Równoległa komora przepływowa i ciągły obwód przepływu do oceny śródbłonkowych komórek progenitorowych pod wpływem naprężeń ścinających przepływu laminarnego

Ogólnym celem tego artykułu wideo jest opisanie techniki poddawania przylegających komórek warunkom przepływu laminarnego i oceny reakcji na dobrze mierzalne naprężenia ścinające płynu. Osiąga się to poprzez pierwszy montaż obwodu przepływu bez komory przepływowej. Obwód obejmuje impuls zbiornika, tłumik, twarde rurki, miękkie rurki, czterokierunkowe kurki odcinające i podłączone adaptery przynęty, a także filtr powietrza.

Następnym krokiem jest napełnienie obwodu pożądaną obfitą ósemką, taką jak pożywka komórkowa w sterylnych warunkach, a następnie uruchomienie pompy w celu napełnienia tłumika impulsów i oczyszczenia przewodów z powietrza. Następnie wkłada się suwak osadzony w komórce do dolnej płyty komory przepływowej. Ostatnim etapem procedury jest kompletny montaż obwodu przepływowego z komorą przepływową w linii.

Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują wyrównanie znakowanych fluorescencyjnie komórek progenitorowych śródbłonka pod wpływem naprężeń ścinających płynu przez przezroczystą komorę za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego W celu zbadania funkcjonalnego zachowania komórek. Często konieczne jest naśladowanie fizjologii in vivo poprzez poddawanie komórek działaniu płynnego naprężenia ścinającego. Zaprojektowaliśmy równoległą płytkową komorę przepływową i ciągły obieg przepływu, które pozwalają nam badać ogniwa w warunkach przepływu i obserwować je przez przezroczystą komorę.

Technika ta może służyć jako cenne narzędzie badawcze w dziedzinach medycyny i inżynierii. Nasza komora przepływowa pozwala na przerywaną lub w czasie rzeczywistym wizualizację komórek pod przepływem za pomocą mikroskopu pionowego lub odwróconego. Co więcej, konstrukcja Dr.Ach Nick pozwala naukowcom obrazować komórki na przezroczystych lub nieprzepuszczalnych dla promieni rentgenowskich powierzchniach przy użyciu standardowych soczewek mikroskopowych.

Co więcej, może być ważnym narzędziem w badaniach farmakologicznych do badania wpływu leków na komórki w warunkach przepływu. Wizualizacja konfiguracji ma kluczowe znaczenie, ponieważ kilka kroków jest trudnych do opanowania przez samo odczytanie protokołu. Dam instrukcje krok po kroku, jak skonfigurować komorę przepływową i obwód przepływu powszechnie używane w laboratorium Dr.Ock Next: Aby zmontować obwód przepływu.

Zacznij od przymocowania 36-calowego odcinka twardej rurki do jednego końca tłumika impulsów do drugiego końca. Podłącz 18-calowy odcinek miękkiej rurki. Umieść adapter przynęty męskiej o średnicy jednej ósmej cala na końcu 18-calowej sekcji miękkiej rurki.

Podłącz męską przynętę do żeńskiego adaptera przynęty o średnicy jednej ósmej cala. Przymocuj żeńską przynętę do nowego 18-calowego segmentu miękkiej rurki. Wywierć trzy otwory w szklanej nasadce zlewki o pojemności 250 mililitrów.

Aby dopasować rurkę, włóż 1.5-calowy segment miękkiej rurki do jednego otworu. Jako odpowietrznik. Włóż wolne końce twardej i miękkiej rurki przez pozostałe dwa otwory w nakrętce do szklanej butelki o pojemności 250 mililitrów, która będzie działać jak zbiornik.

Upewnij się, że twarda rurka sięga dna zbiornika. Utrzymanie sterylności przez cały czas konfiguracji obwodu ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tej procedury. Dlatego wszystkie części muszą być wysterylizowane i przez cały czas należy nosić sterylne rękawiczki.

Oprócz zmontowanych części części te muszą zostać wysterylizowane. Jedna kompletna komora przepływowa, trzy na dwa cale segmenty miękkiej rurki, jeden męski i jeden żeński, jeden ósmy calowy adapter przynęty, cztery półcalowe z płaskim, 6 5 16 cali, osiem 30 sekund. Prowadnice calowe na cal, z płaskim, jedna para pęsety, jedno szkiełko i dwa ręczniki sterylizowane parą.

Autoklawowanie w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 60 minut. Umieść komorę przepływową obwodu przepływu cztery na cztery kierunkowe kurki odcinające jeden po drugim, kurek odcinający i wszystkie wysterylizowane części na tym sterylnym polu. Nosząc sterylne rękawice, połącz dwa czterokierunkowe kurki odcinające.

Umieść zaślepki na otwartych portach próbki. Odłącz męskie i żeńskie adaptery przynęty mocujące dwa segmenty miękkich rurek obwodu przepływu i włóż podłączone kurki odcinające. Podłącz miękką rurkę włożoną do zbiornika do 30-mililitrowej strzykawki i wyjmij tłok strzykawki.

Napełnij butelkę 125 mililitrami pożywki EPC. Podłącz miękką rurkę do kurka odcinającego. Umieścić sterylny filtr strzykawkowy w otworze wentylacyjnym.

Teraz przenieś obieg przepływu do nawilżonego inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla. Clamp twardą rurkę w głównej głowicy pompy rolkowej przeznaczonej do użytku z tego typu rurkami Palmera do węgla. Upewnij się, że rurka nie zachodzi na szyny montażowe pompy rolkowej.

Zaznacz rurkę w miejscu, w którym wychodzi z głowicy pompy po obu stronach, za pomocą pisaka do znakowania. Po upewnieniu się, że wszystkie kurki odcinające są zamknięte w kierunku portów próbki i otwarte wzdłuż obwodu przepływu, uruchom pompę. Sprawdź kierunek przepływu.

Ósemka PERFUSE powinna przemieszczać się ze szklanego zbiornika przez twardy przewód do tłumika impulsów. Do montażu komory przepływowej użyj sterylnych rękawiczek, aby podłączyć jeden dwucalowy segment miękkiej rurki do żeńskiego adaptera przynęty o średnicy jednej ósmej cala. Podłącz kolejny dwucalowy segment miękkiej rurki do adaptera przynęty męskiej o średnicy jednej ósmej.

Przymocuj dwucalową miękką rurkę z żeńskim adapterem przynęty do portu dopływowego, a dwucalową miękką rurkę z męskim adapterem przynęty do portu odpływowego. Przymocuj czterokierunkowe kurki odcinające do obu tych adapterów przynęty. Podłącz pozostałą dwucalową miękką rurkę do bocznego złącza portu wychodzącego z pułapki bąbelkowej i przymocuj jednokierunkowy kurek odcinający za pomocą sterylnej pęsety.

Wyjmij szkiełko z nasionami komórek z naczynia do hodowli komórkowej i umieść je we wgłębieniu w dolnej płycie komory przepływowej. Upewnij się, że szkiełko jest umieszczone stroną osadzoną w kucie skierowaną do góry za pomocą strzykawki lub pipety, umieść 10 mililitrów ciepłego podłoża EPC na szkiełku osadzonym w kuwe. Pozwól, aby medium zakryło szkiełko w komorze przepływowej, ale nie rozlewaj medium na O-ring na dolnej płycie.

Umieść górną płytę komory przepływowej na dolnej płycie, wyrównując otwory na. Utrzymuj dwie płytki równolegle, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza do płytek śrubowych komory. Razem. Za pomocą automatycznego śrubokręta zasilanego bateryjnie przewietrzyć pułapkę bąbelkową, otwierając jednokierunkowy kurek zatrzymujący przymocowany do portu pułapki bąbelkowej po stronie dopływu.

Użyj strzykawki o pojemności 10 mililitrów, aby delikatnie przepłukać rurkę dopływową medium EPC, a następnie zamknij ten kurek odcinający i zakryj go. Teraz przewietrzyć kanał komory, otwierając czterokierunkowy kurek odcinający portu odpływowego i delikatnie przepłukując medium EPC przez komorę przepływu. Ponownie za pomocą 10-mililitrowej nasadki strzykawkowej wszystkie czterokierunkowe połączenia kurka zatrzymującego i zamknij je.

Przenieść komorę przepływową do nawilżanego inkubatora ze zmontowanym obwodem przepływowym. Wstrzymaj pompę obwodu przepływu, zamknij obwód przepływu. Kurki odcinające w kierunku przepływu, aby zapobiec wyciekom.

Podłączyć komorę przepływową do obwodu przepływu Po podłączeniu komory przepływowej do obwodu przepływowego otworzyć kurki odcinające w kierunku przepływu. Wznów pompę przepływową i upewnij się, że PERFUSE eight przepływa we właściwym kierunku. Dostosuj natężenie przepływu do pożądanego naprężenia.

Podczas eksperymentu przepływowego komorę przepływową można wyjąć z obwodu w celu zobrazowania komórek za pomocą mikroskopii świetlnej lub fluorescencyjnej. W tym celu należy odłączyć komorę przepływową od obwodu przepływu na kurku odcinającym, aby zatrzymać połączenia kurka. Aby zebrać, należy przetworzyć osiem próbek do analizy.

Najpierw zatrzymaj pompę, zamknij kurek odcinający znajdujący się najbliżej tłumika impulsów. Zdejmij nasadkę ochronną, umieszczając ją do góry nogami, aby upewnić się, że nie jest zanieczyszczona. Włożyć małą strzykawkę do portu próbki.

Zamknąć kurek odcinający w kierunku komory przepływowej, pozostawiając port próbki i obwód w kierunku pulsacji dampener otwarte. Pobrać żądaną ilość próbki z obwodu, zamknąć kran w kierunku portu próbki przed wyjęciem strzykawki. Przechowuj obfitą ósemkę próbki w oznakowanej fiolce i zamrażaj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Ponownie zamknij port próbki i upewnij się, że wszystkie zawory odcinające są otwarte przed rozpoczęciem przepływu. Korzystając z tej metody, komórki progenitorowe śródbłonka pochodzące z ludzkiej krwi można w ciągu 15 minut wysiać na szkiełka tytanowe i przylegać pod wpływem fizjologicznych sił ścinających. Jak pokazano na tym rysunku, EPC rozprzestrzeniały się pod wpływem przepływu z około 210 mikronów kwadratowych bezpośrednio po wysiewie do około 657 mikronów kwadratowych po trzech godzinach i około 1 152 mikronów kwadratowych po 48 godzinach naprężenia ścinającego płynu wynoszącego 15 dines na centymetr kwadratowy.

Ten obraz z mikroskopu świetlnego ilustruje losową orientację ludzkich EPC. Po sześciogodzinnym statycznym okresie siedzenia po trzech godzinach przepływu przy 100 porcjach na centymetr kwadratowy, komórki rozprzestrzeniły się, ale pozostają w losowej orientacji. Po 48 godzinach naprężenia ścinającego płynu przy 100 dinach na centymetr kwadratowy, EPC są wyrównane i zorientowane w kierunku przepływu.

Tutaj EPC zostały oznaczone CTO, a jądra komórkowe wybarwione herxem, aby umarły po przepływie. Dla porównania, ten obraz pokazuje EPC świń na szkiełkach tytanowych w jednej linii z kierunkiem przepływu. Po 48 godzinach przepływu i 15 dinach na centymetr kwadratowy ekspozycji na naprężenia ścinające, granice komórek wybarwiono barwnikiem anty pcam, a jądra barwnikiem cytoksynowym kwasem nukleinowym.

Metoda ta pozwala również na uzyskanie próbek PERFUSE eight w określonych punktach czasowych w celu analizy i/lub kwantyfikacji wydzielanych metabolitów komórkowych. Pokazany tutaj jest przykład produkcji azotynów podczas 48-godzinnego eksperymentu przepływu z EPC świń. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować sterylność przez cały czas.

Ponadto ważne jest, aby podjąć niezbędne kroki w celu zmniejszenia liczby pęcherzyków powietrza w komorze przepływowej przed rozpoczęciem ciągłego przepływu, ponieważ mogą one oderwać komórki. Zalecamy również sprawdzenie każdego połączenia w komorze przepływowej i obwodzie przed obfitością, aby zapobiec wyciekowi PERFUSE eight podczas eksperymentu. Komora ta została zaprojektowana z wbudowanymi pierścieniami uszczelniającymi o przekroju okrągłym, które pozwalają na całkowite przeciwstawienie górnej i dolnej płyty oraz zapewniają szczelne uszczelnienie bez konieczności stosowania pomp próżniowych.

Ta cecha zapewnia również stałą wysokość komory między eksperymentami i eliminuje potrzebę stosowania gumowych uszczelek lub regulacji. Nasza komora przepływowa wykorzystuje znormalizowane szkiełka mikroskopowe. W związku z tym dostępna jest duża liczba komórek do dalszych eksperymentów.

Na przykład RNA i DNA z komórek po przepływie mogą być oceniane pod kątem syntezy białek lub ekspresji genów. Nasz projekt obwodu pozwala na pobranie ośmiu próbek perfuzyjnych do analizy i kwantyfikacji metabolitów komórkowych, takich jak azotyny, główny metabolit utleniający tlenku azotu, który jest wydzielany przez komórki pod wpływem naprężeń ścinających płyn. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zmontować naszą komorę przepływową i sterylny obwód przepływu, aby poddać komórki przylegające naprężeniom ścinającym płyn.