ASD a deficytami behawioralnymi w modelu Drosophila, w tym artykule opisano pięć paradygmatów behawioralnych do oceny odstępów społecznych, agresji, zalotów, pielęgnacji i zachowań habituacyjnych.

Paradygmaty oceny behawioralnej w modelu zaburzenia ze spektrum autyzmu Drosophila

Modele gryzoni są cennymi narzędziami do badania podstawowych zachowań związanych z zaburzeniami ze spektrum autyzmu (ASD). W tym artykule wyjaśniamy dwa testy behawioralne do modelowania podstawowych cech ASD u myszy: samopielęgnację, który ocenia powtarzające się zachowanie, oraz trzykomorowy test interakcji społecznych, który dokumentuje upośledzenia społeczne.

Strategie oceny zachowań podobnych do autystycznych u myszy

Dynamiczna elektrofizjologia zaciskowa może ustalić związki przyczynowe między deficytami wyładowania neuronów a dysfunkcją kanału jonowego. Opisujemy metody i protokoły dynamicznego zaciskania w myszowych neuronach Purkinjego w móźku, zwracając uwagę na przydatne zasoby i kwestie techniczne. W badaniu reprezentatywnym dodaliśmy modelowaną przewodność sodu do neuronów Tsc1-/- Purkinje, aby zapobiec powtarzalnemu wyładowaniu.

Metody dynamicznego zacisku do badania upośledzonej pobudliwości neuronów związanych z autyzmem

Ten protokół ocenia aktywność synaptyczną funkcjonalną między określonymi partnerami neuronowymi in vivo w centralnym układzie nerwowym larw Drosophila melanogaster przy użyciu genetycznie zakodowanych narzędzi. Optogenetyczna stymulacja presynaptycznych cIVda neuronów sensorycznych za pomocą CsChrimson indukuje fotokonwersję zależną od wapnia CaMPARI w postsynaptycznych interneuronach Basin-4.

Charakterystyka funkcjonalna indywidualnych partnerów przed- i postsynaptycznych w Drosophila Ośrodkowym Układzie Nerwowym Larwalnym przy użyciu CaMPARI

Poznaj metodę badania unikania osmotycznego w Caenorhabditis elegans w kontekście genów kandydujących na autyzm. Technika ta pozwala analizować funkcje synaptyczne neureksyn i neuroligin.

Unikanie osmotyczne w Caenorhabditis elegans: funkcja synaptyczna dwóch genów, ortologów ludzkiego NRXN1 i NLGN1, jako kandydatów na autyzm (Wideo) | JoVE Journal

Unikanie osmotyczne u Caenorhabditis elegans: funkcja synaptyczna dwóch genów, ortologów ludzkich genów NRXN1 i NLGN1, jako kandydatów w badaniach nad autyzmem

Przeglądaj więcej filmów