Test in vitro do badania migracji płytek krwi przy użyciu funkcjonalizowanych RGD tetherów awidyna-biotyna

Płytki krwi odgrywają kluczową rolę w zapobieganiu utracie krwi po urazie naczyń, zwalczaniu infekcji i utrzymaniu integralności naczyń krwionośnych podczas stanu zapalnego. Podczas gdy czopy hemostatyczne wymagają zbiorowej aktywacji i agregacji płytek krwi, ich rola w ochronie naczyń krwionośnych objętych stanem zapalnym jest wykonywana na poziomie pojedynczych komórek. W tym kontekście ostatnie badania wykazały, że płytki krwi mogą migrować autonomicznie, co zależy od mechanowykrywania ich adhezyjnego mikrośrodowiska.

Takie podejście pozwala na precyzyjną kontrolę właściwości adhezyjnych substratu i służy jako prosty test in vitro do badania mechanizmów leżących u podstaw migracji płytek krwi. Wyniki wskazują, że migrujące płytki krwi wiążące się z ligandami integrynowymi mogą wywierać siłę zdolną do przerwania wiązania awidyna-biotyna. Test ten zapewnia prostą i niezawodną metodę wizualizacji migracji płytek krwi.

W połączeniu z obrazowaniem żywych komórek pomoże nam to lepiej zrozumieć wzajemne oddziaływanie i regulację różnych składników cytoszkieletu w tej ważnej funkcji płytek krwi. Na początek sonikacja szklanej pokrywy polega na zanurzeniu 20% kwasu azotowego na jedną minutę, a następnie sonikacji w izopropanolu, etanolu i wodzie przez jedną minutę każde. Wstępnie oczyszczone szkiełka nakrywkowe należy traktować plazmą tlenową w urządzeniu do czyszczenia plazmowego przez dwie minuty, a następnie zmontować je za pomocą lepkich szkiełek.

Teraz napełnij kanał 2,5 mikrolitra PLL-PEG-biotyny rozcieńczonej w 97,5 mikrolitrach PLL-PEG i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyj trzykrotnie PBS. Następnie dodać 100 mikrolitrów neutrawidyny-FITC i inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć trzykrotnie PBS. Na koniec dodaj 100 mikrolitrów biotyny cyklo-RGD, inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej i przemyj trzykrotnie PBS.

Po znieczuleniu myszy i usunięciu skóry klatki piersiowej włóż igłę między drugie i trzecie żebro po lewej stronie mostka, aby pobrać krew z serca. Wymieszać krew z jednym mililitrem buforu Tyrode'a i odwirować przy 70 g przez 20 minut w temperaturze pokojowej przy wyłączonym hamulcu, a następnie pobrać górną część zawierającą osocze bogatopłytkowe. Wymieszać z trzema mililitrami buforu Tyrode'a i dodać 100 nanogramów na mililitr prostacykliny, aby zapobiec aktywacji płytek krwi.

Następnie odwirować przy 1200 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach buforu Tyrode. Następnie za pomocą hemocytometru zmierz liczbę płytek krwi.

Na początek weź płytki krwi myszy w kanałach powlekających cRGD biotyna-neutrawidyna-biotyna i zarejestruj żywą migrację płytek krwi za pomocą mikroskopu odwróconego wyposażonego w inkubator stopniowy. Aby policzyć liczbę adhezji płytek krwi lub migracji, kliknij prawym przyciskiem myszy menu rozwijane narzędzia punktowego na pasku narzędzi i wybierz narzędzie wielopunktowe. Wyodrębnić odległość migracji z utrwalonych próbek, mierząc długość drogi migracji odciśniętej w powłoce neutrawidyny-FITC.

Kliknij prawym przyciskiem myszy menu rozwijane narzędzia linii prostej na pasku narzędzi i wybierz narzędzie do swobodnego rysowania linii ręcznej. Aby określić ilościowo kształt płytek krwi, wybierz Obraz, Dostosuj i Próg na pasku narzędzi, aby wygenerować maski binarne poprzez segmentację fluorescencyjnych płytek krwi. Wybierz deskryptory kształtów w obszarze Analizuj i ustaw pomiary, a następnie wybierz opcję Wyświetl wyniki za pomocą opcji Analizuj i Analizuj cząstki.

Płytki krwi wykazywały optymalną migrację przy stężeniu 2,5% PLL-PEG-biotyny. Migracja była zmniejszona zarówno przy niższej, jak i wyższej gęstości ligandów. Płytki krwi rozprzestrzeniają się nieprawidłowo przy 1% gęstości liganda, co wskazuje na małą powierzchnię i obwód, co sugeruje niewystarczającą aktywację integryny.

Przy gęstości ligandów wynoszącej 2,5% płytki krwi skutecznie się rozprzestrzeniają, zakłócając ligandy cRGD i migrując. Wysoka gęstość ligandów powodowała rozprzestrzenianie się płytek krwi bez polaryzacji, zmniejszając migrację z powodu braku przerwania ligandów cRGD.