Adhezja i agregacja płytek krwi pod przepływem przy użyciu mikroprzepływowych komórek przepływowych

System bio flux to zautomatyzowany instrument i urządzenie mikroprzepływowe do przeprowadzania testów żywych komórek przy kontrolowanym przepływie. System ten wykorzystuje technologię mikroprzepływową płytki studziennej do integracji urządzeń z komórkami przepływowymi w skali mikronowej ze standardowymi płytkami studziennymi SBS. BioFlex może być stosowany do prowadzenia badań adhezji i agregacji płytek krwi z dużą przepustowością i zmniejszoną objętością krwi.

Krew pełna znakowana barwnikiem fluorescencyjnym jest dodawana do studzienek, a następnie przepływa przez kanały. Pod kontrolowanym przepływem czystym generowane są dane mikroskopowe o wysokiej rozdzielczości, które określają ilościowo adhezję i agregację płytek krwi w obecności związków leków i innych zmiennych parametrów. Cześć, nazywam się Mike Schwartz i pracuję w laboratorium RD w Flexion Biosciences.

Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę wykorzystania mikroprzepływowych komórek przepływowych w testach adhezji płytek krwi. Używamy tego protokołu w naszym laboratorium do różnych testów biologii naczyniowej. Więc zacznijmy.

Wołowina, przed przeprowadzeniem eksperymentu z komórką przepływową, kanały mikroprzepływowe płytki strumienia biologicznego muszą być przygotowane z powłoką białkową o znaczeniu kolagenowym, która zostanie użyta w tym eksperymencie. Każdy z 24 eksperymentalnych kanałów płytki strumienia biologicznego łączy się ze studnią wlotową i studzienką wylotową dla tej płytki. Studzienka wlotowa to lewa studnia zasilająca kanał, a studzienka wylotowa znajduje się po prawej stronie, rozcieńczyć kolagen jeden bulion do stężenia 200 mikrogramów na mililitr.

W 0,02 molowym kwasie octowym na każdy użyty kanał potrzeba 20 mikrolitrów. Ponieważ ten eksperyment wymaga 11 kanałów, wykonaj 200 mikrolitrów powłoki kolagenowej. Jeden kanał pozostaje niepowlekany, mieszany przez delikatną iterację z końcówką mikropipety.

Dodaj 20 mikrolitrów powłoki do każdego odpowiedniego kanału za pomocą mikropipety, aby dozować płyn do wewnętrznego stempla studzienki. Karmienie interesującego kanału mikroprzepływowego, jak pokazano tutaj, za pomocą żółtego barwnika, obejmuje jeden kanał bez kolagenu jako negatywną kontrolę adhezji i agregacji płytek krwi. Po dodaniu powłoki kolagenowej do wszystkich odpowiednich kanałów, przymocuj interfejs do płytki.

Jeśli korzystasz z interfejsu bio flux 1000, możesz zacisnąć oba zatrzaski na scenie. Jeśli używasz interfejsu Bio flux 200 pierwszym palcem, dokręć cztery. A następnie, gdy wszystkie są ustawione, użyj wkrętaka dynamometrycznego, aby całkowicie dokręcić.

Sterownik momentu obrotowego kliknie, gdy osiągnie maksimum. Korzystając z trybu ręcznego w oprogramowaniu do strumienia biologicznego, zastosuj perfuzję do interesujących kanałów w odległości 2D na centymetr kwadratowy od wylotu. Cóż, użyj obiektywu o małej mocy pod mikroskopem, aby znaleźć studnię wlotową i obserwować, jak przeciwległy wewnętrzny stempel jest wypełniony cieczą.

Najpierw powinieneś zobaczyć maleńką warstwę płynu, powoli wypełniającą wewnętrzny stempel po kilku minutach, a gdy wewnętrzny stempel wlotowy zostanie napełniony, zatrzymaj obfitość na wszystkich kanałach, naciskając stop w oprogramowaniu. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez godzinę. Podczas tego okresu inkubacji można rozpocząć przygotowywanie krwi pełnej pod koniec jednogodzinnej inkubacji.

Po przygotowaniu krwi usuń granicę faz i dodaj jeden mililitr PBS oraz jony wapnia i magnezu do wylotu. Dobrze rozpocznij obfitość od wylotu dobrze w dwóch dinach na centymetr kwadratowy i kontynuuj obfitość przez 10 minut. Po 10 minutach zatrzymaj obfitość Po usunięciu interfejsu usuń nadmiar PBS zarówno ze studzienki wlotowej, jak i wylotowej.

Nigdy nie usuwaj płynu, który wypełnia wewnętrzny stempel. Aby zablokować kanały, dodaj jeden mililitr roztworu blokującego do każdego wylotu. Dobrze należy użyć perfuzji z wylotu dobrze na dwa centymetry kwadratowe i kontynuować perfuzję przez 10 minut.

Zatrzymaj obfitość po 10 minutach i usuń interfejs. Kanały są teraz gotowe i mogą być używane przez cały dzień, podczas gdy płytka jest pokrywana kolagenem. Podczas jednogodzinnej inkubacji świeża ludzka krew od osoby poszczącej powinna być przygotowana do obrazowania i spuszczenia do płytki.

Krew należy pobrać do cytrynianu sodu, antykoagulantu i zużyć w ciągu trzech godzin od pobrania. Najpierw dodaj do krwi czteromilimolowy zapas wapnia M w DMSO w rozcieńczeniu od 1 do 1000 objętości na objętość. Aby uzyskać cztery mikromolowe wapń, należy go zmieszać przez delikatną inwersję.

Następnie dozuj jeden mililitr krwi oznaczonej wapniem do dziesięciu mikroprobówek o jednym punkcie i pięciu mililitrach. Dodać GP dwa B trzy przeciwciała inhibitora a do każdej probówki w żądanym rozcieńczeniu. Należy pamiętać o uwzględnieniu kontroli ujemnej bez przeciwciał i niepowiązanej kontroli dodatniej przeciwciał zmieszanej przez delikatną inwersję.

Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, mieszając przez delikatną inwersję co 10 minut przed przeprowadzeniem eksperymentu z komórką przepływową. W module kontroli strumienia biologicznego dla kolagenu należy skonfigurować automatyczny protokół. Jeden. Ustal protokół, aby krew była pobierana na głębokości dziesięciu dziewięciu centymetrów kwadratowych przez 10 minut od ujścia.

Otóż za pomocą stacji roboczej BioFlex 1000 należy ustawić parametry akwizycji danych, które obejmują pożądaną akwizycję pozycji stopnia w długości fali fitz i ustawieniu poklatkowym. Typowy plan pozyskiwania obrazów dla tego protokołu obejmowałby jedno pole widzenia na kanał, które miałoby być rejestrowane przy użyciu obiektywu 10x co 30 sekund przez łączny czas trwania 10 minut. Możliwe są również dodatkowe pola widoku i alternatywne ustawienia TimeLapse.

Po ustawieniu automatycznego protokołu i parametrów akwizycji danych wróć do płytki BioFlex i usuń płyn po obu stronach kanału, z wyjątkiem wewnętrznych stempli. Dbając o to, aby pracować szybko, umieść 500 mikrolitrów krwi każdego stanu w studzienkach wyjściowych każdego kanału. Należy pamiętać, że studzienki wyjściowe są używane do dostarczania krwi, ponieważ jest to najkrótsza droga do strefy widzenia i zapewni bardziej natychmiastową reakcję krwi na powłokę kolagenową.

Ponadto umieść krew kontrolną bez przeciwciał w kanale, który jest pokryty kolagenem i takim, który jest po prostu zablokowany. Umieść płytkę na mikroskopie stacji roboczej BioFlex 1000 i clamp na interfejsie. Wykonaj kalibrację listy etapów, lokalizując pierwszy punkt kalibracji, który jest zdefiniowany jako początek.

Następnie zlokalizuj i zaznacz drugi punkt kalibracji. Zastosuj tę kalibrację do odpowiedniej listy etapów. Dzięki temu wszystkie miejsca podglądu na płycie można znaleźć automatycznie.

Przenieś stolik do jednego z kanałów zawierających zestaw krwi, aby dopasować parametry przechwytywania obrazu, takie jak czas ekspozycji i wzmocnienie w oprogramowaniu montażowym BioFlex. Uruchom odpowiedni przepływ pracy, klikając żądany przycisk. Spowoduje to jednoczesne uruchomienie protokołu przepływu i akwizycji obrazu.

Po zakończeniu eksperymentu należy wyjąć płytkę ze stacji roboczej BIOFLU 1000 i zutylizować ją zgodnie z wytycznymi instytucji. Za pomocą pokrytych kolagenem kanałów mikroprzepływowych systemu bio flux. Agresywne tworzenie się skrzepliny obserwuje się z czasem w przypadku nieleczonej próbki krwi kontrolnej.

W przeciwieństwie do tego, w przypadku kanału niepowlekanego nie obserwuje się tworzenia się skrzepliny. W jednym z niedawno przeprowadzonych eksperymentów średnia wielkość agregatów w warunkach kontrolnych wynosiła 2000 mikrometrów kwadratowych. GP dwa, B, trzy A jest silnym mediatorem interakcji płytek krwi i stabilizacji agregacji, gdy jest aktywowany przez adhezję do kolagenu, jak pokazano tutaj, po inkubacji z przeciwciałem anty GB dwa B trzy a przez jedną godzinę przed samą ekspozycją, obserwuje się zmniejszenie wielkości skrzeplin, a także zmniejszenie częstości tworzenia się skrzepliny.

Odpowiedź zależną od dawki można zwykle zaobserwować przy dziesięciu dziewięciu centymetrach kwadratowych, a wartość IC 50 dla tego konkretnego inhibitora wynosiła 17 nanomolowych. Maksymalne zahamowanie dla tego dawcy w porównaniu z grupą kontrolną bez przeciwciał wynosiło 11% przy 10 centymetrach kwadratowych. Dostępna jest również 48-dołkowa płyta o wysokim ścinaniu do przeprowadzania eksperymentów z krwią pełną do 200 D na centymetr kwadratowy lub 5 000 sekund odwrotnych.

Właśnie pokazaliśmy, jak używać kanałów przepływu mikroprzepływowego do przeprowadzania fizjologicznie istotnych eksperymentów biologii naczyniowej. Stosując ten protokół, należy pamiętać o rozcieńczeniu kolagenu w odpowiednim buforze. Aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza, należy zawsze stosować prawidłową technikę pipetowania i przestrzegać przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego obowiązujących w laboratorium.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.