Name: Adhezja i agregacja płytek krwi pod przepływem przy użyciu mikroprzepływowych komórek przepływowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-27T07:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj mikroprzepływową metodę badania adhezji i agregacji płytek krwi w warunkach fizjologicznego ścinania przy użyciu systemu BioFlux. Technika ta umożliwia wysokoprzepustową analizę z minimalnym zużyciem krwi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Część 1: Przygotowanie kanałów mikroprzepływowych płytki BioFlux.
<ol>
<li>Przed rozpoczęciem eksperymentu w komorze przepływowej należy przygotować kanały mikroprzepływowe poprzez pokrycie ich odpowiednim białkiem. W tym przypadku zostanie użyty kolagen I. Każdy kanał posiada otwór wlotowy i wylotowy. W przypadku tej płytki otwór wlotowy znajduje się po lewej stronie i zasila kanał, a otwór wylotowy znajduje się po prawej stronie.</li>
<li>Rozcieńczyć roztwór kolagenu I (stężenie zapasu 5mg/ml) do stężenia 200μg/ml w 0,02M kwasie octowym. Na każdy używany kanał będzie potrzebne 20μl. Wymieszać poprzez delikatne pipetowanie końcówką mikropipety.</li>
<li>Dodać 20 μl roztworu pokrywającego do każdego z kanałów przeznaczonych do użycia. Należy nanieść ciecz do wewnętrznego otworu (inner punch) otworu wlotowego zasilającego wybrany kanał mikroprzepływowy za pomocą mikropipety. Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza; nie należy wypychać powietrza z pipety. Jeden kanał należy pozostawić bez kolagenu jako kontrolę bez kolagenu (kontrola negatywna dla adhezji i agregacji).</li>
<li>Przymocować interfejs do płytki, najpierw dokręcając ręcznie 4 śruby, a następnie, gdy wszystkie będą ustawione, użyć klucza dynamometrycznego do pełnego dokręcenia. Klucz dynamometryczny kliknie po osiągnięciu maksymalnej siły dokręcenia.</li>
<li>Korzystając z trybu ręcznego w oprogramowaniu BioFlux, zastosować perfuzję w wybranych kanałach z wartością 2dyn/cm2 — z otworu wylotowego. Należy wówczas obserwować, aż przeciwległy wewnętrzny otwór zostanie wypełniony cieczą. Zajmie to kilka minut. Można to obserwować za pomocą mikroskopu z obiektywem o niskiej mocy (4X), lokalizując otwór wlotowy, lub trzymając płytkę i zaglądając do otworów wlotowych od dołu. Powinna pojawić się mała kropla cieczy, która powoli wypełnia wewnętrzny otwór. Gdy wewnętrzny otwór wlotowy zostanie wypełniony, należy natychmiast zatrzymać perfuzję, klikając stop w oprogramowaniu.</li>
<li>Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.</li>
<li>Zdjąć interfejs i dodać 1 ml PBS (z dodatkiem Ca2+/Mg2+) do otworu wylotowego. Rozpocząć perfuzję z otworu wylotowego z wartością 2dyn/cm2. Kontynuować perfuzję przez 10 minut. Zatrzymać perfuzję i zdjąć interfejs.</li>
<li>Usunąć nadmiar PBS z otworów wlotowych i wylotowych – nigdy nie usuwać cieczy wypełniającej wewnętrzne otwory. Zablokować kanały, używając roztworu blokującego (0,5% v/v BSA w PBS (z dodatkiem Ca2+/Mg2+)). Dodać 1 ml roztworu blokującego do każdego używanego otworu wylotowego i przeprowadzić perfuzję z otworu wylotowego z wartością 2dyn/cm2. Kontynuować perfuzję przez 10 minut. Zatrzymać perfuzję i zdjąć interfejs. Kanały przygotowane do tego etapu mogą być wykorzystywane przez cały dzień.</li>
<li>Przed dodaniem krwi usunąć ciecz po obu stronach kanału, z wyjątkiem obszaru wewnętrznych otworów.</li>
</ol>
 Część 2. Przygotowanie krwi z użyciem przeciwciała hamującego GPIIb/IIIa.
<ol>
<li>Podczas inkubacji kolagenu w kanałach należy przygotować krew pełną. Podczas pracy z ludzką krwią należy przestrzegać przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego obowiązujących w danej instytucji.</li>
<li>Świeża ludzka krew (pobrana od osoby na czczo) z antykoagulantem cytrynianem sodu powinna zostać wykorzystana w ciągu 3 godzin od pobrania.</li>
<li>Przygotować krew, dodając 4μM kalceiny AM. Przygotować roztwór zapasowy kalceiny AM o stężeniu 4mM w DMSO i dodać do krwi w rozcieńczeniu 1/1000 v/v. Wymieszać przez delikatne odwracanie probówek.</li>
<li>Rozdzielić 1 ml krwi znakowanej kalceiną AM do 10 mikroprobówek o pojemności 1,5mL. Do każdej z nich dodać przeciwciało inhibitorowe GPIIb/IIIa w żądanym rozcieńczeniu (masa cząsteczkowa IgG wynosi ~150kDa). Przykład serii rozcieńczeń obejmuje zakres od 1200nM do 9nM, w tym kontrolę bez przeciwciał oraz kontrolę z niepowiązanym przeciwciałem. Doskonałą kontrolą pozytywną dla inhibicji byłby ReoPro (abciximab, Eli Lilly) w stężeniu 20ug/ml. Wymieszać przez delikatne odwracanie probówek.</li>
<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Wymieszać przez delikatne odwracanie probówek co 10 minut.</li>
</ol>
 Część 3: Przeprowadzanie eksperymentu w komorze przepływowej na stacji roboczej BF1000.
<ol>
<li>W pierwszej kolejności należy skonfigurować zautomatyzowany protokół w module sterującym BioFlux. Dla kolagenu I należy ustawić protokół na 10dyn/cm2 przez 10 minut z otworu wylotowego. Na tym etapie należy również ustawić parametry akwizycji danych za pomocą stacji roboczej BF1000, w tym pozycje kanałów, rejestrację w długości fali FITC oraz informacje o odstępach czasowych (time-lapse). Zaleca się rejestrację 3 pól widzenia przy użyciu obiektywu 10x na kanał co 30 sekund przez łącznie 10 minut.</li>
<li>Szybko należy wprowadzić 500ul przygotowanej krwi dla każdego wariantu do oddzielnych, przygotowanych kanałów. Krew kontrolną bez przeciwciał należy umieścić w kanale powleczonym kolagenem oraz w kanale jedynie zablokowanym.</li>
<li>Należy nałożyć interfejs na płytkę.</li>
<li>Płytkę należy umieścić w mikroskopie stacji roboczej BF1000. Następnie należy zamocować interfejs.</li>
<li>Należy przeprowadzić regulację obciążenia płytki. Następnie należy przesunąć stoлик do jednego z otworów zawierających krew. Należy ustawić parametry rejestracji obrazu FITC (czas ekspozycji, wzmocnienie itp.).</li>
<li>W oprogramowaniu BioFlux montage należy uruchomić akwizycję, aby jednocześnie rozpocząć przepływ i rejestrację danych.</li>
<li>Należy wyjąć płytkę ze stacji roboczej BF1000 i zutylizować ją zgodnie z wytycznymi instytucji.</li>
</ol>
Część 4: Reprezentatywne wyniki.
W niniejszym materiale przedstawiono protokół adhezji i agregacji płytek krwi w kanałach mikrofluidycznych. Protokół obejmował również traktowanie inhibitorem agregacji płytek krwi, przeciwciałem anty-GPIIb/IIIa. Stosując kanały mikrofluidyczne systemu BioFlux powlekane kolagenem, należy spodziewać się agresywnego tworzenia zakrzepów w czasie w przypadku nieleczonej kontrolnej próbki krwi oraz braku tworzenia zakrzepów w kanale niepowlekanym. W jednym z niedawno przeprowadzonych eksperymentów średnia wielkość agregatów w warunkach kontrolnych wynosiła 2000μm2. Rysunek 1. <img src="/files/ftp_upload/1644/1644fig1.jpg" alt="Równowaga statyczna; obrazowanie termiczne; analiza rozkładu ciepła; schemat; badanie materiałów." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1">
Aktywowany kompleks GPIIb/IIIa jest silnym mediatorem oddziaływań między płytkami krwi oraz stabilizacji agregacji1. Adhezja do kolagenu aktywuje kompleks GPIIb/IIIa, wywołując tę odpowiedź 2. Po inkubacji z przeciwciałem anty-GPIIb/IIIa przez 1 godzinę przed narażeniem na siły ścinające, należy spodziewać się obserwacji zmniejszenia rozmiaru skrzepów, jak również spadku częstotliwości ich powstawania. Odpowiedź zależna od dawki jest zazwyczaj obserwowana przy 10dyn/cm2. Rysunek 2. <img src="/files/ftp_upload/1644/1644fig2.jpg" alt="Krzywa dawka-odpowiedź; wartość EC50, skala logarytmiczna, procent hamowania, wykres analizy naukowej." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> Wartość IC50 dla tego konkretnego inhibitora wyniosła 17nM przy 10 dyn/cm2. Maksymalne hamowanie (dla tego dawcy) w porównaniu do kontroli bez przeciwciał wyniosło 11% przy 10 dyn/cm2.
Chociaż przedstawione tutaj metody zastosowano z użyciem konkretnego białka macierzy zewnątrzkomórkowej i konkretnego inhibitora agregacji płytek krwi, protokół ten można rozszerzyć na inne powłoki, inne typy komórek oraz inne inhibitory w testach adhezji komórkowej. Kluczowymi czynnikami warunkującymi sukces takich doświadczeń są: unikanie pęcherzyków powietrza w kanałach mikroprzepływowych, prawidłowe rozcieńczanie wszystkich odczynników w odpowiednich rozpuszczalnikach oraz zapewnienie właściwych warunków inkubacji dla wszystkich odczynników.

<ol><li>Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+complexity+of+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The growing complexity of platelet aggregation.</a> Blood. 109, 5087-5095 (2007).</li>
<li>Nakamura, T., Kambayashi, J., Okuma, M., Tandon, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+GP+IIb-IIIa+complex+induced+by+platelet+adhesion+to+collagen+is+mediated+by+both+alpha2beta1+integrin+and+GP%5BTitle%5D)+AND+%22VI.+J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of the GP IIb-IIIa complex induced by platelet adhesion to collagen is mediated by both alpha2beta1 integrin and GP.</a> VI. J Biol Chem. 274, 11897-11903 (1999).</li>
</ol>

Współautorzy są pracownikami firmy Fluxion Biosciences.

Choć zaprezentowane tutaj metody wykorzystywały konkretne białko macierzy zewnątrzkomórkowej oraz specyficzny inhibitor agregacji płytek krwi, protokół ten można rozszerzyć na inne powłoki, inne typy komórek oraz inne inhibitory w testach adhezji komórkowej. Kluczowymi czynnikami warunkującymi sukces takich eksperymentów są: unikanie pęcherzyków powietrza w kanałach mikroprzepływowych, prawidłowe rozcieńczenie wszystkich odczynników w odpowiednich rozpuszczalnikach oraz zapewnienie właściwych warunków inkubacji dla wszystkich reagentów.

<table><tbody><tr><td>kolagen I, wołowy</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>A1064401</td><td>można stosować inne źródła kolagenu I</td></tr><tr><td>PBS z dodatkiem Ca/Mg</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>14040-117</td><td></td></tr><tr><td>Seryjowa albumina wołowa (BSA)</td><td>Odczynnik</td><td>EMD Millipore</td><td>EM-2930 Bottom of Form</td><td>Z VWR</td></tr><tr><td>kalceina AM</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>C1430</td><td>Można również stosować kalceinę AM z BD</td></tr><tr><td>System BioFlux 1000</td><td>Odczynnik</td><td>Fluxion Biosciences</td><td>Kontakt z firmą</td><td></td></tr><tr><td>Płytka BioFlux</td><td>Odczynnik</td><td>Fluxion Biosciences</td><td>900013</td><td></td></tr><tr><td>anty-GPIIb/IIIa</td><td>Odczynnik</td><td>Abcam</td><td>ab33407</td><td>alternatywny numer to ab15021</td></tr><tr><td>ReoPro</td><td>Odczynnik</td><td>Eli Lilly</td><td></td><td>wyłącznie na receptę</td></tr></tbody></table>

adhezja i agregacja płytek krwi w warunkach przepływu z wykorzystaniem mikrofluidycznych komór przepływowych

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Agregacja płytek krwi zachodzi w odpowiedzi na uszkodzenie naczyniowe, w którym odsłonięta zostaje macierz zewnątrzkomórkowa znajdująca się pod śródbłonkiem. Kaskada adhezji płytek zachodzi w obecności przepływu ścinającego, który jest czynnikiem nieuwzględnianym w konwencjonalnych (statycznych) testach na płytkach wielodołkowych. Niniejszy artykuł opisuje test agregacji płytek krwi z wykorzystaniem mikrofluidycznego formatu płytki wielodołkowej w celu emulacji fizjologicznych warunków przepływu ścinającego. Białka zewnątrzkomórkowe, kolagen I lub czynnik von Willebranda, są osadzane w kanale mikrofluidycznym przy użyciu aktywnej perfuzji z pompą pneumatyczną. Następnie białka macierzy są płukane buforem i blokowane, aby przygotować kanał mikrofluidyczny do interakcji z płytkami krwi. Krew pełna oznakowana barwnikiem fluorescencyjnym jest perfundowana przez kanał z różnymi prędkościami przepływu w celu wywołania aktywacji i agregacji płytek. Przed eksperymentem w komorze przepływowej można dodać inhibitory agregacji płytek krwi w celu uzyskania danych dotyczących dawki i odpowiedzi IC50.

Kaskada adhezji płytek krwi zachodzi w warunkach przepływu ścinającego, co jest czynnikiem pomijanym w konwencjonalnych (statycznych) testach na płytkach wielodołkowych. Niniejszy artykuł opisuje test agregacji płytek krwi wykorzystujący mikrofluidyczny format płytki wielodołkowej w celu emulacji fizjologicznych warunków przepływu ścinającego.

Adhezja i agregacja płytek krwi w warunkach przepływu z wykorzystaniem mikrofluidycznych komór przepływowych

Agregacja płytek krwi zachodzi w odpowiedzi na uszkodzenie naczyń krwionośnych, w wyniku którego dochodzi do odsłonięcia macierzy zewnątrzkomórkowej znajdującej się pod śródbłonkiem. Adhezja płytek...

System Bio Flux to zautomatyzowany instrument i urządzenie mikroprzepływowe służące do przeprowadzania analiz żywych komórek w kontrolowanym przepływie ścinającym. System ten wykorzystuje technologię mikroprzepływową w płytkach wielodołkowych do integracji komór przepływowych w skali mikronowej ze standardowymi płytkami SBS. BioFlex może być wykorzystywany do przeprowadzania wysokoprzepustowych badań adhezji i agregacji płytek krwi przy użyciu zredukowanych objętości krwi.Całokrwistą oznakowaną barwnikiem fluorescencyjnym dodaje się do dołków, a następnie przepuszcza przez kanały. W warunkach kontrolowanego przepływu ścinającego uzyskuje się dane z mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, które pozwalają ilościowo określić adhezję i agregację płytek krwi w obecności związków lekowych oraz innych zmiennych parametrów. Cześć, jestem Mike Schwartz z laboratorium R&D w Flexion Biosciences.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wykorzystania mikrofluidycznych komór przepływowych w testach adhezji płytek krwi. Protokół ten stosujemy w naszym laboratorium w różnorodnych badaniach z zakresu biologii naczyniowej. Zapraszamy do rozpoczęcia.Przed rozpoczęciem eksperymentu w komorze przepływowej, kanały mikroprzepływowe płytki BioFlux muszą zostać przygotowane poprzez nałożenie odpowiedniej powłoki białkowej; w tym doświadczeniu zostanie wykorzystany kolagen typu I. Każdy z 24 kanałów eksperymentalnych płytki BioFlux łączy otwór wlotowy z otworem wylotowym. Otwór wlotowy znajduje się po lewej stronie i zasila kanał, natomiast otwór wylotowy znajduje się po prawej stronie. Należy rozcieńczyć roztwór zapasowy kolagenu typu I do stężenia 200 µg/mL.W przypadku 0,02 molarnego kwasu octowego na każdy użyty kanał wymagane będzie 20 µL. Ponieważ ten eksperyment wymaga 11 kanałów, należy przygotować 200 µL powłoki kolagenowej. Jeden kanał pozostaje niepowlekany, a mieszanie odbywa się poprzez delikatne iterowanie końcówką mikro pipety.Za pomocą mikropipety nanieś 20 µL powłoki do każdego z odpowiednich kanałów, dozując ciecz do wewnętrznej części otworu studzienki. Napełniając interesujący nas kanał mikrofluidyczny, tak jak pokazano tutaj za pomocą żółtego barwnika, uwzględnij jeden kanał bez kolagenu jako kontrolę negatywną dla adhezji i agregacji płytek krwi. Po naniesieniu powłoki kolagenowej do wszystkich odpowiednich kanałów, przymocuj interfejs do płytki.Jeśli używasz interfejsu BioFlux 1000, można zaciągnąć oba zatrzaski na stole. W przypadku korzystania z interfejsu BioFlux 200, najpierw dokręć palcem cztery śruby. Gdy wszystkie będą ustawione, użyj klucza dynamometrycznego, aby dokręcić je całkowicie.Klucz dynamometryczny kliknie po osiągnięciu wartości maksymalnej. Korzystając z trybu ręcznego w oprogramowaniu bio flux, zastosuj perfuzję w wybranych kanałach z przepływem 2D na centymetr kwadratowy z wylotu. Użyj obiektywu o niskiej powiększeniu w mikroskopie, aby zlokalizować otwór wlotowy i zaobserwować napełnianie cieczą przeciwległego otworu wewnętrznego.Najpierw powinna pojawić się mała ilość cieczy, która po kilku minutach powoli wypełni wewnętrzny otwór; gdy wewnętrzny otwór wlotowy zostanie wypełniony, należy zatrzymać perfuzję we wszystkich kanałach, klikając przycisk stop w oprogramowaniu. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. W czasie tej inkubacji można rozpocząć przygotowywanie krwi pełnej, aby było ono gotowe po zakończeniu godzinnej inkubacji.Po przygotowaniu krwi należy usunąć interfejs i dodać jeden mililitr PBS z dodatkiem jonów wapnia i magnezu do otworu wylotowego. Rozpocząć perfuzję z otworu wylotowego z prędkością 2 dyn/cm² i kontynuować perfuzję przez 10 minut. Po 10 minutach zatrzymać perfuzję. Po usunięciu interfejsu należy usunąć nadmiar PBS z obu otworów: wlotowego i wylotowego.Nigdy nie usuwaj cieczy wypełniającej wewnętrzny wybijak. Aby zablokować kanały, dodaj jeden mililitr roztworu blokującego do każdego otworu wylotowego. Studzienka wykorzystywana do perfuzji z otworu wylotowego powinna pracować z przepływem 2 dyn/cm²; perfuzję należy kontynuować przez 10 minut.Zatrzymaj perfuzję po 10 minutach i usuń interfejs. Kanały są teraz gotowe i mogą być wykorzystywane w ciągu dnia, podczas gdy płytka jest powlekana kolagenem. W trakcie jednej godziny inkubacji należy przygotować do obrazowania i wprowadzenia do płytki świeżą krew ludzką pobraną od osoby na czczo.Krew należy pobrać do cytrynianu sodu jako przeciwkrzepliwego i wykorzystać w ciągu trzech godzin od momentu pobrania. Najpierw do krwi należy dodać roztwór zapasowy calcium M o stężeniu 4 mM w DMSO w rozcieńczeniu 1:1000 objętościowo. Aby uzyskać stężenie 4 µM calcium am, próbkę miesza się poprzez delikatne odwracanie.Następnie odmierzyć 1 mL krwi znakowanej wapniem do dziesięciu probówek mikrocentryfużowych o pojemności 1,5 mL. Do każdej probówki dodać przeciwciało inhibitorowe GP2B3 w odpowiednim rozcieńczeniu. Należy pamiętać o uwzględnieniu ujemnej kontroli bez przeciwciał oraz dodatniej kontroli z niepowiązanym przeciwciałem, mieszając zawartość poprzez delikatne odwracanie probówek.Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, delikatnie odwracając je co 10 minut przed rozpoczęciem eksperymentu w komorze przepływowej. W module sterującym bio flux należy skonfigurować zautomatyzowany protokół dla kolagenu. One. Skonfigurować protokół, aby przepływ krwi wynosił dziesięć dziewięć centymetrów kwadratowych przez 10 minut z odpływu.Należy skonfigurować parametry akwizycji danych stacji roboczej BioFlex 1000, które obejmują pożądane pozycje stolika, akwizycję w określonej długości fali oraz ustawienia time-lapse. Typowy plan akwizycji obrazów dla tego protokołu obejmowałby jedno pole widzenia na kanał, rejestrowane przy użyciu obiektywu 10x co 30 sekund przez całkowity czas 10 minut. Możliwe jest również wybranie dodatkowych pól widzenia oraz alternatywnych ustawień TimeLapse.Po ustawieniu zautomatyzowanego protokołu i parametrów akwizycji danych, należy powrócić do płytki BioFlex i usunąć ciecz z obu stron kanału, z wyjątkiem wewnętrznych otworów (punches). Pracując szybko, należy nalać 500 µL krwi dla każdego wariantu do otworów wylotowych każdego kanału. Należy zauważyć, że otwory wylotowe są wykorzystywane do dostarczania krwi, ponieważ stanowią one najkrótszą drogę do strefy obserwacyjnej, co zapewni szybszą reakcję krwi na powłokę kolagenową.Dodatkowo, wprowadź krew kontrolną bez przeciwciał do kanału pokrytego kolagenem oraz do kanału jedynie zablokowanego. Umieść płytkę w mikroskopie stacji roboczej BioFlex 1000 i zamocuj ją w interfejsie. Przeprowadź kalibrację listy pozycji stolika, lokalizując pierwszy punkt kalibracyjny, który definiuje punkt początkowy.Następnie zlokalizuj i zaznacz drugi punkt kalibracyjny. Zastosuj tę kalibrację do odpowiedniej listy pozycji (stage list). Zapewnia to automatyczne odnajdywanie wszystkich miejsc obserwacji na płytce.Przesuń stolik do jednego z kanałów zawierających krew, ustaw parametry akwizycji obrazu, takie jak czas ekspozycji i wzmocnienie, w oprogramowaniu BioFlex montage. Uruchom odpowiedni proces roboczy, klikając wybrany przycisk. Spowoduje to jednoczesne rozpoczęcie protokołu przepływu i akwizycji obrazów.Po zakończeniu eksperymentu należy wyjąć płytkę ze stacji roboczej BIOFLU 1000 i zutylizować ją zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Wykorzystano mikroprzepływowe kanały powlekane kolagenem systemu bio flux. W nieleczonej kontrolnej próbce krwi w czasie obserwuje się gwałtowne tworzenie zakrzepów.W przeciwieństwie do tego, w kanale niepowlekanym nie obserwuje się tworzenia skrzepów. W jednym z niedawno przeprowadzonych eksperymentów średnia wielkość agregatów w warunkach kontrolnych wynosiła 2000 µm². GP IIb/IIIa jest silnym mediatorem interakcji płytek krwi i stabilizacji agregacji podczas aktywacji poprzez przyleganie do kolagenu; jak pokazano tutaj, po inkubacji z przeciwciałem anty-GP IIb/IIIa przez jedną godzinę przed poddaniem działaniu sił ścinania, obserwuje się zmniejszenie wielkości skrzepów oraz zmniejszenie częstotliwości ich tworzenia.Zależna od dawki odpowiedź może być zazwyczaj zaobserwowana przy 10 dyn cm⁻² i wartość IC₅₀ dla tego konkretnego inhibitora wyniosła 17 nM. Maksymalne hamowanie dla tego donora w porównaniu z kontrolą bez przeciwciał wyniosło 11% przy 10 dyn cm⁻². Do przeprowadzania eksperymentów z pełną krwią przy wysokim ścinaniu do 200 dyn cm⁻² lub 5000 s⁻¹ dostępna jest również płytka 48-dołkowa.Właśnie zaprezentowaliśmy sposób wykorzystania mikroprzepływowych kanałów przepływowych do przeprowadzania istotnych fizjologicznie eksperymentów z zakresu biologii naczyniowej. Podczas realizacji tego protokołu ważne jest, aby pamiętać o rozcieńczeniu kolagenu w odpowiednim buforze. Zawsze stosuj prawidłową technikę pipetowania, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza, i zawsze przestrzegaj przepisów bezpieczeństwa biologicznego obowiązujących w Twoim laboratorium.To już wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.

platelet-adhesion-aggregation-under-flow-using-microfluidic-flow

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Adhezja i agregacja płytek krwi w warunkach przepływu z wykorzystaniem mikrofluidycznych komórek przepływowych

Opisujemy metodę poddawania przylegających komórek naprężeniom ścinającym w przepływie laminarnym w sterylnym obwodzie przepływu ciągłego. Poprzez przezroczystą komorę można badać adhezję i morfologię komórek, a z obwodu można pobierać próbki do analizy metabolitów oraz zbierać komórki po ekspozycji na siły ścinające do dalszych eksperymentów lub hodowli.

Komora przepływowa z równoległymi płytkami i obwód przepływu ciągłego do oceny komórek progenitorowych śródbłonka pod wpływem naprężenia ścinającego w przepływie laminarnym

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Ten film demonstruje test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować interakcję leukocytów i partnerów komórkowych, takich jak komórki śródbłonka. Metoda ta zapewnia dynamiczny wgląd w adhezję, martwość i transmigrację leukocytów po perfuzji przez nienaruszoną i zlewającą się warstwę komórek naczyniowych.

Test oparty na przepływie laminarnym do badania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka

Komory przepływowe używane w eksperymentach adhezyjnych zazwyczaj składają się z liniowych ścieżek przepływu i wymagają wielu eksperymentów przy różnych prędkościach przepływu, aby wygenerować mapę adhezji ścinania.  SynVivo-SMN umożliwia generowanie mapy przyczepności przy ścinaniu przy użyciu pojedynczego eksperymentu z wykorzystaniem objętości mikrolitrów, co skutkuje znaczną oszczędnością czasu i materiałów eksploatacyjnych.

Generowanie mapy przyczepności przy ścinaniu przy użyciu syntetycznych sieci mikronaczyniowych SynVivo

Opisano metodę ilościowego oznaczania adhezji neutrofili. Ta metoda tworzy dynamiczne środowisko przepływu podobne do tego, które występuje w naczyniu krwionośnym. Pozwala to na badanie adhezji neutrofili do oczyszczonych cząsteczek adhezyjnych (ligand) lub substratu komórek śródbłonka (HUVEC) w kontekście podobnym do środowiska in vivo z czystym stresem.

Test adhezji w komorze przepływu ludzkich neutrofili

Transfuzja płytek krwi i hemostaza były modelowane za pomocą komór do rekonstytucji krwi i przepływu mikroprzepływowego w celu zbadania funkcji płytek krwi bankujących. Dane wskazują na wpływ zmian spichrzających płytki krwi na hemostazę in vitro.

Mikroprzepływowe komory przepływowe wykorzystujące rozpuszczoną krew do modelowania hemostazy i transfuzji płytek krwi in vitro

Ten artykuł opisuje eksperymentalny model hemostazy, który jednocześnie mierzy funkcję płytek krwi i krzepnięcie. Fluorescencja płytek krwi i fibryny jest mierzona w czasie rzeczywistym i określa się szybkość adhezji płytek krwi, szybkość krzepnięcia i początek krzepnięcia. Model służy do określania właściwości prokoagulantów płytek krwi pod wpływem przepływu w koncentratach do transfuzji.

Model mikroprzepływowej komory przepływowej do transfuzji płytek krwi i hemostazy mierzy odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny w czasie rzeczywistym

Ta praca opisuje metodę opartą na mikroskopii fluorescencyjnej do badania adhezji, rozprzestrzeniania się i wydzielania płytek krwi pod przepływem. Ta wszechstronna platforma umożliwia badanie funkcji płytek krwi w badaniach mechanistycznych nad zakrzepicą i hemostazą.

Obrazowanie żywych komórek degranulacji i wydzielania płytek krwi pod wpływem przepływu

Leukocyty chętnie oddziałują z komórkami naczyniowymi i płytkami krwi po uszkodzeniu ściany naczynia lub podczas stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy prosty test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw interakcji między leukocytami a ich partnerami komórkowymi.

Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi

Szczegółowy protokół obrazowania pojedynczych migrujących płytek krwi za pomocą funkcjonalizowanych RGD uwięzi awidyna-biotyna o regulowanej gęstości jest dostarczony, ujawniając, że płytki krwi generują wystarczającą siłę, aby zerwać wiązanie awidyna-biotyna.

Test in vitro do badania migracji płytek krwi przy użyciu funkcjonalizowanych RGD tetherów awidyna-biotyna

Funkcja płytek krwi pod przepływem może być oceniona, a symulowana resuscytacja hemostatyczna może być modelowana za pomocą urządzenia mikroprzepływowego, które ma zastosowanie w medycynie urazowej i transfuzjologicznej.

Mikrofluidyka w ocenie funkcji płytek krwi

Poznaj mikroprzepływową metodę badania adhezji i agregacji płytek krwi w warunkach fizjologicznego ścinania przy użyciu systemu BioFlux. Technika ta umożliwia wysokoprzepustową analizę z minimalnym zużyciem krwi.

Adhezja i agregacja płytek krwi w warunkach przepływu z wykorzystaniem mikrofluidycznych komór przepływowych

Przeglądaj więcej filmów