Name: Równoległa komora przepływowa i ciągły obwód przepływu do oceny śródbłonkowych komórek progenitorowych pod wpływem naprężeń ścinających przepływu laminarnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Poznaj metodę badania komórek śródbłonkowych pod wpływem naprężeń ścinających przepływ laminarny w komorze przepływowej. Technika umożliwia wizualizację i analizę metabolitów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Joe’owi Owenowi z warsztatu aparatury i maszyn biomedycznych za jego niestrudzone wysiłki przy obróbce i montażu części komory przepływowej oraz Mattowi Maudsleyowi z Leica Microsystems za pomoc w opracowaniu technik obrazowania komórek w komorach przepływowych. Jesteśmy wdzięczni Kevinowi Collinsowi z Duke Perfusion Services oraz dr Steve’owi Wallace’owi z Katedry Inżynierii Biomedycznej za pomocne sugestie dotyczące projektu obwodu przepływowego. Chcielibyśmy również podziękować National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program za wsparcie Alexandry Jantzen oraz NIH za wsparcie w ramach grantu „Autologous EPC lining to improve biocompatibility of circulatory assist devices” RC1HL099863-01.

<ol><li>Bhat, V. D., Truskey, G. A., Reichert, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+and+avidin-biotin+as+a+heterogeneous+ligand+system+for+enhanced+endothelial+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Fibronectin and avidin-biotin as a heterogeneous ligand system for enhanced endothelial cell adhesion.</a> J. Biomed. Mater. Res. 41, 377-385 (1998).</li>
<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Cord blood stem and progenitor cells.</a> Methods Enzymol. 419, 439-473 (2006).</li>
<li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAchneck%2C+HE+%22American+Heart+Association+Scientific+Sessions%2C+Abstract+Oral+Sessions%2C+Medical+Aspects+End+Stage+Heart+Failure%3A+Transplantation+and+Device+Therapies%22">American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies</a>. , (2010).</li>
<li>Brown, M. A., Wallace, C. S., Angelos, M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+umbilical+cord+blood-derived+late+outgrowth+endothelial+progenitor+cells+exposed+to+laminar+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng.+Part.+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of umbilical cord blood-derived late outgrowth endothelial progenitor cells exposed to laminar shear stress.</a> Tissue. Eng. Part. A. 15, 3575-3587 (2009).</li>
<li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+titanium+ventricular+assist+device+surfaces+after+gold%2Fpalladium+coating+for+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy.</a> Microsc. Res. Tech. 73, 71-76 (2010).</li>
<li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biocompatibility+of+titanium+cardiovascular+devices+seeded+with+autologous+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%3A+EPC-seeded+antithrombotic+Ti+Implants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants.</a> Biomaterials. 32, 10-18 (2011).</li>
<li>Rinker, K. D., Prabhakar, V., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+contact+time+and+force+on+monocyte+adhesion+to+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Effect of contact time and force on monocyte adhesion to vascular endothelium.</a> Biophys. J. 80, 1722-1732 (2001).</li>
<li>Truskey, G. A., Yuan, F., Katz, D. F. Ch. 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTruskey%2C+GA+%22Transport+Phenomena+in+Biological+Systems%22">Transport Phenomena in Biological Systems</a>. Horton, M. J. , Pearson Education. (2004).</li>
<li>Truskey, G. A., Yuan, F., Katz, D. F. Ch. 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTruskey%2C+GA+%22Transport+Phenomena+in+Biological+Systems%22">Transport Phenomena in Biological Systems</a>. Horton, M. J. , Pearson Education. (2009).</li>
<li>Allen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+nitrite+response+and+arterial+reactivity+differentiate+vascular+health+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Plasma nitrite response and arterial reactivity differentiate vascular health and performance.</a> Nitric Oxide. 20, 231-237 (2009).</li>
<li>Xiao, Y., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+receptor-ligand+affinity+on+the+strength+of+endothelial+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Effect of receptor-ligand affinity on the strength of endothelial cell adhesion.</a> Biophys. J. 71, 2869-2884 (1996).</li>
<li>Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+Adhesion+and+Aggregation+Under+Flow+using+Microfluidic+Flow+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells.</a> J. Vis. Exp. (32), e1644-e1644 (2009).</li>
<li>Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. W. ell <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((plate-coupled+microfluidic+devices+designed+for+facile+image-based+cell+adhesion+and+transmigration+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays.</a> J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).</li>
<li>Conant, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+well-plate+microfluidic+devices+to+conduct+shear-based+thrombosis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays.</a> J. Lab. Autom. 16, 148-152 (2011).</li>
<li>Metaxa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide-dependent+stimulation+of+endothelial+cell+proliferation+by+sustained+high+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide-dependent stimulation of endothelial cell proliferation by sustained high flow.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 295, H736-H742 (2008).</li>
<li>Radel, C., Carlile-Klusacek, M., Rizzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+caveolae+in+beta1+integrin-mediated+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Participation of caveolae in beta1 integrin-mediated mechanotransduction.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 358, 626-631 (2007).</li>
<li>Wang, X. L., Fu, A., Spiro, C., Lee, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analysis+of+Vascular+Endothelial+Cells-Effects+of+Laminar+Shear+Stress+and+High+Glucose%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics.+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analysis of Vascular Endothelial Cells-Effects of Laminar Shear Stress and High Glucose.</a> J. Proteomics. Bioinform. 2, 445-445 (2009).</li>
<li>Elfervig, M. K., Minchew, J. T., Francke, E., Tsuzaki, M., Banes, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1beta+sensitizes+intervertebral+disc+annulus+cells+to+fluid-induced+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">IL-1beta sensitizes intervertebral disc annulus cells to fluid-induced shear stress.</a> J. Cell. Biochem. 82, 290-298 (2001).</li>
<li>Archambault, J. M., Elfervig-Wall, M. K., Tsuzaki, M., Herzog, W., Banes, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+tendon+cells+produce+MMP-3+in+response+to+fluid+flow+without+significant+calcium+transients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Rabbit tendon cells produce MMP-3 in response to fluid flow without significant calcium transients.</a> J. Biomech. 35, 303-309 (2002).</li>
<li>Patton, J. T., Menter, D. G., Benson, D. M., Nicolson, G. L., McIntire, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computerized+analysis+of+tumor+cells+flowing+in+a+parallel+plate+chamber+to+determine+their+adhesion+stabilization+lag+time%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Motil.+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Computerized analysis of tumor cells flowing in a parallel plate chamber to determine their adhesion stabilization lag time.</a> Cell. Motil. Cytoskeleton. 26, 88-98 (1993).</li>
<li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Physiologic+E-Selectin-Mediated+Leukocyte+Rolling+on+Microvascular+Endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009-e1009 (2009).</li>
<li>Kaper, H. J., Busscher, H. J., Norde, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+poly%28ethylene+oxide%29+brushes+on+glass+surfaces+and+adhesion+of+Staphylococcus+epidermidis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomater.+Sci.+Polym.+Ed%22%5BJournal%5D)">Characterization of poly(ethylene oxide) brushes on glass surfaces and adhesion of Staphylococcus epidermidis.</a> J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 14, 313-324 (2003).</li>
<li>Bakker, D. P., Plaats, A. vander, Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+velocity+profiles+for+different+flow+chamber+designs+used+in+studies+of+microbial+adhesion+to+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).</li>
<li>Angelos, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+adhesion+of+umbilical+cord+blood+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic adhesion of umbilical cord blood endothelial progenitor cells under laminar shear stress.</a> Biophys. J. 99, 3545-3554 (2010).</li>
<li>Baker, G. R., Sullam, P. M., Levin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+fluorescent+method+to+internally+label+platelets+suitable+for+physiological+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">A simple, fluorescent method to internally label platelets suitable for physiological measurements.</a> Am. J. Hematol. 56, 17-25 (1997).</li>
</ol>

Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu wideo są sponsorowane przez Cole-Parmer Instrument Co.

Nasz obwód przepływowy oraz komora przepływowa pozwalają nam poddać komórki adherentne, np. EPCs, określonym naprężeniom ścinającym płynu. Ponieważ górna i dolna część komory są przezroczyste, adhezję i morfologię komórek można oceniać w czasie rzeczywistym, bezpośrednio przez komorę, lub po zakończeniu eksperymentu przepływowego i rozmontowaniu komory. Na tym etapie komórki mogą zostać zebrane w warunkach sterylnych i ponownie wysiane lub wykorzystane do izolacji DNA lub RNA itp. w celu przeprowadzenia dalszych analiz.
Aby uzyskać przepływ laminarny, konstrukcja komory musi spełniać kilka warunków.
Po pierwsze, przepływ musi być laminarny, co można zweryfikować obliczając liczbę Reynoldsa (Re), która stanowi stosunek sił bezwładności do sił lepkości. (Jeśli przeważają siły lepkości, Re jest mała, a przepływ jest laminarny lub „w pełni rozwinięty” – zazwyczaj dla Re &lt; 2300. Jeśli przeważają siły bezwładności, przepływ staje się coraz bardziej chaotyczny, aż do momentu wystąpienia turbulencji, co ma miejsce dla Re &gt; 4000.) Wartość Re można obliczyć zgodnie z równaniem 3 8,
<img alt="Wzór na liczbę Reynoldsa, równanie dynamiki płynów, kluczowe pojęcie w analizie przepływu" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 3">
gdzie ρ to gęstość płynu, Q to natężenie przepływu, μ to lepkość, w i h to odpowiednio szerokość i wysokość komory, a Dh to średnica hydrauliczna, zdefiniowana zgodnie z równaniem 48,
<img alt="Wzór na średnicę hydrauliczną do analizy przepływu w kanałach prostokątnych." src="/files/ftp_upload/3349/3349eq4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 4">
Liczba Reynoldsa dla naszych trzech komór przepływowych o wysokościach od 166 - 267 μm wynosi od 13,9 - 34,6 przy natężeniach przepływu obliczonych w celu uzyskania naprężenia ścinającego wynoszącego 15 dynes /cm2. Przy natężeniach przepływu obliczonych dla naprężenia ścinającego 100 dynes/ cm2, liczba Reynoldsa w komorach wynosiła od 90,4 - 234. Wszystkie te wartości liczby Reynoldsa są znacznie niższe niż 2300 i spełniają kryterium przepływu laminarnego.
Po drugie, aby pole prędkości i naprężenie ścinające były niezależne od odległości wzdłuż kanału przepływowego (tzn. w pełni rozwinięte), odległość od wlotu płynu do preparasu musi być większa niż długość wlotowa, Le. Warunek ten można spełnić, obliczając długość wlotową zgodnie z równaniem 59.
<img alt="Równanie termodynamiczne Lₑ = 0.04hRₑ w badaniu analizy naukowej." src="/files/ftp_upload/3349/3349eq5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 5">
Dla wartości wymienionych powyżej długość wlotowa wynosi od 0,01 do 0,25 cm.
Po trzecie, aby zapewnić, że prędkość i naprężenie ścinające w kierunku bocznym nie odbiegają znacząco od wartości dla jednowymiarowego przepływu w kanale (ΔPh/2L), stosunek h/w musi być znacznie mniejszy niż 1. Aby średnie naprężenie ścinające przy ściankach w warunkach przepływu dwuwymiarowego stanowiło 95% naprężenia ścinającego przy ściankach w przepływie jednowymiarowym, h/w musi wynosić 0,10, a aby naprężenie ścinające przy ściankach w warunkach przepływu dwuwymiarowego stanowiło 97,5% naprężenia ścinającego przy ściankach w przepływie jednowymiarowym, h/w musi wynosić 0,05. Przy wymiarach zaprojektowanej przez nas komory przepływowej wynoszących 1,7 cm szerokości i 166 - 267 μm wysokości, kryteria te są spełnione.
Ciśnienie będzie zmieniać się wyłącznie w kierunku przepływu, pod warunkiem braku bocznych gradientów ciśnienia na wlocie. Można to ocenić, stosując barwniki lub cząsteczki w ścieżce przepływu. Ponadto, w przypadku eksperymentów z przepływem ustalonym, w obwodzie przepływowym umieszcza się tłumik pulsacji. Tłumik ten eliminuje większość pulsacji wywoływanych przez pompę perystaltyczną w obwodzie, co pozwala na przyjęcie założenia o przepływie ustalonym. Należy zauważyć, że zastosowany tłumik pulsacji powinien być kompatybilny z pompą i cewkami użytymi w obwodzie, aby mógł skutecznie eliminować pulsacje w przepływie wyjściowym dla konkretnych częstotliwości pompy perystaltycznej. W naszej demonstracji tłumik pulsacji Masterflex L/S zapewnia przepływ laminarny, gdy jest stosowany w linii tłocznej z dowolną pompą z serii Masterflex L/S (0 - 600 RPMs) i cewką I/P 26. Do uzyskania przepływu pulsacyjnego można zastosować pompę programowalną w celu generowania różnych kształtów fal.
W przypadku przepływu pulsacyjnego do generowania różnych kształtów fal można użyć pompy programowalnej.
Ponadto układ został zaprojektowany w taki sposób, aby próbki perfuzatu można było łatwo pobierać w różnych punktach czasowych, bez ryzyka kontaminacji komórek lub medium przepływowego. W naszym przykładzie stężenie NO2- mierzono metodą chemiluminescencji przy użyciu analizatora tlenku azotu Ionics/Sievers (NOA 280, Sievers Instruments, Boulder, CO) zgodnie z wcześniejszym opisem10. Jako reduktor do analizy azotynów zastosowano jodek potasu w kwasie octowym (14,5 M kwas octowy i 0,05 M KI), który posiada potencjał redukcyjny pozwalający na konwersję azotynów do NO, lecz jest niewystarczający do redukcji wyższych tlenków azotu, takich jak azotany, co czyni go stosunkowo specyficznym dla azotynów. Całkowita ilość wytworzonych azotynów została obliczona jako iloczyn uzyskanego stężenia i całkowitej objętości układu, z uwzględnieniem objętości utraconej podczas pobierania próbek6.
Poniższe kroki są kluczowe dla pomyślnego przeprowadzenia eksperymentów przepływowych:
<ol class="lroman">
	<li>Należy dążyć do uniknięcia powstawania pęcherzyków powietrza podczas konfiguracji przepływu, ponieważ mogą one spowodować oderwanie komórek od powierzchni. Można tego uniknąć, zachowując ostrożność podczas nakładania górnej części komory przepływowej na część dolną; najlepiej zrobić to, utrzymując obie części równolegle do siebie i opuszczając górną część na dolną jednym ruchem, bez korygowania jej położenia. Dzięki temu małe pęcherzyki powietrza, które mogą znajdować się i/lub unosić w kanale przepływowym, zostaną skierowane do pułapek na pęcherzyki znajdujących się na obu końcach aluminiowej obudowy.</li>
	<li>Ważne jest, aby upewnić się, że rurka odpływowa w zbiorniku sięga do jego dna. W przeciwnym razie, jeśli poziom perfuzatu spadnie nieco poniżej końcówki rurki, do rurki prowadzącej ze zbiornika do komory może zostać zassane powietrze.</li>
	<li>Badacz powinien znać kierunek przepływu pompy, aby pompa przypadkowo nie zaczęła pracować w przeciwnym kierunku po uruchomieniu przepływu, co skutkowałoby zassaniem powietrza do obiegu i komory.</li>
	<li>Aby uniknąć powstawania piany (wynikającej z obecności zdenaturowanych białek w surowicy), zaleca się opuszczenie rurki prowadzącej z komory do zbiornika na wysokość około jednej uncji powyżej poziomu perfuzatu wewnątrz zbiornika. Utrzymanie jej powyżej poziomu medium przepływowego pozwala jednak na weryfikację przepływu do zbiornika podczas eksperymentu.</li>
	<li>Podczas skręcania elementów komory ważne jest, aby jedną ręką mocno trzymać obudowę, a drugą obsługiwać wkrętarkę elektryczną. Należy pamiętać, że ruch wkrętarki elektrycznej zostanie zamieniony na moment obrotowy, który po dokręceniu śruby może spowodować gwałtowne szarpnięcie komory.</li>
	<li>Aby zapobiec powstawaniu fal ciśnienia w obiegu i odrywaniu komórek od powierzchni, należy upewnić się, że wszystkie kurki są otwarte przed uruchomieniem przepływu.</li>
	<li>Szczególnie w przypadku długoterminowych badań przepływu (&gt; 48 godzin) zalecamy stosowanie twardszych i bardziej odpornych rurek do wkładania w głowicę pompy, aby zapobiec ich pękaniu.</li>
	<li>Możliwe jest „migrowanie” rurek wewnątrz głowicy pompy z powodu źle dopasowanych zębów głowicy. Dlatego sugerujemy zwrócić szczególną uwagę na to, jak rurka jest zabezpieczona w głowicy pompy, oraz zaznaczyć oba końce rurki markerem, aby można było łatwo zauważyć, czy rurka została „wciągnięta” lub przesunięta podczas eksperymentu.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem perfuzji zawsze należy starannie sprawdzić każdy złączy obiegu i komory, aby zapobiec wyciekowi perfuzatu podczas eksperymentu z powodu wadliwego połączenia. Jest to szczególnie istotne w przypadku złączy dopływowych i odpływowych tłumików pulsacji!</li>
	<li>Należy pamiętać o ograniczeniu ekspozycji na światło w przypadku stosowania znaczników fluorescencyjnych.</li>
</ol>
Możliwym ograniczeniem naszej komory przepływowej jest fakt, że jej wysokość jest stała i zależy od wysokości kanału wyfrezowanego w aluminium. Ma to jednak tę zaletę, że nie ma potrzeby weryfikacji i regulacji wysokości kanału przed każdym eksperymentem, co upraszcza obliczenia naprężenia ścinającego poprzez zwykłe dostosowanie przepływu pompy do pożądanej wartości. W zależności od celów badawczych pożądane może być zwiększenie naprężenia ścinającego bez zwiększania prędkości pompy. W takim przypadku zalecamy zwiększenie lepkości perfuzatu, np. poprzez dodanie dekstranu do medium11.
Potencjalnym ograniczeniem układu przepływowego jest duża objętość użytego medium, co może być problematyczne przy próbie ilościowego oznaczenia bardzo niskich stężeń metabolitów komórkowych. Choć nie pokazano tego w niniejszym materiale, możliwe jest znaczne zmniejszenie objętości układu poprzez zastosowanie mniejszego zbiornika i tłumika pulsacji oraz skrócenie i zmniejszenie średnicy cewek.
Dodatkowo istnieje kilka innych dostępnych komercyjnie systemów, które mogą być wykorzystane do przykładania naprężenia ścinającego płynu do komórek w hodowli. Systemy oparte na mikrofluidyce, np. system BioFlux firmy Fluxion, umożliwiają jednoczesną analizę komórek w różnych mikrofluidycznych kanałach przepływowych, do których roztwór jest wprowadzany przez płytki wielodołkowe pełniące funkcję zbiorników wejściowych i wyjściowych dla tych kanałów12,13,14. Jednakże systemy te oraz inne systemy mikrofluidyczne nie są kompatybilne ze standardowymi szkiełkami mikroskopowymi i nie pozwalają na odzyskanie wystarczającej liczby komórek do dalszych eksperymentów, takich jak RT-PCR lub Western Blot. Ponadto są one mniej przyjazne dla użytkownika, kosztują minimum 40 000 USD i w zależności od wyposażenia dodatkowego mogą osiągnąć całkowity koszt przekraczający 100 000 USD.
Dwa systemy makrofluidyczne dostępne w Flexcell International Corporation, systemy Flexcell Streamer i FlexFlow, zostały z powodzeniem wykorzystane do badania komórek śródbłonka15,16,17, ludzkich komórek pierścienia włóknistego18 oraz fibroblastów19 w warunkach przepływu płynu. Trzeci system, dostępny za pośrednictwem GlycoTech, został wykorzystany do badania adhezji komórek nowotworowych20 oraz adhezji leukocytów21 do monowarstw śródbłonka.
System Streamer umożliwia jednoczesne badanie kilku slajdów w tych samych warunkach naprężenia ścinającego, lecz nie posiada okna obserwacyjnego i – w przeciwieństwie do naszej konstrukcji – nie pozwala na wizualizację komórek w czasie rzeczywistym podczas przepływu.
System FlexFlow posiada okno obserwacyjne, lecz wymaga użycia mikroskopu pionowego, który może nie być standardowym mikroskopem dostępnym w większości laboratoriów. Co więcej, system FlexFlow wymaga, aby szkiełko nakrywkowe z naniesioną warstwą komórek zostało odwrócone podczas umieszczania go w komorze przepływowej. Uniemożliwia to wizualizację komórek fluorescencyjnych na powierzchni nieprzezroczystej, takiej jak szkło powlekane tytanem, co demonstrujemy w naszej pracy. Wreszcie, specjalistyczne szkiełka nakrywkowe muszą być kupowane konkretnie do systemu FlexFlow, którego koszt wynosi kilka tysięcy dolarów, podobnie jak w przypadku systemu Flexcell Streamer.
Firma GlycoTech oferuje okrągłe i prostokątne komory przepływowe z równoległymi płytkami, które są znacznie tańsze, lecz wykonane z odlewanego akrylu, którego nie można wygodnie sterylizować w autoklawie w taki sposób, jak naszej komory. Warto zauważyć, że inne opisane jako autoklawowalne komory przepływowe wydają się niepraktyczne, ponieważ wymagają one specjalnych soczewek mikroskopowych22,23. System GlycoTech wykorzystuje uszczelki z gumy silikonowej umieszczone między płytką górną a dolną, których grubość zmienia się przy wielokrotnym użytkowaniu, co z czasem wpływa na wysokość komory (producent zaleca zakup nowych uszczelek po każdych dziesięciu użyciach). Nasza aluminiowa komora z wbudowanymi pierścieniami O-ring umożliwia całkowite przyleganie płytek górnej i dolnej oraz zapewnia stałą wysokość komory pomiędzy eksperymentami. Wreszcie, w wielu konstrukcjach komór przepływowych, w tym w komorach GlycoTech, do uzyskania szczelnego zamknięcia niezbędne są pompy próżniowe, które w naszej konstrukcji nie są wymagane.
Choć nie pokazano tego tutaj, komora przepływową można utrzymywać pod mikroskopem przez cały czas trwania eksperymentu przepływowego w celu obrazowania adhezji i/lub zachowania komórek w czasie rzeczywistym. Jeśli jest to pożądane, zalecamy stosowanie lamp grzewczych lub podkładki grzewczej pod komorą w celu utrzymania temperatury perfuzatu na poziomie 37 °C. Ponadto pompę rolkową można zastąpić pompą strzykawkową, jeśli nie jest pożądana „recyrkulacja” komórek, metabolitów, leków badawczych lub czynników24.
Możliwe jest również przepływanie komórek znakowanych w różny sposób nad komórkami adherentnymi, np. fluorescencyjnych płytek nad warstwą konfluentnych EPC (stosując test płytek opisany przez Achneck i wsp.6,25) w celu oceny oddziaływań międzykomórkowych w warunkach naprężenia ścinającego cieczy. Nasza komora przepływowa łączy w sobie cenne cechy innych dostępnych komór przepływowych, takich jak port pobierania perfuzatu i okno obserwacyjne, a także posiada istotną zaletę w postaci kompatybilności z mikroskopem odwróconym lub prostym. Jest ona w pełni autoklawowalna i umożliwia powtarzanie eksperymentów przy stałej wysokości komory, bez konieczności stosowania pomp próżniowych w celu uzyskania szczelnego zamknięcia.

<table><tbody><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0794012&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">Strzykawka 10 ml&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0794012&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">07940-12&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=3060000&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">Korki trójdrożne 1-drożne&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=3060000&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">30600-00&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 30 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=3060004&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">Korki trójdrożne 4-drożne&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=3060004&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">30600-04&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Stop aluminum Alloy</td><td>N/A</td><td>6061</td><td></td></tr><tr><td>Szalki do hodowli komórkowej (4-dołkowe, prostokątne)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>267061</td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Orange</td><td>Invitrogen</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Research Organics</td><td>2162D</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (-/-)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 Singlequots</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=4550004&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">Adapter Luer żeński&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=4550004&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">SI-45500-04&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895-2MG</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=3459424&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">Butelka szklana (250 ml) z nakrętką&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=3459424&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">34594-24&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0650816&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">Przewód sztywny&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0650816&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">06508-16&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8264-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8889-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór barwiący H&amp;#8211;chst</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6024</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=4550504&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">Adapter Luer męski&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=4550504&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">EW-45505-04&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka MCDB-131, 1X</td><td>Cellgro</td><td>15-100-CV</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0636590&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">Złączki polipropylenowe zでrdzeniem&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0636590&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">06365-90&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Pierścienie O-ring</td><td>N/A</td><td>AS568A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0759620&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">Tłumik pulsacji&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0759620&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">07596-20&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0752440&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">Napęd pompy (napęd ekonomiczny Masterflex L/S o zmiennej prędkości)&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0752440&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">7524-40&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0751860&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">Głowica pompy (głowica pompy Masterflex Easy Load)&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0751860&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">07518-60&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=4850000&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">Suwak&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=4850000&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">48500-00&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=9640016&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">Przewód miękki&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=9640016&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">96400-16&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0291512&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">Filtr strzykawkowy&lt;/a&gt;</td><td>Cole-Parmer</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.coleparmer.com/catalog/product_view.asp?sku=0291512&amp;amp;pfx=EW&quot; target=&quot;_blank">02915-12&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik kwasów nukleinowych Sytox Orange</td><td>Invitrogen</td><td>S-11368</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór neutralizujący trypsynę</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-5002</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

komora przepływowa z równoległymi płytkami i obwód przepływu ciągłego do oceny komórek progenitorowych śródbłonka pod wpływem naprężenia ścinającego w przepływie laminarnym

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Ogólnym celem tej metody jest opisanie techniki poddawania przylegających komórek warunkom przepływu laminarnego oraz ocena ich reakcji na dobrze mierzalne naprężenia ścinające płynu1.
Konstrukcja naszej komory przepływowej oraz układ przepływowy (Ryc. 1) zawierają przezroczysty obszar obserwacyjny, który umożliwia badanie adhezji komórek oraz obrazowanie morfologii komórek bezpośrednio przed przepływem (Ryc. 11A, B), w różnych punktach czasowych podczas przepływu (Ryc. 11C) oraz po przepływie (Ryc. 11D). Eksperymenty te zostały zilustrowane z wykorzystaniem ludzkich komórek progenitorowych śródbłonka (EPCs) pochodzących z krwi pępowinowej oraz świńskich EPCs2,3.
Niniejsza metoda ma zastosowanie również w przypadku innych typów komórek adherentnych, np. komórek mięśni gładkich (SMCs) lub fibroblastów.
Komorę oraz wszystkie elementy układu można łatwo sterylizować w autoklawie parowym. W przeciwieństwie do innych komór, np. komór mikrofluidycznych, po eksperymencie przepływowym w warunkach sterylnych można odzyskać dużą liczbę komórek (&gt; 1 milion, w zależności od wielkości komórek) do hodowli komórkowych lub innych analiz, np. ekstrakcji DNA lub RNA, immunohistochemii (Ryc. 11E) lub skaningowej mikroskopii elektronowej5. Naprężenie ścinające można regulować poprzez zmianę szybkości przepływu perfuzatu, lepkości cieczy lub wysokości i szerokości kanału. To ostatnie pozwala zmniejszyć objętość cieczy lub zapotrzebowanie na komórki, zapewniając jednocześnie utrzymanie przepływu jednowymiarowego. Pomiary wysokości komory między eksperymentami nie są konieczne, ponieważ wysokość komory nie zależy od zastosowania uszczelek, co znacznie ułatwia przeprowadzanie wielokrotnych doświadczeń. Ponadto konstrukcja układu umożliwia łatwe pobieranie próbek perfuzatu do analizy i/lub kwantyfikacji metabolitów wydzielanych przez komórki pod wpływem naprężenia ścinającego, np. tlenku azotu (Ryc. 12)6.

Opisujemy metodę poddawania przylegających komórek naprężeniom ścinającym w przepływie laminarnym w sterylnym obwodzie przepływu ciągłego. Poprzez przezroczystą komorę można badać adhezję i morfologię komórek, a z obwodu można pobierać próbki do analizy metabolitów oraz zbierać komórki po ekspozycji na siły ścinające do dalszych eksperymentów lub hodowli.

Komora przepływowa z równoległymi płytkami i obwód przepływu ciągłego do oceny komórek progenitorowych śródbłonka pod wpływem naprężenia ścinającego w przepływie laminarnym

Ogólnym celem niniejszej metody jest opisanie techniki poddawania komórek adherentnych warunkom przepływu laminarnego oraz ocena ich odpowiedzi na...

Ogólnym celem niniejszego artykułu wideo jest opis techniki poddawania komórek adherentnych warunkom przepływu laminarnego oraz ocena odpowiedzi na dobrze mierzalne naprężenia ścinające płynu. Jest to realizowane poprzez wstępny montaż układu przepływowego bez komory przepływowej. Układ obejmuje zbiornik impulsu, tłumik, rurki sztywne, rurki elastyczne, czworodrożne kurki i połączone adaptery Luer, a także filtr powietrza.Kolejnym krokiem jest napełnienie układu pożądanym płynem, na przykład pożywką komórkową w warunkach sterylnych, a następnie uruchomienie pompy w celu napełnienia tłumika pulsacji i usunięcia powietrza z przewodów. Następnie do dolnej płyty komory przepływowej wprowadza się szkiełko z osadzonymi komórkami. Ostatnim etapem procedury jest całkowity montaż układu przepływowego z wpiętą w obieg komorą przepływową.W rezultacie można uzyskać obrazy wykazujące orientację fluorescencyjnie znakowanych komórek progenitorowych śródbłonka pod wpływem naprężenia ścinającego cieczy w przezroczystej komorze, wykorzystując mikroskop fluorescencyjny w celu zbadania funkcjonalnego zachowania komórek. Aby zbadać zachowanie komórek, często konieczne jest naśladowanie fizjologii in vivo poprzez poddawanie ich działaniu naprężenia ścinającego cieczy. Zaprojektowaliśmy komorę przepływową z równoległymi płytkami oraz obwód przepływu ciągłego, co pozwala nam badać komórki w warunkach przepływu i obserwować je przez przezroczystą komorę.Technika ta może służyć jako wartościowe narzędzie badawcze w dziedzinie medycyny i inżynierii. Nasza komora przepływowa umożliwia okresową lub w czasie rzeczywistym wizualizację komórek w przepływie przy użyciu mikroskopu prostego lub odwróconego. Ponadto konstrukcja opracowana przez dr. Ach Nicka pozwala badaczom na obrazowanie komórek zarówno na powierzchniach przezroczystych, jak i radioprzepuszczalnych, z wykorzystaniem standardowych obiektywów mikroskopowych.Ponadto może to służyć jako ważne narzędzie w badaniach farmakologicznych do analizy wpływu leków na komórki w warunkach przepływu. Wizualizacja całego układu jest kluczowa, ponieważ niektóre z etapów są trudne do opanowania na podstawie samego protokołu. Przedstawię instrukcje krok po kroku, jak przygotować komorę przepływową oraz obwód przepływowy powszechnie stosowany w laboratorium dr. Ock Nexta w celu złożenia obwodu przepływowego.Zacznij od przymocowania 36-calowego odcinka sztywnego przewodu do jednego końca tłumika pulsacji, a następnie do drugiego końca. Przymocuj 18-calowy odcinek miękkiego przewodu. Na końcu 18-calowej sekcji miękkiego przewodu umieść adapter z męskim złączem typu lure o średnicy 1/8 cala.Połącz męski konektor z adapterem żeńskim o średnicy 1/8 cala. Przyłącz konektor żeński do nowego, 18-calowego odcinka miękkiego wężyka. Wywierć trzy otwory w zakrętce zlewki szklanej o pojemności 250 ml.Aby dopasować rurkę, należy włożyć 1,5 calowy odcinek miękkiej rurki do jednego otworu, który będzie służył jako odpowietrznik. Wolne końce twardej i miękkiej rurki należy przełożyć przez dwa pozostałe otwory w zakrętce do szklanej butelki o pojemności 250 mililitrów, która będzie pełnić funkcję zbiornika.Upewnij się, że sztywna rurka sięga dna zbiornika. Utrzymanie sterylności podczas całego procesu przygotowania obwodu jest kluczowe dla powodzenia tej procedury. W związku z tym wszystkie elementy muszą zostać wysterylizowane, a podczas pracy należy stale używać sterylnych rękawiczek.Oprócz zmontowanych części, należy wysterylizować następujące elementy: jedną kompletną komorę przepływową, odcinki miękkiego wężyka o wymiarach 3x2 cale, jeden adapter Luer male i jeden Luer female o średnicy 1/8 cala, cztery wkręty z łbem płaskim 1/2 cala, 6 5/16 cala, osiem wkrętów z łbem płaskim 30 tpi (nitków na cal), jedną pęsetę, jedno szkiełko przedmiotowe oraz dwa ręczniki, sterylizując je za pomocą pary.Autoklawowanie w temperaturze 121 °C przez 60 minut. Umieść komorę przepływową obwodu przepływowego, dwa czworodrożne kurki odcinające, jeden jednodrożny kurek odcinający oraz wszystkie wysterylizowane części na tym sterylnym polu. W rękawicach sterylnych połącz dwa czworodrożne kurki odcinające.Załóż nakrętki na otwarte porty próbkowania. Odłącz męskie i żeńskie adaptery łączące dwa segmenty elastycznego przewodu w obwodzie przepływowym i wstaw podłączone kurki odcinające. Połącz elastyczny przewód wprowadzony do zbiornika z strzykawką o pojemności 30 milliliter i wyjmij tłok strzykawki.Napełnij butelkę 125 mililitrami pożywki EPC. Ponownie podłącz elastyczny przewód do kurka odcinającego. Włóż sterylny filtr strzykawkowy do otworu odpowietrzającego.Następnie przenieś obwód przepływowy do inkubatora z nawilżaniem w temperaturze 37 °C, przy 5% dwutlenku węgla. Zamocuj sztywną rurkę w głowicy pompy perystaltycznej Master Flex przeznaczonej do pracy z tym typem rurek Palmer. Upewnij się, że rurka nie nakłada się na prowadnice montażowe pompy rolkowej.Zaznacz markerem rurki w miejscach, w których opuszczają one głowicę pompy po obu stronach. Po upewnieniu się, że wszystkie kurki odcinające są zamknięte w stronę portów z próbkami i otwarte wzdłuż obwodu przepływu, uruchom pompę. Zweryfikuj kierunek przepływu.Przez szklny zbiornik i sztywne rurki PERFUSE eight powinien przepływać do tłumika pulsacji. W celu złożenia komory przepływowej należy użyć sterylnych rękawiczek, aby połączyć jeden 2-calowy odcinek miękkiej rurki z żeńskim adapterem Luer 1/8 cala. Następnie należy połączyć kolejny 2-calowy odcinek miękkiej rurki z męskim adapterem Luer 1/8 cala.Podłączyć dwucalowy miękki przewód z żeńskim adapterem typu lure do portu wlotowego, a dwucalowy miękki przewód z męskim adapterem typu lure do portu wylotowego. Do obu tych adapterów lure przymocować czterodrożne kurki odcinające. Pozostały dwucalowy fragment miękkiego przewodu połączyć z łącznikiem portu bocznego wychodzącego z pułapki pęcherzykowej i za pomocą sterylnej pęsety przymocować zawór jednokierunkowy.Wyjmij preparat z nasiewem komórek z naczynia do hodowli i umieść go w zagłębieniu na spodniej płycie komory przepływowej. Upewnij się, że preparat jest umieszczony stroną z nasiewem komórek do góry; za pomocą strzykawki lub pipety nalej 10 mililitrów ciepłego pożywki EPC na preparat z komórkami. Pozwól, aby pożywka pokryła preparat w komorze przepływowej, dbając o to, aby medium nie przelało się nad uszczelką O-ring na spodniej płycie.Umieść górną płytkę komory przepływowej na płytce dolnej, dopasowując otwory na śruby. Utrzymaj obie płytki równolegle, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do komory. Skręć płytki razem. Używając automatycznego akumulatorowego wkrętaka, odpowietrz pułapkę pęcherzyków na wlocie, otwierając zawór jednokierunkowy przymocowany do portu pułapki pęcherzyków po stronie wlotowej.Użyj strzykawki 10 ml, aby delikatnie przepłukać przewód dopływowy medium EPC, a następnie zamknij ten kurek i załóż nasadkę. Teraz usuń powietrze z kanału komory, otwierając czterodrożny kurek portu odpływowego i delikatnie przepłukując komorę przepływową medium EPC. Ponownie, używając strzykawki 10 ml, załóż nasadki na wszystkie przyłącza czterodrożnego kurka i zamknij je.Przenieś komorę przepływową wraz z zmontowanym układem przepływowym do inkubatora z nawilżaczem. Wstrzymaj pracę pompy układu przepływowego i zamknij kurki odcinające w układzie przepływowym zgodnie z kierunkiem przepływu, aby zapobiec wyciekom.Podłącz komorę przepływową do obwodu przepływowego. Po podłączeniu komory przepływowej do obwodu przepływowego otwórz kurki w kierunku przepływu. Uruchom pompę przepływową i upewnij się, że PERFUSE eight płynie w prawidłowym kierunku. Dostosuj szybkość przepływu do pożądanego naprężenia ścinającego.Podczas eksperymentu z przepływem komorę przepływową można usunąć z obiegu, aby obrazować komórki za pomocą mikroskopii świetlnej lub fluorescencyjnej. W tym celu należy odłączyć komorę przepływową od obwodu przepływowego w miejscach połączeń kurek odrzutowych. Aby zebrać próbki perfuzyjne do analizy.W pierwszej kolejności należy zatrzymać pompę i zamknąć kurek odcinający znajdujący się najbliżej tłumika pulsacji. Zdjąć z niego nasadkę ochronną, kładąc ją dnem do góry, aby zapobiec kontaminacji. Wprowadzić małą strzykawkę do portu poboru próbek.Zamknij kurek w kierunku komory przepływowej, pozostawiając otwarcie port próbkowy i obwód w kierunku tłumika pulsacji. Pobierz pożąganą ilość próbki z obwodu, a następnie zamknij kurek w stronę portu próbkowego przed wyjęciem strzykawki. Przechowuj pobraną próbkę w opisanej probówce i zamroź w temperaturze -80 °C.Zakręć port próbkowy i upewnij się, że wszystkie kurki są otwarte przed rozpoczęciem przepływu. Przy zastosowaniu tej metody ludzkie komórki progenitorowe śródbłonka pochodzące z krwi mogą zostać wysiane na płytki tytanowe w ciągu 15 minut i przywrzeć w warunkach fizjologicznych sił ścinania. Jak pokazano na tej figurze, EPC rozprzestrzeniają się pod wpływem przepływu od około 210 µm² bezpośrednio po wysianiu do około 657 µm² po trzech godzinach i około 1 152 µm² po 48 godzinach naprężenia ścinającego płynu wynoszącego 15 dyn/cm².Ten obraz z mikroskopu świetlnego ilustruje losową orientację ludzkich EPC. Po sześciogodzinnym okresie statycznego osadzania, poprzedzającym trzy godziny przepływu z siłą 100 dines na centymetr kwadratowy, komórki rozprzestrzeniły się, lecz zachowały losową orientację. Po 48 godzinach działania naprężenia ścinającego cieczy o wartości 100 dines na centymetr kwadratowy, EPC są wyrównane i zorientowane zgodnie z kierunkiem przepływu.W tym przypadku EPCs zostały oznakowane CTO, a jądra komórkowe barwiono herx po zakończeniu przepływu. Dla porównania, obraz ten przedstawia świńskie EPCs na płytkach tytanowych w orientacji zgodnej z kierunkiem przepływu. Po 48 godzinach przepływu i ekspozycji na naprężenie ścinające o wartości 15 dines na centymetr kwadratowy, brzegi komórek wybarwiono przeciwciałem przeciw pcam, a jądra barwiono barwnikiem kwasów nukleinowych cytoxin.Metoda ta umożliwia również pobieranie próbek z PERFUSE eight w określonych punktach czasowych w celu analizy i/lub kwantyfikacji wydzielanych metabolitów komórkowych. Przedstawiono tutaj przykład produkcji azotynów podczas 48-godzinnego eksperymentu z przepływem z udziałem świńskich EPCs. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zachowanie sterylności przez cały czas.Dodatkowo ważne jest podjęcie niezbędnych kroków w celu zredukowania liczby pęcherzyków powietrza w komorze przepływowej przed rozpoczęciem przepływu ciągłego, ponieważ mogą one oderwać komórki. Zalecamy również sprawdzenie każdego połączenia w komorze przepływowej i obwodzie przed perfuzją, aby zapobiec wyciekowi PERFUSE eight podczas eksperymentu. Komora ta została zaprojektowana z wbudowanymi o-ringami, które umożliwiają pełne przeciwstawienie się płytki górnej i dolnej oraz zapewniają szczelność bez konieczności stosowania pomp próżniowych.Ta cecha zapewnia również stałą wysokość komory pomiędzy eksperymentami i eliminuje potrzebę stosowania uszczelek gumowych lub dokonywania regulacji. Nasza komora przepływowa wykorzystuje standaryzowane szkiełka przedmiotowe. Dzięki temu duża liczba komórek jest dostępna do dalszych doświadczeń.Na przykład RNA i DNA z komórek po przepływie mogą być poddane ocenie pod kątem syntezy białek lub ekspresji genów. Konstrukcja naszego układu umożliwia pobranie ośmiu próbek z perfuzji do analizy i kwantyfikacji metabolitów komórkowych, takich jak azotyn, który jest głównym utlenionym metabolitem tlenku azotu wydzielanego przez komórki pod wpływem naprężenia ścinającego cieczy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat montażu naszej komory przepływowej oraz sterylnego układu przepływowego w celu poddania komórek adherentnych naprężeniu ścinającemu cieczy.

parallel-plate-flow-chamber-continuous-flow-circuit-to-evaluate

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Komora przepływowa z równoległymi płytkami i obwód przepływu ciągłego do oceny komórek progenitorów śródbłonka w warunkach laminarnego stres ścinającego przepływu

Mikrofluidyczne komory przepływowe, wytrawione metodą fotolitografii i wykonane z PDMS, są stosowane do badania wyników funkcjonalnych związanych z dysfunkcją EC i stanem zapalnym. W reprezentatywnym eksperymencie wykazano zdolność różnicowego naprężenia ścinającego do modulowania adhezji komórek monocytarnych do monowarstw EC aktywowanych cytokinami.

Fenotypowanie zapalne śródbłonka na chipie

Ten film demonstruje test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować interakcję leukocytów i partnerów komórkowych, takich jak komórki śródbłonka. Metoda ta zapewnia dynamiczny wgląd w adhezję, martwość i transmigrację leukocytów po perfuzji przez nienaruszoną i zlewającą się warstwę komórek naczyniowych.

Test oparty na przepływie laminarnym do badania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka

To badanie wykorzystało wielodołkowy system mikroprzepływowy, znacznie zwiększając przepustowość badań toczenia komórek pod fizjologicznie istotnym przepływem ścinającym. Biorąc pod uwagę znaczenie zwijania komórek w wieloetapowej kaskadzie naprowadzania komórek oraz znaczenie naprowadzania komórek po ogólnoustrojowym dostarczeniu egzogennych populacji komórek u pacjentów, system ten oferuje potencjał jako platforma przesiewowa w celu ulepszenia terapii opartej na komórkach.

Systematyczna analiza walcowania komórek in vitro przy użyciu systemu mikroprzepływowego z wielodołkową płytką

Trójwymiarowa komora przepływowa to nowatorska technologia in vitro do ilościowej i stopniowej oceny kaskady wynaczynień komórek krążących w warunkach fizjologicznego stresu ścinającego. W związku z tym urządzenie spełnia krytyczną potrzebę podstawowych, przedklinicznych i klinicznych badań migracji komórek.

Nowatorskie trójwymiarowe urządzenie z komorą przepływową do badania wynaczynienia komórek krążących w fizjologicznych warunkach przepływu kierowanego przez chemokinę

Transfuzja płytek krwi i hemostaza były modelowane za pomocą komór do rekonstytucji krwi i przepływu mikroprzepływowego w celu zbadania funkcji płytek krwi bankujących. Dane wskazują na wpływ zmian spichrzających płytki krwi na hemostazę in vitro.

Mikroprzepływowe komory przepływowe wykorzystujące rozpuszczoną krew do modelowania hemostazy i transfuzji płytek krwi in vitro

Różne poziomy i wzorce ścinania płynu są znane z modulowania ekspresji genów śródbłonka, fenotypu i podatności na choroby. Omawiamy montaż i zastosowanie "pierścieni ścinających": modelu, który wytwarza jednokierunkowe, okresowe wzorce naprężeń ścinających. Pierścienie ścinane są proste w montażu, ekonomiczne i mogą wytwarzać wysoką wydajność ogniw.

Montaż i zastosowanie "pierścieni ścinających": nowy model śródbłonka dla orbitalnego, jednokierunkowego i okresowego przepływu płynów oraz naprężeń ścinających

Ten artykuł opisuje eksperymentalny model hemostazy, który jednocześnie mierzy funkcję płytek krwi i krzepnięcie. Fluorescencja płytek krwi i fibryny jest mierzona w czasie rzeczywistym i określa się szybkość adhezji płytek krwi, szybkość krzepnięcia i początek krzepnięcia. Model służy do określania właściwości prokoagulantów płytek krwi pod wpływem przepływu w koncentratach do transfuzji.

Model mikroprzepływowej komory przepływowej do transfuzji płytek krwi i hemostazy mierzy odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny w czasie rzeczywistym

Ta praca opisuje metodę opartą na mikroskopii fluorescencyjnej do badania adhezji, rozprzestrzeniania się i wydzielania płytek krwi pod przepływem. Ta wszechstronna platforma umożliwia badanie funkcji płytek krwi w badaniach mechanistycznych nad zakrzepicą i hemostazą.

Obrazowanie żywych komórek degranulacji i wydzielania płytek krwi pod wpływem przepływu

Leukocyty chętnie oddziałują z komórkami naczyniowymi i płytkami krwi po uszkodzeniu ściany naczynia lub podczas stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy prosty test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw interakcji między leukocytami a ich partnerami komórkowymi.

Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi

Tutaj przedstawiono przebieg pracy dla hodowli i analizy ekspresji genów komórek śródbłonka pod wpływem naprężeń ścinających. Uwzględniono fizyczny układ do jednoczesnego przechowywania i monitorowania wielu komór przepływowych w kontrolowanym środowisku oraz zastosowanie egzogennego referencyjnego RNA do ilościowej reakcji PCR.

Analiza ekspresji genów komórek śródbłonka narażonych na naprężenia ścinające przy użyciu wielu komór przepływowych z równoległą płytką

Poznaj metodę badania komórek śródbłonkowych pod wpływem naprężeń ścinających przepływ laminarny w komorze przepływowej. Technika umożliwia wizualizację i analizę metabolitów w czasie rzeczywistym.

Równoległa komora przepływowa i ciągły obwód przepływu do oceny śródbłonkowych komórek progenitorowych pod wpływem naprężeń ścinających przepływu laminarnego (Wideo) | JoVE Journal

Komora przepływowa z równoległymi płytkami i obwód przepływu ciągłego do oceny komórek progenitorowych śródbłonka pod wpływem naprężenia ścinającego w przepływie laminarnym

Przeglądaj więcej filmów