Adhezja i agregacja płytek krwi w warunkach przepływu z wykorzystaniem mikrofluidycznych komór przepływowych

System Bio Flux to zautomatyzowany instrument i urządzenie mikroprzepływowe służące do przeprowadzania analiz żywych komórek w kontrolowanym przepływie ścinającym. System ten wykorzystuje technologię mikroprzepływową w płytkach wielodołkowych do integracji komór przepływowych w skali mikronowej ze standardowymi płytkami SBS. BioFlex może być wykorzystywany do przeprowadzania wysokoprzepustowych badań adhezji i agregacji płytek krwi przy użyciu zredukowanych objętości krwi.

Całokrwistą oznakowaną barwnikiem fluorescencyjnym dodaje się do dołków, a następnie przepuszcza przez kanały. W warunkach kontrolowanego przepływu ścinającego uzyskuje się dane z mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, które pozwalają ilościowo określić adhezję i agregację płytek krwi w obecności związków lekowych oraz innych zmiennych parametrów. Cześć, jestem Mike Schwartz z laboratorium R&D w Flexion Biosciences.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wykorzystania mikrofluidycznych komór przepływowych w testach adhezji płytek krwi. Protokół ten stosujemy w naszym laboratorium w różnorodnych badaniach z zakresu biologii naczyniowej. Zapraszamy do rozpoczęcia.

Przed rozpoczęciem eksperymentu w komorze przepływowej, kanały mikroprzepływowe płytki BioFlux muszą zostać przygotowane poprzez nałożenie odpowiedniej powłoki białkowej; w tym doświadczeniu zostanie wykorzystany kolagen typu I. Każdy z 24 kanałów eksperymentalnych płytki BioFlux łączy otwór wlotowy z otworem wylotowym. Otwór wlotowy znajduje się po lewej stronie i zasila kanał, natomiast otwór wylotowy znajduje się po prawej stronie. Należy rozcieńczyć roztwór zapasowy kolagenu typu I do stężenia 200 µg/mL.

W przypadku 0,02 molarnego kwasu octowego na każdy użyty kanał wymagane będzie 20 µL. Ponieważ ten eksperyment wymaga 11 kanałów, należy przygotować 200 µL powłoki kolagenowej. Jeden kanał pozostaje niepowlekany, a mieszanie odbywa się poprzez delikatne iterowanie końcówką mikro pipety.

Za pomocą mikropipety nanieś 20 µL powłoki do każdego z odpowiednich kanałów, dozując ciecz do wewnętrznej części otworu studzienki. Napełniając interesujący nas kanał mikrofluidyczny, tak jak pokazano tutaj za pomocą żółtego barwnika, uwzględnij jeden kanał bez kolagenu jako kontrolę negatywną dla adhezji i agregacji płytek krwi. Po naniesieniu powłoki kolagenowej do wszystkich odpowiednich kanałów, przymocuj interfejs do płytki.

Jeśli używasz interfejsu BioFlux 1000, można zaciągnąć oba zatrzaski na stole. W przypadku korzystania z interfejsu BioFlux 200, najpierw dokręć palcem cztery śruby. Gdy wszystkie będą ustawione, użyj klucza dynamometrycznego, aby dokręcić je całkowicie.

Klucz dynamometryczny kliknie po osiągnięciu wartości maksymalnej. Korzystając z trybu ręcznego w oprogramowaniu bio flux, zastosuj perfuzję w wybranych kanałach z przepływem 2D na centymetr kwadratowy z wylotu. Użyj obiektywu o niskiej powiększeniu w mikroskopie, aby zlokalizować otwór wlotowy i zaobserwować napełnianie cieczą przeciwległego otworu wewnętrznego.

Najpierw powinna pojawić się mała ilość cieczy, która po kilku minutach powoli wypełni wewnętrzny otwór; gdy wewnętrzny otwór wlotowy zostanie wypełniony, należy zatrzymać perfuzję we wszystkich kanałach, klikając przycisk stop w oprogramowaniu. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. W czasie tej inkubacji można rozpocząć przygotowywanie krwi pełnej, aby było ono gotowe po zakończeniu godzinnej inkubacji.

Po przygotowaniu krwi należy usunąć interfejs i dodać jeden mililitr PBS z dodatkiem jonów wapnia i magnezu do otworu wylotowego. Rozpocząć perfuzję z otworu wylotowego z prędkością 2 dyn/cm² i kontynuować perfuzję przez 10 minut. Po 10 minutach zatrzymać perfuzję. Po usunięciu interfejsu należy usunąć nadmiar PBS z obu otworów: wlotowego i wylotowego.

Nigdy nie usuwaj cieczy wypełniającej wewnętrzny wybijak. Aby zablokować kanały, dodaj jeden mililitr roztworu blokującego do każdego otworu wylotowego. Studzienka wykorzystywana do perfuzji z otworu wylotowego powinna pracować z przepływem 2 dyn/cm²; perfuzję należy kontynuować przez 10 minut.

Zatrzymaj perfuzję po 10 minutach i usuń interfejs. Kanały są teraz gotowe i mogą być wykorzystywane w ciągu dnia, podczas gdy płytka jest powlekana kolagenem. W trakcie jednej godziny inkubacji należy przygotować do obrazowania i wprowadzenia do płytki świeżą krew ludzką pobraną od osoby na czczo.

Krew należy pobrać do cytrynianu sodu jako przeciwkrzepliwego i wykorzystać w ciągu trzech godzin od momentu pobrania. Najpierw do krwi należy dodać roztwór zapasowy calcium M o stężeniu 4 mM w DMSO w rozcieńczeniu 1:1000 objętościowo. Aby uzyskać stężenie 4 µM calcium am, próbkę miesza się poprzez delikatne odwracanie.

Następnie odmierzyć 1 mL krwi znakowanej wapniem do dziesięciu probówek mikrocentryfużowych o pojemności 1,5 mL. Do każdej probówki dodać przeciwciało inhibitorowe GP2B3 w odpowiednim rozcieńczeniu. Należy pamiętać o uwzględnieniu ujemnej kontroli bez przeciwciał oraz dodatniej kontroli z niepowiązanym przeciwciałem, mieszając zawartość poprzez delikatne odwracanie probówek.

Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, delikatnie odwracając je co 10 minut przed rozpoczęciem eksperymentu w komorze przepływowej. W module sterującym bio flux należy skonfigurować zautomatyzowany protokół dla kolagenu. One. Skonfigurować protokół, aby przepływ krwi wynosił dziesięć dziewięć centymetrów kwadratowych przez 10 minut z odpływu.

Należy skonfigurować parametry akwizycji danych stacji roboczej BioFlex 1000, które obejmują pożądane pozycje stolika, akwizycję w określonej długości fali oraz ustawienia time-lapse. Typowy plan akwizycji obrazów dla tego protokołu obejmowałby jedno pole widzenia na kanał, rejestrowane przy użyciu obiektywu 10x co 30 sekund przez całkowity czas 10 minut. Możliwe jest również wybranie dodatkowych pól widzenia oraz alternatywnych ustawień TimeLapse.

Po ustawieniu zautomatyzowanego protokołu i parametrów akwizycji danych, należy powrócić do płytki BioFlex i usunąć ciecz z obu stron kanału, z wyjątkiem wewnętrznych otworów (punches). Pracując szybko, należy nalać 500 µL krwi dla każdego wariantu do otworów wylotowych każdego kanału. Należy zauważyć, że otwory wylotowe są wykorzystywane do dostarczania krwi, ponieważ stanowią one najkrótszą drogę do strefy obserwacyjnej, co zapewni szybszą reakcję krwi na powłokę kolagenową.

Dodatkowo, wprowadź krew kontrolną bez przeciwciał do kanału pokrytego kolagenem oraz do kanału jedynie zablokowanego. Umieść płytkę w mikroskopie stacji roboczej BioFlex 1000 i zamocuj ją w interfejsie. Przeprowadź kalibrację listy pozycji stolika, lokalizując pierwszy punkt kalibracyjny, który definiuje punkt początkowy.

Następnie zlokalizuj i zaznacz drugi punkt kalibracyjny. Zastosuj tę kalibrację do odpowiedniej listy pozycji (stage list). Zapewnia to automatyczne odnajdywanie wszystkich miejsc obserwacji na płytce.

Przesuń stolik do jednego z kanałów zawierających krew, ustaw parametry akwizycji obrazu, takie jak czas ekspozycji i wzmocnienie, w oprogramowaniu BioFlex montage. Uruchom odpowiedni proces roboczy, klikając wybrany przycisk. Spowoduje to jednoczesne rozpoczęcie protokołu przepływu i akwizycji obrazów.

Po zakończeniu eksperymentu należy wyjąć płytkę ze stacji roboczej BIOFLU 1000 i zutylizować ją zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Wykorzystano mikroprzepływowe kanały powlekane kolagenem systemu bio flux. W nieleczonej kontrolnej próbce krwi w czasie obserwuje się gwałtowne tworzenie zakrzepów.

W przeciwieństwie do tego, w kanale niepowlekanym nie obserwuje się tworzenia skrzepów. W jednym z niedawno przeprowadzonych eksperymentów średnia wielkość agregatów w warunkach kontrolnych wynosiła 2000 µm². GP IIb/IIIa jest silnym mediatorem interakcji płytek krwi i stabilizacji agregacji podczas aktywacji poprzez przyleganie do kolagenu; jak pokazano tutaj, po inkubacji z przeciwciałem anty-GP IIb/IIIa przez jedną godzinę przed poddaniem działaniu sił ścinania, obserwuje się zmniejszenie wielkości skrzepów oraz zmniejszenie częstotliwości ich tworzenia.

Zależna od dawki odpowiedź może być zazwyczaj zaobserwowana przy 10 dyn cm⁻² i wartość IC₅₀ dla tego konkretnego inhibitora wyniosła 17 nM. Maksymalne hamowanie dla tego donora w porównaniu z kontrolą bez przeciwciał wyniosło 11% przy 10 dyn cm⁻². Do przeprowadzania eksperymentów z pełną krwią przy wysokim ścinaniu do 200 dyn cm⁻² lub 5000 s⁻¹ dostępna jest również płytka 48-dołkowa.

Właśnie zaprezentowaliśmy sposób wykorzystania mikroprzepływowych kanałów przepływowych do przeprowadzania istotnych fizjologicznie eksperymentów z zakresu biologii naczyniowej. Podczas realizacji tego protokołu ważne jest, aby pamiętać o rozcieńczeniu kolagenu w odpowiednim buforze. Zawsze stosuj prawidłową technikę pipetowania, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza, i zawsze przestrzegaj przepisów bezpieczeństwa biologicznego obowiązujących w Twoim laboratorium.

To już wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.